碱基切除修复基因在人鼻咽癌组织和鼻咽非癌组织中的表达及其意义

背景与目的:碱基切除修复基因对于维护基因组稳定性具有重要的作用,其表达异常与多种肿瘤相关。本实验研究7个重要的碱基切除修复基因(hOGG1,ADPRT,APE1,MBD4,POLB,XRCC1和LIG3)在鼻咽癌及鼻咽非癌组织中的表达及其意义。方法:用RT-PCR方法分析24例鼻咽癌组织和24例鼻咽非癌组织中hOGG1,ADPRT,APE1,MBD4,POLB,XRCC1和LIG3基因的表达。对有表达差异的基因hOGG1和ADPRT进一步用免疫组化的方法在99例鼻咽癌组织和28例鼻咽非癌组织中进行验证。结果:RT-PCR结果表明hOGG1,ADPRT,APE1,MBD4,POLB,XRCC1和LIG3基因在鼻咽癌和鼻咽非癌组织中均表达。其中,hOGG1和ADPRT在鼻咽癌组织中的mRNA水平显著低于鼻咽非癌组织(P<0.001)。免疫组化验证了两基因的蛋白水平在鼻咽癌组织中降低。在鼻咽癌组织和鼻咽非癌组织中,hOGG1基因高表达率分别50.5%和92.8%(P<0.001),而ADPRT基因分别是53.5%和96.4%(P<0.001)。但两基因的表达水平与鼻咽癌的临床分期和预后无关。结论:hOGG1和ADPRT基因的表达降低,可能与鼻咽癌的发生发展密切相关。

碱基切除修复系统基因多态性与维持性血液透析患者微炎症反应及脂代谢紊乱的相关性研究

目的:探讨碱基切除修复系统基因多态性与维持性血液透析(maintenance hemodialysis,MHD)患者氧化应激、微炎症反应及脂代谢紊乱之间的相关性。方法:选取本中心MHD患者64例,均接受维持性血液透析每周2～3次,每次3.5～4.0 h。透析期间根据患者情况给予降压药物治疗、纠正贫血等。检测两组hMYH基因多态性,包括hOGG1 c.977C>G、hMTH1 c.247G>A、hMYH c.972GG以及hMYH基因的AluYb8插入(AluYb8MYH)。同时留取外周血,行血常规、血生化检查及肿瘤不死因子(TNF)-α、白介素(IL)-1β、IL-6和IL-10测定。结果:MHD患者存在hMYH基因多态性,AluYb8MYH A/P型较A/A型IL-6水平升高,差异有统计学意义(P <0.05),P/P型较A/A型IL-6水平升高,差异有统计学意义(P <0.01)。同时,hOGG1 c.977GG型患者血红蛋白水平高于hOGG1 c.977CC型患者,差异有统计学意义(P <0.05),hOGG1 c.977CG及hOGG1 c.977GG两型患者与hOGG1 c.977CC型患者相比,差异有统计学意义(P <0.01),hMYH c.972CG型患者甘油三酯水平低于hMYH c.972CC型患者,差异有统计学意义(P <0.05)。结论:MHD患者存在碱基切除修复系统的基因多态性,其发生与患者的DNA氧化损伤有关,不同基因型细胞因子水平存在明显差异,提示其与MHD患者微炎症反应存在相关性,同时hMYH基因多态性与患者脂质代谢紊乱以及贫血等并发症有关,可能导致远期并发症的高发生率。

胃癌组织来源的突变型DNA聚合酶β的碱基切除修复功能

目的研究胃癌组织中野生型和突变型DNA聚合酶β在DNA修复过程中的作用,为进一步探讨肿瘤的病因发病学奠定基础。方法采用聚合酶链反应(PCR)和分子克隆技术,以野生型和突变型DNA聚合酶β基因为模板,扩增后构建pGEM-T-polβ克隆载体,经PCR筛选,亚克隆于pET28a(+)表达载体中,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细菌,经诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达后,通过镍柱亲和层析法纯化蛋白。设计3条单链DNA引物,退火合成含有单碱基缺失的DNA底物,与纯化蛋白共做碱基切除修复(BER)实验,最后琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果成功构建了pET28a(+-)polβ重组表达载体;在BER实验中,野生型DNA聚合酶β能够在DNA底物的酶切位点处将其切开,突变型DNA聚合酶β不能或部分将其切开。结论野生型DNA聚合酶β能够修复单碱基缺失的DNA底物,而突变型DNA聚合酶β在碱基缺失修复过程中的作用丧失或减弱。

