碱基插入产生HLA无效等位基因的序列分析及确认

目的:确认1例碱基插入产生无效等位基因HLA-C*08:127N的序列。方法:应用PCR-SSOP及PCR-SBT进行HLA常规检测,发现1例急性髓系白血病患者HLA-C的序列图谱均存在异常。应用二代测序技术对该位点序列进行确认。结果:HLA-C位点SSOP分型结果为C*03:04,C*08:01;SBT结果分析时发现序列在第3外显子疑似插入或缺失,二代测序确认结果为C*03:04,C*08:127N。结论:碱基插入产生HLA无效等位基因,SBT分析软件无法给出正确的结果,而二代测序技术可以更直观得到准确的HLA分型结果。

不同产地甘草中核苷和碱基类成分分析与评价

为揭示不同产地甘草物质基础不同,本研究采用UPLC-TQ/MS测定153批不同产地甘草样品中12种核苷、碱基类成分含量,并利用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)进行不同产地质量特征分析。研究结果显示,不同产地总核苷、碱基类成分含量宁夏>甘肃>内蒙古>新疆,产地之间存在显著差异(P<0.05)。甘草核苷类成分以胞苷和鸟苷含量较高,二者占总核苷和碱基含量的26.2%~47.8%;碱基类成分以腺嘌呤和鸟嘌呤较高,二者占总核苷和碱基含量的19.3%~38.7%。基于测定的12种核苷、碱基类成分,PLS-DA判别分析可以将不同产地的甘草分为两组,一组为宁夏和内蒙古产甘草,另外一组为甘肃和新疆产甘草,主要差异成分为鸟嘌呤、腺嘌呤、尿苷、胞苷和鸟苷。进一步采用PLS-DA分别分析两个组内不同产地的甘草质量特征显示,甘肃和新疆产甘草可以明确区分,宁夏和内蒙古产甘草不能准确区分。以上研究结果表明,不同产地甘草中核苷、碱基类成分存在差异,进而影响其质量特征。基于核苷、碱基类成分分析,宁夏和内蒙古产甘草质量一致度较高。本研究为揭示不同产地甘草质量存在差异提供了理论支持,为其合理开发利用奠定了基础。

不同产地太白贝母中11种核苷与碱基类成分分析及产地差异研究

目的对10批采自重庆、云南、陕西等5个省(市)的太白贝母样品中11种核苷和碱基类成分的含量进行测定,采用化学计量学分析法比较太白贝母中的核苷和碱基类成分的含量差异,对其质量进行综合评价,为规范化种植和产地优选提供参考。方法水超声提取太白贝母中的核苷和碱基类成分,采用高效液相色谱-二极管阵列检测器(HPLC-DAD)法测定样品中各成分含量,并采用主成分分析(Principal component analysis,PCA)、层次聚类分析(Hierarchical cluster analysis,HCA)对产地进行划分,偏最小二乘判别分析(Partial least squares discriminant analysis,PLS-DA)确定太白贝母中差异性的指标成分,比较指标性成分在不同产地样品间的含量差异。结果11种核苷和碱基类成分在不同产地太白贝母中存在显著差异;主成分分析和层次聚类分析可将样品聚为4类;PLS-DA鉴定出5个指标性成分,分别为尿嘧啶、胞嘧啶、尿苷、肌苷、腺苷,以重庆、湖北产地样品所含核苷和碱基成分相对较高,质量相对较优。结论该方法操作简单、重复性好、准确可靠,筛选出了鉴定不同产地太白贝母中的特征性核苷和碱基类成分,可用于初步阐明不同产地样品的差异性,并能够较好地反映太白贝母的品质,为太白贝母药材采购产地选择和质量控制提供参考。

新型基因组编辑技术碱基编辑器研究进展

碱基编辑是一种新型的基因组编辑技术,它结合CRISPR/Cas系统的定位切割功能与碱基脱氨酶的编辑功能,可在不产生双链DNA断裂、不需要外源修复模板的情况下对基因组位点实现高效精准的碱基编辑,且能够实现多位点编辑,极大丰富现有的基因组编辑技术。根据融合不同的脱氨酶,碱基编辑器主要分为腺嘌呤碱基编辑器、胞嘧啶碱基编辑器、Prime编辑器、糖基化酶碱基编辑器和双功能碱基编辑器。该文综述不同类型碱基编辑器的基本原理、开发过程和适用范围,评估它们的技术优势和局限性,并结合最新研究展望未来的发展方向,以期为食品微生物、食源性致病菌和发酵食品等食品科学基础和应用研究提供有力工具。

