碱基切除修复基因OGG1对紫外线诱导晶状体上皮细胞损伤的保护作用

目的探讨碱基切除修复基因8-羟基鸟嘌呤DNA糖苷酶1(OGG1)对紫外线(UVB)诱导晶状体上皮细胞损伤(LEC)的保护作用。方法通过UVB照射人LEC(SRA01/04细胞株)诱导细胞氧化损伤模型,利用siRNA敲降技术针对靶基因OGG1设计3个siRNA(分别为siOGG1#1、siOGG1#2和siOGG1#3)。同时,为了验证出敲降效率最高的siOGG1,依据转染情况将细胞分为siOGG1#1组、siOGG1#2组、siOGG1#3组、siNC组和空白对照组(不转染)。后续为了验证OGG1的表达下调对氧化损伤环境下细胞的作用,将细胞分为空白对照组、UVB组、UVB+siNC组和UVB+siOGG1#2组,观察各组细胞凋亡相关蛋白的表达变化。采用实时荧光定量-PCR检测各组细胞目的基因mRNA的表达,免疫印迹实验检测各组细胞相关蛋白的表达。免疫荧光法检测UVB+siNC组和UVB+siOGG1#2组中受损DNA的标记物15A3的荧光强度变化。采用免疫荧光法检测细胞DNA氧化损伤情况,CCK8实验检测细胞活力。结果实时荧光定量-PCR检测结果显示UVB照射时间为10 min时,OGG1的相对表达量最高;免疫印迹实验检测结果显示随着UVB照射时间的延长,细胞内OGG1蛋白相对表达量呈时间依赖性下降。因此,细胞氧化损伤模型采用UVB照射10 min处理细胞。实时荧光定量-PCR检测结果显示与siNC组相比,靶向设计的转染siOGG1组的三个亚组中细胞OGG1 mRNA相对表达量均显著降低(均为P<0.001),siOGG1#2组降低最为明显。免疫荧光染色结果显示与UVB+siNC组相比,UVB+siOGG1#2组15A3(染色反应底物是8-oxoG,它是OGG1的修复作用靶点)染色阳性细胞明显增多。CCK8实验结果显示与UVB+siNC组和空白对照组相比,UVB+siOGG1#2组细胞活力均明显降低,差异均有统计学意义(均为P<0.01)。免疫印迹实验检测结果显示与UVB+siNC组相比,转染后UVB+siOGG1#2组细胞促进凋亡的蛋白BAX表达明显增加,而抑制凋亡的蛋白BCL-2表达则明显下降(均为P<0.001)。结论OGG1基因在UVB诱导的LEC氧化损伤模型中通过BER通路参与受损DNA的修复过程,调控LEC内受损DNA的修复和细胞凋亡过程。

H4K20me1与碱基切除修复相关基因在燃煤污染型砷中毒致DNA损伤修复中的作用

目的了解燃煤污染型地方性砷中毒患者组蛋白H4第20位赖氨酸-甲基化（H4K20me1）修饰水平与碱基切除修复基因mRNA的转录水平，并分析其与DNA损伤的关系，为深入揭示砷致DNA损伤修复机制提供科学依据。方法收集贵州省兴仁县交乐村2014年自愿手术治疗的47例燃煤污染型砷中毒患者（-般病变组15例、癌前病变组14例、癌变组18例）及12例对照组的皮肤组织标本、头发样本和外周血样。电感耦合等离子质谱（ICP．MS）法测定发砷含量；免疫组化法检测皮肤组织中组蛋白H4K20me1修饰水平；实时荧光定量PCR检测外周血聚腺苷酸二磷酸核糖聚合酶-1（PARP1）、N-甲基化嘌呤-DNA．糖基化酶（MPG）、X射线修复交叉互补基因1（XRCC1）基因mRNA转录水平；单细胞凝胶电泳法检测外周血DNA损伤；酶联免疫吸附试验法检测外周血H4K20me1总体修饰水平。结果与对照组[中位数（第25～75百分位数）：0．15（0．07。0．23）μg／L]比较，砷中毒患者发砷含量[0．34（0．17-0．51）μg／L]明显升高（Z=6．037，P〈0．05）；与对照组（0．32±0．13、0．17±0．12）比较，癌变组患者外周血H4K20me1修饰水平（O．62±0．11）、癌前病变组和癌变组患者皮肤组织中H4K20me1修饰水平（0．54±0．20、0．83±0．10）明显增加（P〈0．05）；与对照组[0．95（0．50～1.49）、1．12（0．98-1．48）、0．96（0．67～1．17）]比较，癌变组PARP1、MPG基因mRNA表达[0．37（0．30～0．4J4）、0.38（O．15～0．48）]、癌前病变组和癌变组XRCC1基因mRNA表达[0．48（0_38～0．89）、0．32（0．20～0．55）]明显降低（P〈0．05）；与对照组（1．19±0．55、1．27±0．51）比较，-般病变组（6．49±0．98、6．60±1．11）、癌前病变组（11．22±1．40、10．07±1.11）和癌变组（20．38±1．72、27．01±1．78）彗星尾部DNA百分含量（Tai1DNA％）和彗星尾矩（OTM）明显升高（JP〈0．05）；砷中毒患者皮肤组织H4K20me1修饰水平、外周血H4K20me1修饰水平、DNA损伤水平（Tai1DNA％、OTM）与其皮肤病变程度呈正相关关系（r=0．885、0．855、0．806、0．883。P均〈0．05）；外周血中H4K20me1修饰水平与DNA损伤水平（Tai1DNA％、OTM）、皮肤H4K20me1修饰水平均呈正相关关系（r=0．535、0．804、0．754，P均〈0．05），与MPG、XRCC1、PARP1基因mRNA表达水平呈负相关关系（r=-0．563、-0．514、-0．550，P均〈0．05）；皮肤H4K20me1修饰水平与DNA损伤水平（Tai1DNA％、OTM）呈正相关关系（r=0．602、0．875，P均〈0．05），与MPG、XRCC1、PARP1基因mRNA表达水平呈负相关关系（r=-0．492、-0．502、-0．552，P均〈0．05）。结论燃煤污染型砷中毒可能通过影响H4K20me1修饰水平，抑制碱基切除PARP1、MPG、XRCC1基因mRNA的转录表达，致DNA损伤加重，参与砷中毒皮肤病变的发生发展。