诱导分化的人食管癌细胞DNA聚合酶β和碱基切除修复功能的改变

目的:了解诱导分化的食管癌细胞中DNA聚合酶β和碱基切除修复功能的变化。方法:采用全反式维甲酸(ATRA)和二甲亚砜(DMSO)诱导人食管癌Eca109细胞分化,应用原位杂交、碱基切除修复功能(BER)测定方法分别检测细胞polβ基因的表达和BER功能的变化。结果:ATRA、DMSO作用5d后可以诱导Eca109细胞分化。随着Eca109细胞的分化,polβ基因的表达降低,BER恢复。结论:ATRA、DMSO可下调Eca109细胞polβ基因的表达,恢复BER活性使其趋向正常细胞分化。

碱基切除修复因子SmuG1与肿瘤的研究进展

肿瘤是严重威胁人类健康的疾病之一。随着研究的不断深入,人们发现DNA损伤在肿瘤发生发展中的作用不可忽视。DNA损伤发生后,机体识别损伤类型并启动相应的修复机制以维持机体的正常状态,其中DNA糖基化酶SmuG1作为碱基切除修复途径的关键启动蛋白,在保持真核生物的基因稳定性和遗传完整性中发挥重要作用。近年研究发现SmuG1在肿瘤组织中的异常表达,与肿瘤的病理类型、肿瘤细胞的侵袭转移以及患者生存率、药物耐药性均相关。SmuG1有望成为新的肿瘤标志物和潜在治疗靶点。

参与碱基切除修复的AP内切酶1的克隆和蛋白质纯化

碱基切除修复途径是去除氧化和甲基化碱基的最主要途径。在碱基切除修复过程中,多个蛋白质,诸如DNA糖基酶、APE1内切酶、DNA聚合酶beta和DNA连接酶在体内的精密调节下高度协调地作用,从而切除受损碱基,使DNA恢复正常序列。碱基切除修复对维持基因组的稳定及抑制肿瘤发生等生理过程有重要作用。为了进一步从分子水平阐明APE1的作用机制,我们从HeLa细胞的cDNA文库中克隆得到APE1基因,使APE1在大肠杆菌中得到表达,并用蛋白质纯化的快速液相层析法经过一系列层析柱纯化了重组APE1蛋白质,APE1的生物化学功能研究正在进行中。

PCR-CTPP在DNA碱基切除修复基因SNP分型中的应用

目的分析两对引物-聚合酶链式反应(PCR-CTPP)在碱基切除修复(BER)途径基因单核苷酸多态性(SNP)分型中的应用,为发现新的SNP检测方法提供实验依据。方法采用PCR-CTPP扩增BER途径关键蛋白OGG1、XRCC1及APE1 4个常见SNP位点OGG1Ser326Cys、XRCC1Arg399Gln、APE1Asp148Glu及-141T/G(位于启动子区域)的DNA片段,凝胶电泳显像后判读基因型,同时与DNA测序的方式比对各基因位点的准确性。结果 PCR-CTPP方法基因分型结果与DNA测序得到的基因分型结果完全一致。结论 PCR-CTPP技术可靠、快速,其广泛应用能够有助于基因SNP的分型研究。

碱基切除修复基因OGG1对紫外线诱导晶状体上皮细胞损伤的保护作用

目的探讨碱基切除修复基因8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(OGG1)对紫外线(UVB)诱导晶状体上皮细胞损伤(LEC)的保护作用。方法通过UVB照射人LEC(SRA01/04细胞株)诱导细胞氧化损伤模型,利用siRNA敲降技术针对靶基因OGG1设计3个siRNA(分别为siOGG1#1、siOGG1#2和siOGG1#3)。同时,为了验证出敲降效率最高的siOGG1,依据转染情况将细胞分为siOGG1#1组、siOGG1#2组、siOGG1#3组、siNC组和空白对照组(不转染)。后续为了验证OGG1的表达下调对氧化损伤环境下细胞的作用,将细胞分为空白对照组、UVB组、UVB+siNC组和UVB+siOGG1#2组,观察各组细胞凋亡相关蛋白的表达变化。采用实时荧光定量-PCR检测各组细胞目的基因mRNA的表达,免疫印迹实验检测各组细胞相关蛋白的表达。免疫荧光法检测UVB+siNC组和UVB+siOGG1#2组中受损DNA的标记物15A3的荧光强度变化。采用免疫荧光法检测细胞DNA氧化损伤情况,CCK8实验检测细胞活力。结果实时荧光定量-PCR检测结果显示UVB照射时间为10 min时,OGG1的相对表达量最高;免疫印迹实验检测结果显示随着UVB照射时间的延长,细胞内OGG1蛋白相对表达量呈时间依赖性下降。因此,细胞氧化损伤模型采用UVB照射10 min处理细胞。实时荧光定量-PCR检测结果显示与siNC组相比,靶向设计的转染siOGG1组的三个亚组中细胞OGG1 mRNA相对表达量均显著降低(均为P<0.001),siOGG1#2组降低最为明显。免疫荧光染色结果显示与UVB+siNC组相比,UVB+siOGG1#2组15A3(染色反应底物是8-oxoG,它是OGG1的修复作用靶点)染色阳性细胞明显增多。CCK8实验结果显示与UVB+siNC组和空白对照组相比,UVB+siOGG1#2组细胞活力均明显降低,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。免疫印迹实验检测结果显示与UVB+siNC组相比,转染后UVB+siOGG1#2组细胞促进凋亡的蛋白BAX表达明显增加,而抑制凋亡的蛋白BCL-2表达则明显下降(均为P<0.001)。结论OGG1基因在UVB诱导的LEC氧化损伤模型中通过BER通路参与受损DNA的修复过程,调控LEC内受损DNA的修复和细胞凋亡过程。