利用胞嘧啶碱基编辑器高效制备奶牛BLG基因敲除胚胎的研究

[目的]β-乳球蛋白是由BLG基因编码的蛋白质,是牛乳中主要的过敏原。本试验旨在使用优化后的单碱基编辑器(CBE)YE1-BE3-FNLS和YE1-AncBE4max对牛胚胎BLG基因进行单碱基编辑,同时对2种单碱基编辑器在牛胚胎BLG基因敲除效果进行评价。[方法]在奶牛的BLG基因的第一外显子上设计sgRNA序列,通过胞嘧啶碱基编辑器将BLG基因第21位密码子CAG突变为TAG,实现c^(*).61 C>T(p.Q21^(*))的转变,获得终止密码子,使蛋白质翻译提前终止,达到基因敲除的目的。通过体外转录获得sgRNA以及YE1-BE3-FNLS和YE1-AncBE4max的mRNA,显微注射到奶牛胚胎中,收集囊胚,分别检测20枚YE1-BE3-FNLS编辑囊胚和24枚YE1-AncBE4max编辑囊胚,进行胚胎基因组PCR扩增,扩增BLG基因目标序列并进行测序验证编辑效率。根据sgRNA的序列,全基因组选择错配碱基最少的5个潜在脱靶位点进行脱靶检测。[结果]囊胚靶向编辑效率检测结果表明,YE1-AncBE4max对牛胚胎BLG基因的靶向编辑效率为83.3%(20/24)高于YE1-BE3-FNLS的靶向编辑效率60%(12/20),而前者存在较大的编辑窗口(C1-C9),可对sgRNA序列上的多个胞嘧啶进行编辑,后者具有较小的编辑窗口C2-C4;另外,YE1-BE3-FNLS具有较高的靶位点双链编辑效率35%(7/20),而YE1-AncBE4max只有2枚编辑胚胎发生双链编辑,纯合编辑率较低;2种单碱基编辑器制备的编辑胚胎均未出现插入缺失和脱靶效应。[结论]本文使用的2种胞嘧啶碱基编辑器均能高效制备奶牛BLG基因编辑胚胎,为进一步获得BLG基因单碱基敲除奶牛储备技术方法。

葡萄碱基-抗坏血酸转运蛋白(NAT)家族基因的鉴定和表达分析

基于最新葡萄基因组数据库,在全基因组范围鉴定葡萄碱基-抗坏血酸转运蛋白(nucleobase-ascorbate transporters,NAT)基因家族成员,并对其进行生物信息学和表达模式分析,为后续深入其功能奠定基础。以Xan_ur_permease结构域(PF00860)保守序列为种子序列筛选NAT基因,分别利用Prot Prama、Clustalx、MEGA 7.0、PlantCare、GSDS 2.0和MEME进行理化性质、多序列比对、进化特征、顺式作用元件、基因结构和蛋白结构分析,并利用公共数据库基因表达数据和qRT-PCR分别分析其在各组织和响应胁迫信号中的表达模式。结果表明,葡萄基因组存在13个NAT家族成员,分别命名为VvNAT1~VvNAT13,氨基酸数目、分子质量和等电点分别为304~755、33.01~81.49 ku和8.15~9.6。进化分析将来自葡萄、苹果、拟南芥、水稻和菠萝的NAT蛋白分为4个亚组。结构分析表明,VvNAT基因外显子数目为1~14,其对应蛋白序列中均含有[(Q/E/P)NXGXXXXT(R/K/G)]和(QH)两个保守基序。此外,VvNAT基因启动子区域存在响应多种激素和逆境信号的元件。共线性分析表明,葡萄种内存在3个NAT共线性基因对,葡萄和拟南芥种间存在12个NAT共线性基因对。基因表达分析表明,VvNAT1、VvNAT3、VvNAT8、VvNAT11和VvNAT12在葡萄不同组织各发育时期均具有较高的表达量;200 mmol/L NaCl盐胁迫和4℃低温处理后,多个成员差异表达,其中VvNAT8在茎和根中都显著上调表达。综上所述,葡萄多个NAT基因参与了组织发育和对盐和低温逆境胁迫的响应,而VvNAT8可能参与组织发育及植株对低温和盐胁迫的响应,可作为后续功能分析的候选基因。

