长期碳酸盐碱度胁迫对脊尾白虾生长及卵巢发育的影响

为探讨碳酸盐碱度对脊尾白虾生长及卵巢发育的影响。本研究设置3 mmol/L(对照组)、5 mmol/L和8 mmol/L三种碳酸盐碱度梯度养殖脊尾白虾60 d,比较不同碳酸盐碱度胁迫对脊尾白虾生长性能、组织结构、酶活性以及卵巢发育的影响,结果显示,5 mmol/L组与对照组体长增长率、体重增长率以及成活率差异不显著,8 mmol/L组体长增长率、体重增长率以及成活率显著低于对照组。肝胰腺组织切片显示,5 mmol/L组中部分B细胞体积增大,部分转运泡内出现颗粒物质,8 mmol/L组管腔的形态结构严重变形。鳃组织切片显示,5 mmol/L组出现轻微鳃丝肿大现象,角质层略有变形,且角质层下间隙扩张变长,上皮细胞与支柱细胞排列紊乱;8 mmol/L组鳃丝肿大,排列不规则,出现血细胞肿胀现象,鳃丝上皮细胞严重破坏,毛细血管网结构形态改变,角质层下间隙变形。肌肉组织酶活性测定结果显示,5 mmol/L组的碳酸酐酶活性显著高于对照组,Na^(+)/K^(+)-ATP酶活性在肌肉中差异不显著;肝胰腺组织酶活性测定结果显示,碳酸酐酶在肝胰腺组织中差异不显著,8 mmol/L组Na^(+)/K^(+)-ATP酶活性显著低于其他组,鳃组织中,5和8 mmol/L组鳃组织中和Na^(+)/K^(+)-ATP酶活性均显著高于对照组,且两组间差异显著。卵巢发育统计结果显示,三组脊尾白虾卵巢均能发育,其发育至Ⅱ期的百分比分别为20.51%、10.52%和6.25%,其中5 mmol/L组与对照组间无显著差异,8 mmol/L组显著低于对照组;3 mmol/L组和5 mmol/L组均有卵巢发育至Ⅲ期的脊尾白虾,但两组差异不显著,8 mmol/L组未见有卵巢发育至Ⅲ期的脊尾白虾。卵巢组织切片显示,8 mmol/L组卵原细胞细胞排列疏松,周围滤泡细胞排列疏松且数量较少。研究表明,脊尾白虾可以在低于8 mmol/L的碳酸盐碱度中生长发育,但高碳酸盐碱度可能会造成脊尾白虾鳃和肝胰腺组织损伤,导致其生长受到影响,同时猜测高碳酸盐碱度可能也会影响卵巢的发育速率。本研究可为开展脊尾白虾在盐碱水中的增养殖提供基础数据和参考信息。

碱度胁迫对青海湖裸鲤血清生理生化指标的影响

【目的】探究碱度对青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)相关生理生化指标的影响,对制定青海湖裸鲤应对碱环境的策略提供理论参考。【方法】以青海湖裸鲤血清为研究对象,进行慢性碱度胁迫,碱度先逐渐上升至最高点后逐渐降低(未胁迫为对照),测定分析取各胁迫点血清中激素、渗透、能量、氧化及免疫等指标的变化。【结果】青海湖裸鲤血清的皮质醇(COR)、钙(Ca^(2+))、血糖(GLU)、渗透压(OS)、Na^(+)/K^(+)-ATPase(NKA)、碳酸酐酶Ⅱ(CAⅡ)、碳酸酐酶Ⅳ(CAⅣ)、总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLOB)、甘油三酯(TG)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和丙二醛(MDA)变化趋势相同,均为随碱度升高先升高后下降,随碱度降低则先下降后升高。COR与CAIV、总胆固醇(TC)、ALT、GPX和MDA呈极显著正相关(P<0.01),与TP、GLOB、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)、TG和CAT呈显著正相关(P<0.05,下同)。胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)、超氧化物歧化酶(SOD)、钠(Na^(+))、碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)有相同变化趋势,无论碱度升高还是下降,均呈先下降后升高变化趋势。三碘甲状腺原氨酸(T3)、TC、HDL-C和LDL-C与碱度呈负相关,肌酐(CREA)和总胆红素(TBIL)与碱度呈正相关。IGF-Ⅰ与T3呈显著正相关。甲状腺激素(T4)含量和乳酸脱氢酶(LDH)活力随碱度升高先升高后下降再恢复,之后随碱度降低先下降后升高。生长激素(GH)和氯(Cl-)随碱度升高先升高后下降再升高,之后随碱度降低逐渐升高。催乳素(PRL)含量随碱度升高先稍微下降后恢复再降低,之后随碱度降低先迅速升高后恢复。钾(K^(+))浓度随碱度升高而下降,随碱度降低先升高后下降。尿酸(UA)含量随碱度升高先下降后恢复,随碱度降低逐渐下降。尿素(UREA)含量随碱度升高先升高后恢复再升高,随碱度降低继续升高后恢复。【结论】在碱度胁迫时,青海湖裸鲤COR起主导作用,T3和IGF-Ⅰ协同,T4调控GH辅助,从而维持鱼类的体液稳态;TP、ALB、GLOB和TG含量的升高、SOD活力先下降后恢复及AKP活力先下降后恢复再升高等反应可能是青海湖裸鲤应对碱环境的一个重要策略。