系统性红斑狼疮患者CD4^(+)T细胞碱基切除修复蛋白水平

目的:系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus,SLE)是一种多系统疾病,其发病机制尚不清楚。DNA去甲基化参与SLE的发病机制,生长停滞和DNA损伤诱导型45α(Gadd45a)参与DNA的去甲基化过程。Gadd45a是一种DNA修复相关蛋白,因此,本研究旨在分析参与碱基切除修复(base excision repair,BER)过程的一些蛋白质,包括活化诱导胞嘧啶脱氨基化酶(activation-induced cytidine deaminase,AID)、胸腺嘧啶DNA糖基化酶(thymine DNA glycosylase,TDG)和甲基CpG结合蛋白4(methyl-CpG-binding domain protein 4,MBD4)在SLE患者CD4^(+)T细胞中的表达,并分析这些BER蛋白与SLE活动之间的相关性。方法:2019年1月至2020年9月中南大学湘雅二医院收集12例SLE患者和12例健康体检者(对照组)。采用Ficoll-Hypaque密度梯度离心法分离外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs),CD4免疫磁珠分离外周血CD4^(+)T细胞。通过实时反转录聚合酶链反应(real-time RTPCR)和蛋白质印迹法检测AID、TDG和MBD4信使RNA(mRNA)和蛋白质的表达水平。结果:与对照组相比,SLE患者CD4^(+)T细胞中AID mRNA和蛋白质表达升高(P=0.003,P=0.022)。SLE患者的CD4^(+)T细胞中TDG蛋白表达升高(P=0.017),MBD4蛋白质表达降低(P<0.001)。两组之间TDG和MBD4 mRNA表达水平没有明显差异(均P>0.05)。AID mRNA和蛋白水平及TDG蛋白水平与系统性红斑狼疮疾病活动度(SLE disease activity index,SLEDAI)呈正相关,MBD4 mRNA和蛋白水平与SLEDAI呈负相关。结论:SLE患者CD4^(+)T细胞中AID和TDG表达增加,MBD4表达降低,它们可能参与了SLE的发病机制。

经碱基切除修复的氧化性DNA损伤与肝癌的发生

在生物体内如果过氧化物的产生和消除存在不平衡均会导致氧化应激的发生．很多病理生理状况跟氧化应激有密切的关系。氧化应激产生的活性氧．可诱发DNA碱基发生化学修饰，在嘌呤残基的C-8位置和DNA整合，形成8-羟基二羟鸟嘌呤并进-步氧化形成8-羟基鸟嘌呤（8-OHdG）。8-OHdG是一种主要的DNA氧化损伤产物，经碱基切除修复通路来完成修复，若不及时修复，则参与癌变的发生。

华跃进教授团队揭示耐辐射奇球菌RecJ蛋白参与碱基切除修复途径的分子机制

浙江大学生命科学学院生物物理研究所华跃进教授团队证实了耐辐射奇球菌RecJ(Deinococcus radiodurans RecJ,drRecJ)蛋白参与碱基切除修复途径的分子机制。相关研究成果论文“Participation of RecJ in the base excision repair pathway of Deinococcus radiodurans”(https://doi.org/10.1093/nar/gkaa714)发表在国际知名期刊《核酸研究》(Nucleic Acids Research)上。该研究围绕drRecJ蛋白如何参与碱基切除修复途径的问题展开,发现了5′—3′单链DNA核酸外切酶RecJ,同时,它也是一种非典型的无碱基位点裂解酶。