乳酸乳球菌荧光单碱基突变报告系统的建立

乳酸乳球菌是乳品工业中重要的发酵剂,被广泛应用于奶酪和发酵乳的生产过程中。文章通过向乳酸乳球菌NZ9000中插入增强型绿色荧光蛋白(eGFP)终止标记,开发出荧光单碱基突变报告系统。研究基于实验室已有的乳酸乳球菌CRISPR/Cas9基因编辑质粒pYSH,构建含突变eGFP基因(将第550位的有义密码子CAG突变为终止密码子TAG,记作eGFP-C550T)的基因编辑质粒pYSH-C550T,并将eGFP-C550T电转入NZ9000菌株中,获得工程菌NZ9000Δldh:eGFPC550T;在荧光显微镜下检测显示其不发荧光,表明单碱基突变报告系统构建成功。该报告系统可用于碱基编辑器的编辑效率检测,为乳酸乳球菌碱基编辑技术的开发奠定牢固的基础。

基于LC-MS/MS技术的水蛭配方颗粒中7种碱基和核苷成分分析方法的建立

本文建立了一种使用岛津超高效液相色谱仪Nexera X2和三重四极杆质谱仪LCMS-8050联用测定水蛭配方颗粒中7种碱基和核苷成分的分析方法.水蛭配方颗粒以10%甲醇50℃超声提取30 min,MRM正负模式同时检测.以Discovery■HS F5-3色谱柱进行分离,流动相为0.15%甲酸水溶液和甲醇,10 min内完成梯度洗脱.本方法采用外标法定量,7种化合物在相应的浓度范围内线性关系良好,判定系数(R^(2))均大于0.996,定量限在0.42—3.94μg·g^(-1)之间. 10 ng·mL^(-1)的混合标准品溶液连续进样6次,待测化合物峰面积RSD均小于6%,精密度良好.平行6份加标回收试验,7种化合物平均回收率在87.09%—105.81%之间,RSD%在1.35%—4.70%之间.残留实验结果为阴性.该方法准确可靠,可为水蛭配方颗粒的质量控制提供参考依据.

DNA碱基编辑技术的研究进展及在猪基因修饰中的应用

碱基编辑技术起源于CRISPR/Cas系统,是目前最新的基因定点修饰技术。根据碱基编辑器的功能特点,可将碱基编辑器分为胞嘧啶碱基编辑器(cytosine base editor,CBE)、腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor,ABE)、糖基化酶碱基编辑器(glycosylase base editor,GBE)、腺嘌呤碱基颠换编辑器(adenine transversion base editor,AYBE)、双碱基编辑器(dual base editor,DBE)和引导编辑器(prime editor,PE)。自碱基编辑系统诞生以来,已经广泛运用于动植物的研究中,并且已经证明了它在动植物遗传改良和疾病治疗中具有巨大应用价值。猪作为一种重要的农业经济动物和优良的动物疾病模型,对其进行遗传改良则变得十分重要。碱基编辑技术因其操作便利、高效、副产物少以及性价比高等特点,被迅速应用于动植物的遗传改良,并为人类的基因治疗提供技术支持。本文着重介绍了碱基编辑技术的开发、优化、应用特点、存在的问题以及对未来的展望,并总结了其在猪中的应用。以期为相关科研工作者了解碱基编辑技术提供参考。

激发态DNA碱基对分子间相互作用的理论研究

[目的]利用本课题组发展的定量分析方法研究激发态DNA碱基对分子间相互作用的本质,以及不同类型的电子跃迁对DNA碱基对分子间相互作用的影响.[方法]采用广义Kohn-Sham能量分解分析方法(generalized Kohn-Sham based energy decomposition analysis,GKS-EDA),对两种Waston-Crick构型和两种stacked构型的DNA碱基对分子间相互作用本质进行理论研究.[结果]对于Waston-Crick构型的碱基对,n→π^(*)跃迁削弱了轨道极化作用但加强了电子相关作用,激发态分子间相互作用由电子相关作用主导,而π→π^(*)跃迁对分子间氢键影响较小;对于stacked构型的碱基对,π→π^(*)跃迁削弱了静电相互作用但增强了电子相关作用.[结论]Waston-Crick构型碱基对分子间相互作用本质受电子激发跃迁影响较大,而电子激发跃迁基本不改变stacked构型碱基对分子间相互作用本质.

全球碱基编辑药物专利技术发展现状分析

目的把握我国碱基编辑器(BE)技术的市场竞争地位,为碱基编辑药物产业发展实现新跨域提供参考,也为培育新质生产力和新经济增长点奠定基础。方法通过incoPat平台获取并分析BE技术的相关专利数据,通过ClinicalTrials.gov数据库、中国临床试验注册中心及美国食品和药物管理局、国家药品监督管理局、科研院校和企业官方网站查询碱基编辑药物的临床试验情况或进展。专利数据截至2023年12月31日,检索和查询日期截至2024年6月30日。结果BE专利技术首次出现于2016年,此后处于技术高速发展阶段,创新主体不断致力于新型BE的研发、递送方式的优化、药物临床试验的开展等。在发达国家和人口密集国家布局较多专利以为后期临床试验、药物上市等做出充分准备。结论在政策引领下,我国碱基编辑药物的创新活跃性显著增强,但专利产业化模式还存在优化空间。国内外的碱基编辑药物在种类上竞争性低,尚有可进行专利布局的空间。

腺嘌呤碱基编辑器及其临床应用

人类遗传病致病基因一半以上是点突变,对其进行精确、高效的原位修复是遗传病治疗最理想的方式。鉴于点突变中大部分为鸟嘌呤(G)与腺嘌呤(A)之间的转换,而基于CRISPR/Cas9(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas9)系统的腺嘌呤碱基编辑器(adenine base editor,ABE)通过将A转换为G,从而修复这些突变,因此该种碱基编辑在人类遗传病治疗中特别重要。近年来,ABE不断被优化,特别是碱基编辑器的活性和保真性均被提高。本文总结了有关ABE的研究进展,特别是ABE研发过程中重要的突变体,同时对现有ABE仍然存在的缺陷进行了思考。另外,对ABE在临床(含临床前研究)方面的相关应用也进行了回顾。本文为发现和优化新型ABE及其应用提供参考。

应用C-to-G碱基编辑器对PCSK9基因靶向敲除的研究

目的:使用C-to-G碱基编辑器(CGBE)Td-CGBE-NG靶向敲除huh-7肝癌细胞系前蛋白转化酶枯草溶菌素9(PCSK9)基因,以CBE(AncBE4max)为参照,评价Td-CGBE-NG对该基因的敲除效果。方法:使用引入终止密码子的策略敲除huh-7肝癌细胞系PCSK9基因。构建碱基编辑器Td-CGBE-NG和AncBE4max,构建重组质粒sg386和sg555,将Td-CGBE-NG和sg386,AncBE4max和sg555分别共转染huh-7细胞,实现c.1447C>G和c.1953C>T的转换,在两位点引入终止密码子S386X(TGA)和Q555X(TAG),使用sanger测序和T载体克隆验证编辑效率;实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测PCSK9基因mRNA和蛋白表达水平的变化。结果:sanger测序和T载体克隆结果显示,Td-CGBE-NG和AncBE4max的编辑效率分别为c.1447C>G 33%和c.1953C>T 25%;RT-qPCR结果显示,Td-CGBE-NG使PCSK9 mRNA的表达量降低(t=17.29,P<0.0001);Western blot结果表明,两组huh-7细胞蛋白表达量均明显下降(AncBE4max:t=5.57,P<0.01;Td-CGBE-NG:t=4.912,P<0.01)。结论:Td-CGBE-NG可以有效敲除huh-7肝癌细胞系的PCSK9基因,抑制该基因mRNA和蛋白的表达,为后续Td-CGBE-NG的应用奠定基础。