催化发夹组装用于碱基切除修复酶活性检测研究

碱基切除修复酶在DNA损伤修复过程中具有重要作用,且其检测与癌症等疾病的诊断相关。传统的碱基切除修复酶检测方法操作复杂、灵敏度低,且仅对酶的浓度进行定量分析而非酶的活性。为此,建立了基于催化发夹组装介导信号放大用于核酸内切酶IV(Endo IV)活性的检测方法。该方法利用Endo IV的活性作用于底物探针,将引发序列释放而引发催化发夹自组装信号放大,以实现Endo IV的活性检测分析。通过荧光检测实验可知,该方法检测下限为3.7×10-7 U/mL,可选择性地对Endo IV的活性进行检测,是一种设计简单、操作简便、灵敏度高的碱基切除修复酶活性检测方法。

基于BER通路探讨益肾通络方对苯并(a)芘致精子DNA损伤的修复机制

目的:探讨益肾通络方对BaP染毒雄性大鼠精子DNA损伤的影响及其修复机制。方法:利用BaP染毒建立精子DNA损伤的雄性大鼠模型。分组设置为正常组、模型组和益肾通络方组。采取荧光流式细胞检测精子DNA碎片指数;Western Blottting及RT-PCR检测BER通路APE1、FEN1、XRCC1(和磷酸化的)蛋白及mRNA表达水平。结果:与模型组相比,益肾通络方组在干预后,雄性大鼠精子DNA碎片指数明显下降(P<0.05);APE1、FEN1、XRCC1(和磷酸化的)蛋白及mRNA表达明显增高(P<0.05)。结论:益肾通络方能够降低雄性大鼠精子DNA碎片指数,其机制可能是通过上调APE1、FEN1、XRCC1(和磷酸化的)蛋白的表达水平,提高精子DNA碱基切除修复能力。

基于GEO数据库进行人类皮肤芯片核苷酸切除修复基因XPA表达的差异性

目的从系统水平平行分析碱基切除修复相关途径中的重要基因XPA在众多人类皮肤疾病中的差异表达情况.方法通过生物信息学的方法,利用ScanGEO工具对GEO数据库中59个皮肤或皮肤疾病样品相关的基因芯片数据从核苷酸切除修复途径进行平行比对,对XPA表达具有统计学意义的样本进行筛选和差异分析.结果在皮肤恶性黑色素瘤、表皮损伤模型、DNA损伤和紫外线辐射、包皮成纤维细胞对弓形体RH 1型(ROP5)突变体感染的反应、白细胞介素-20亚族细胞因子对表皮角化细胞的影响、Egr-1对皮肤成纤维细胞体外过度表达的影响:时间过程、炎性树突状细胞的体外模型7个芯片样本中XPA的表达存在差异(P<0.05),一般呈现下调表达.结论基于GEO数据库和ScanGEO工具能够高效进行高通量共享数据的筛选和分析.

DNA损伤修复机制——解读2015年诺贝尔化学奖

Tomas Lindahl,Paul Modrich和Aziz Sancar三位科学家因发现"DNA损伤修复机制"获得了2015年诺贝尔化学奖.Lindahl首次发现Escherichia Coli中参与碱基切除修复的第一个蛋白质——尿嘧啶-DNA糖基化酶(UNG);Modrich重建了错配修复的体外系统,从大肠杆菌到哺乳动物深入探究了错配修复的机制;Sancar利用纯化的Uvr A、Uvr B、Uvr C重建了核苷酸切除修复的关键步骤,阐述了核苷酸切除修复的分子机制.DNA损伤是由生物所处体外环境和体内因素共同导致的,面对不同种类的损伤,机体启动多种不同的修复机制修复损伤,保护基因组稳定性.这些修复机制包括:光修复(light repairing);核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER);碱基切除修复(base excision repair,BER);错配修复(mismatch repair,MMR);以及DNA双链断裂修复(DNA double strand breaks repair,DSBR).其中DNA双链断裂修复又分同源重组(homologous recombination,HR)和非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)两种方式.本文将对上述几种修复的机制进行总结与讨论.