碰撞激活诱导的双势阱势能面可以实现9-甲基-8-氧鸟嘌呤-9-甲基腺嘌呤碱基对阳离子自由基的质子转移

8-氧鸟嘌呤(OG)是最常见的核碱基氧化损伤,它在复制过程中可以用Hoogsteen的模式与腺嘌呤(A)错误配对.0G.A碱基对不仅可以诱发G·C→T·A的颠换突变,而且由于OG的电离势和氧化电位低于天然DNA碱基更容易受到电离辐射和单电子氧化的影响,本文报道了[9MOG·9MA]^(·+)碱華对阳离子自由基的形成.和碰撞诱导解离,该碱基对利用9-甲基8-氧鸟嘌呤(9MOG)和9-甲基腺嘌呤(9MA)模拟相对应的核苷酸.实验通过电喷雾产生Cu(Ⅱ)碱基复合物继之以氧化分离产生[9MOG·9MA]^(·+),并使用导向离子束串级质谱仪检测[9MOG·9MA]^(·+)的碰撞诱导解离、通过测量在不同碰撞能量下的解离产物和反应截面,可以得出[9MOG-H]+[9MA+H]^(+)(主要解离通道)和9MOG^(·+)+9MA(次要通道)的0 K解离阈能分别为1.8和1.65 eV.使用密度泛函理论对[9MOG·9MA]^(·+)的结构计算发现其所有重要构象都发生了质子转移生成[9MOG-H]^(·)·[9MA+H]^(+).另一方面,9MOG^(·+)+9MA的解离通道却需要9MOG^(·+)9MA作为中间体.看似矛盾的结果可以用碰撞活化后反应势能面上出现的双重势阱和由此触发的激发态质子转移平衡([9MOG-H]^(·)·[9MA+H]^(+))^(*)→←(9MOG6(·+)·9MA)^(*)来解释.本文实验和理论研究揭示了这种生物学上重要的非规范碱基对如何在氧化和电离损伤时发生解离.

单碱基编辑技术在治疗遗传性贫血中的应用

单碱基编辑器(base editors,BEs)是一类基于CRISPR/Cas系统或转录激活子样效应子阵列蛋白(transcription activator-like effector,TALE)基因编辑技术的新兴碱基编辑器。该类编辑器既不需要引入DNA双键断裂,也不需要供体DNA,可针对基因组单个碱基进行精准替换,与以前的基因编辑技术相比,单碱基编辑器具有副产物更少、碱基编辑范围更大等优点,这为基因治疗点突变导致的遗传性贫血带来了曙光。本文对单碱基编辑技术的发展,以及单碱基编辑技术在基因治疗突变引起的遗传性贫血的临床尝试中取得的进展进行概述,可为未来临床上基因治疗遗传性贫血提供理论参考。

不同AM真菌处理滇重楼中9种核苷和碱基含量分析

目的:研究不同丛枝菌根(AM)真菌对滇重楼产量和品质的影响,为筛选滇重楼的优良AM真菌株提供科学依据。方法:以灭菌土壤为生长基质,于室温盆栽条件下对滇重楼新鲜根茎与28种AM真菌共同培养后采样,选取浸泡于FAA固定液中滇重楼根系30条,采用Philips J M等的方法染色、制片、镜检,根据Trouvelot等的方法统计菌根侵染率,以及用HPLC测定和比较分析各处理组滇重楼根茎中核苷(胞苷、尿苷、鸟苷、胸苷、腺苷、2′-脱氧腺苷)和碱基(尿嘧啶、鸟嘌呤、腺嘌呤)的含量。结果:多数处理组滇重楼AM真菌侵染率均有所提高,其中Ga、Asc和Asp处理组的浸染率最显著(P<0.05);不同AM真菌对滇重楼根茎中核苷和碱基含量的影响有所差异;滇重楼根茎中核苷和碱基的积累可能同时存在协同和竞争2种效应。结论:施加外源AM真菌对滇重楼根内AM真菌的侵染率具有调控(增减)作用,在人工栽培过程中接种Sde、Gd、Sca、Spe、Svi、Pb等6种优势AM真菌,能有效促进滇重楼的品质。

基于胞嘧啶碱基编辑器构建ESM1基因敲除Hela细胞系

目的:基于胞嘧啶碱基编辑器(CBE)提前引入终止密码子构建内皮细胞特异性分子1(ESM1)基因敲除Hela细胞系。方法:根据NCBI数据库ESM1序列信息(Gene ID:11082),利用在线软件Benchling在ESM1基因1号外显子上设计2个向导sgRNA,构建对应的pX330-ESM1-sgRNA表达载体。将BE4max、ACBE-ASR、pX330-ESM1-sgRNA 3个质粒共转染Hela细胞,用嘌呤霉素富集筛选CBE工作阳性细胞。PCR扩增含靶点的序列并进行Sanger测序,比较2个sgRNA的效率。通过有限稀释法筛选单克隆细胞,扩大培养后进行测序及Western Blot检测。结果:测序结果显示pX330-ESM1-sgRNA表达质粒构建成功,sgRNA2的编辑效率为66%,远高于sgRNA1的编辑效率;10组细胞单克隆中有6组细胞的靶点进行了双等位基因精确编辑,成功提前引入了终止密码子;Western Blot结果显示ESM1被成功提前终止翻译,达到基因敲除的目的。结论:基于胞嘧啶碱基编辑器提前引入终止密码子的策略成功构建了ESM1基因敲除Hela细胞系,为后续研究ESM1在宫颈癌中的作用机制提供了实验材料,奠定了基础。

单碱基编辑技术在作物遗传改良中的应用

随着对CRISPR系统的深入研究,已开发出基于CRISPR/Cas9系统的单碱基编辑器,并使其逐渐成为基因编辑领域的重要工具。在作物遗传改良相关研究中,单碱基编辑器已被广泛应用于改良作物性状,提高产量、营养品质、抗逆性和抗病性等诸多领域。通过引入单碱基编辑技术,水稻、番茄、拟南芥等作物获得了抗除草剂、抗倒伏等特性。文章综述了单碱基编辑系统的工作原理及其在植物基因编辑领域的应用,旨在推动农业可持续发展和人类社会进步。

加压溶剂提取高效液相色谱法测定天然和人工虫草中的麦角甾醇、核苷及其碱基

目的 建立同时测定虫草中麦角甾醇、核苷及其碱基含量的简便方法。方法 正交法优化加压溶剂提取条件 ;HPLC法同时测定天然和人工虫草中上述成分的含量。结果 以甲醇为提取溶剂 ,提取温度 16 0℃ ,提取时间 5min ,提取压力 10MPa ,循环 1次 ,提取 1次。采用ZorbaxNH2 分析柱 (2 5 0mm× 4 6mmID ,5 μm) ,流动相为A(乙腈 ) B(10mmol·L- 1 醋酸铵溶液 )二元梯度洗脱 :0 - 5 0min ,B %为 0→ 15 % ;5 0 - 2 5 0min ,B %为 15 %→ 2 0 % ;2 5 0 - 35 0min ,B %为 2 0 %→ 4 0 % ;35 0 - 4 5 0min ,B %为 4 0 %→ 80 % ;4 5 0 - 5 0 0min ,B %为 80 %。结论 本法能够快速、简便地测定虫草中麦角甾醇、核苷及其碱基的含量。

核酸水解产物嘌呤、嘧啶碱基在BDS柱上的分离及测定

用高效液相色谱法测定了核酸水解的中间产物及最终产物 6种嘌呤、嘧啶碱基 ,探讨了色谱柱、流动相等对其分离的影响 ,确定了最佳色谱条件为 :HypersilBDS C18柱 ,乙腈 0 1mol/LKH2 PO4 (H3 PO4 调节 pH至4 0 5 ) (体积比为 2∶98)作流动相 ,紫外检测器在 2 6 0nm波长下检测。方法的精密度在 3%以内 ,回收率在 82 %～ 114%。方法应用于酵母核酸样品的测定中 。