BER通路中XRCC1多位点单核苷酸多态性与新疆不同民族喉癌易感性相关性研究

背景与目的:影响肿瘤遗传易感性的修复基因主要存在修复通路碱基切除修复(base excision repair,BER)途径,而X射线交错互补修复基因1(X-ray repair cross complementing group 1,XRCC1)是BER通路中的核心基因。近几年,国内外开展了许多有关基因多态性和喉癌易感性的研究。探讨BER通路DNA修复基因XRCC1多位点单核甘酸多态性与新疆不同民族喉癌易感性关系。方法:采用患者组与对照组的研究方法,选择58例喉癌(经病理证实为鳞状细胞癌)患者和120名体检正常的健康人对照,应用Multiplex SNa Pshot技术检测DNA碱基切除修复基因XRCC1的Gln632Gln(rs3547)、Arg399Gln(rs25487)、Arg280His(rs25489)、Arg194Trp(rs1799782)位点单核苷酸多态在患者组和正常对照组中的分布情况。结果:喉癌患者组中XRCC1Arg280His(rs25489)C/T(杂合型)及T/T(突变型)基因型的比例与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。喉癌患者组中XRCC1的其余3个位点Gln632Gln(rs3547)C/T(杂合型)及T/T(突变型)基因型、Arg399Gln(rs25487)C/T(杂合型)及T/T(突变型)基因型、Arg194Trp(rs1799782)G/A(杂合型)及A/A(突变型)基因型的比例明显高于对照组(P<0.01)。其中汉、维、哈3个民族患者组Gln632Gln(rs3547)C/T(杂合型)及T/T(突变型)基因型、Arg399Gln(rs25487)C/T(杂合型)及T/T(突变型)基因型、Arg194Trp(rs1799782)G/A(杂合型)及A/A(突变型)基因型比例显著高于对照组(P<0.05),携带(rs3547)C/T及T/T基因型、(rs25487)C/T及T/T基因型、(rs1799782)G/A及A/A基因型个体较携带XRCC1(rs3547)C/C基因型、(rs25487)C/C基因型、(rs1799782)G/G基因型的个体患喉鳞状细胞癌的风险升高了分别为0.96倍、1.74倍、1.39倍;1.47倍、1.32倍、0.77倍,1.49倍、1.51倍、1.56倍。结论:汉、维、哈3个民族的XRCC1 Gln632Gln、Arg399Gln、Arg280His、Arg194Trp位点的单核苷酸多态性可能与喉癌遗传性有关联且有差异,XRCC1基因中的Gln632Gln、Arg399Gln、Arg194Trp位点的突变将导致喉癌的发病风险升高。而XRCC1基因中的Arg280His位点突变与喉癌发病的差异无统计学意义,可能该位点的突变与喉癌发病无关。

DNA损伤修复通路基因多态性与铂类药物治疗非小细胞肺癌敏感性及预后关系的研究进展

铂类药物是肺癌治疗中应用最广泛的首选化疗药物之一,其通过损伤DNA而诱导肿瘤细胞凋亡。DNA损伤修复功能的变化是引发肿瘤患者对铂类药物耐药的重要分子学基础,DNA损伤修复通路相关基因的单核苷酸多态性(SNPs)与DNA修复能力的改变有关联,核苷酸切除修复通路(NER通路)及碱基切除修复通路(BER通路)相关基因的SNPs对修复铂类药物引起的DNA损伤起重要作用。本文作者对近几年关于NER通路及BER通路相关基因的多态性与晚期非小细胞肺癌(NSCLC)患者应用铂类药物为基础的化疗方案治疗的敏感性及预后之间关系进行综述。

DNA聚合酶β在食管癌组织中的修复功能

目的:观察突变型DNA聚合酶β(DNA polymerase β,polβ)的碱基切除修复(base excision repair,BER)功能的改变.方法:将polβ真核表达载体pcDNA4-C-polβ1,pcDNA4-C-polβ2以脂质体介导方式转染polβ基因敲除的EC9706细胞,G418筛选得到稳定转染pcDNA4-C-polβ1,pcDNA4-C-polβ2的细胞克隆;通过镍柱亲和层析法纯化蛋白;退火合成含有单碱基缺失的DNA底物,与纯化的野生型和突变型polβ蛋白进行BER修复实验.结果:G418筛选得到稳定转染pcDNA4-C-polβ1,pcDNA4-C-polβ2的EC9706细胞;提取并纯化出polβ1、polβ2蛋白与退火合成单碱基缺口的DNA底物进行BER实验.在BER实验中,野生型polβ能够在DNA底物的酶切位点处将其完全切开,而突变型polβ仅将其部分切开.结论:野生型的polβ能够修复单碱基缺失的DNA底物,而突变型的polβ碱基切除修复功能明显减弱.

DNA修复基因与肺癌关系的研究进展

肺癌是对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤之一。肺癌发生是个体对环境危险因素的易感性与环境致癌因素互相作用的结果,越来越多的研究表明DNA修复基因与肺癌关系密切。本文从核苷酸切除修复、碱基切除修复、DNA双链断裂修复、错配修复等方面对DNA修复基因与肺癌关系的研究进展做一综述。