NaHCO_(3)碱度胁迫对大鳞鲃氧化应激水平的影响

为研究碱度胁迫对大鳞鲃(Luciobarbus capito)肝、肾和鳃组织的抗氧化系统、组织结构以及血清激素水平的影响,设置了4个NaHCO_(3)碱度试验组(10,20,30和40 mmol/L)和一个淡水对照组,开展为期7 d的NaHCO_(3)碱度胁迫试验。研究表明,在相同碱度胁迫下,大鳞鲃肝、肾和鳃组织中,3种抗氧化酶活力(ACP、AKP和GSH-Px)、MDA含量、血清皮质醇和促肾上腺皮质激素均随胁迫时间的延长呈先升后降并趋于稳定的变化趋势,各指标均在胁迫12 h内达到峰值,在胁迫7 d内逐渐趋于平稳。在40 mmol/L高碱度胁迫7 d时,肝组织细胞出现细胞核偏移现象,各级肾小管亦均出现不同程度的萎缩,鳃小片中则出现细胞肿胀、鳃小片之间间隙增大等现象。整个试验过程中,大鳞鲃未出现病变或死亡现象。实验结果表明,在40 mmol/L的高碱胁迫下,大鳞鲃可通过自身调节,使其各项氧化应激指标恢复至正常水平,这表明大鳞鲃对NaHCO_(3)碱度环境有较强的适应能力。

中国对虾ATG5基因的克隆及其在pH、碳酸盐碱度胁迫下的表达分析

采用c DNA末端快速扩增(RACE)技术获得中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)ATG5基因c DNA全长,命名为Fc ATG5。利用实时荧光定量技术分析了Fc ATG5的组织表达及其在pH和碳酸盐碱度胁迫下的表达特征,并利用RNAi技术验证其功能。基因分析显示,Fc ATG5c DNA全长为2225bp,开放阅读框为810bp,编码269个氨基酸,预测其编码的蛋白质分子量为31.103kDa,理论等电点为5.59,为疏水性蛋白,包含1个APG5自噬相关蛋白结构域,无跨膜结构,不包含信号肽。同源性和系统进化分析显示,Fc ATG5具有高度保守性,与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)同源性最高(98.14%)。组织表达分析显示,Fc ATG5在中国对虾各组织中均有表达,肌肉中表达量最高(P<0.05),血淋巴细胞中最低(P<0.05)。pH胁迫后48h,Fc ATG5在鳃中的表达量最低,为对照组的1.68倍;胁迫后96 h最高,为对照组的2.67倍。碳酸盐碱度胁迫后12 h,Fc ATG5在鳃中表达量最高,为对照组的2.77倍;胁迫后96 h最低,为对照组的1.30倍。干扰实验结果显示,pH和碳酸盐碱度胁迫下,沉默Fc ATG5基因会使中国对虾死亡率显著增高(P<0.05),表明该基因的表达量越高,越有利于中国对虾存活。实时定量结果表明,Fc ATG5在pH、碳酸盐胁迫下的表达量均显著升高(P<0.05),推测自噬可能参与中国对虾应对非生物胁迫的调控。本研究结果对水生动物特别是甲壳动物中细胞自噬研究具有重要的借鉴意义,有助于推进中国对虾盐碱水养殖的研究进程。

碱度长期胁迫对花鲈肾组织转录组的影响

为了解花鲈(Lateolabrax maculatus)的耐碱机制,本研究探讨了碱度长期胁迫对花鲈肾组织转录组的影响。研究设计了3个碳酸盐碱度梯度(0、15和30 mmol/L),基于Illumina Novaseq 6000高通量测序平台进行了花鲈肾组织转录组测序并进行了生物信息学分析。研究表明,con组(0 mmol/L)、AW15组(15 mmol/L)和AW30组(30 mmol/L)分别获得了163197546、145296406和141892236条Clean reads。与con组相比,AW15组和AW30组分别有142和3103个差异表达基因上调,104和2235个差异表达基因下调。随机选取9条差异表达基因进行实时荧光定量PCR验证,结果与转录组测序一致,表明本研究中RNA-seq结果具有较高的可靠性。GO富集分析发现,差异基因显著富集在气体运输、GTP酶活性的正调控和水解酶活性的正调控等方面;KEGG通路富集分析表明,差异基因显著富集在细胞周期、DNA复制和癌症中的蛋白多糖等方面。本研究发现了49个持续变化基因(fyn、ceacam和acsl等),这些基因主要集中在机体生长、能量代谢、免疫反应等功能群中。中、高碱度长期胁迫对花鲈肾组织影响不同,其中,中碱度主要影响肾组织脂肪酸与氨基酸的合成与代谢,而高碱度则主要抑制了细胞有丝分裂和机体免疫能力。研究结果显示,花鲈对碱度的适应是一个涉及多基因的复杂过程,随着碱度升高,花鲈生长受到显著抑制,机体能量代谢增强,免疫能力显著下降。

青海湖裸鲤SMIT1和SMIT2基因克隆及其对碱度环境的应答

【目的】哺乳动物钠/肌醇共转运蛋白(sodium/myo-inositol cotransporter, SMIT)有2个同源体,分别是SMIT1和SMIT2,属于溶质载体(SLC)超家族。试验旨在探究青海湖裸鲤SMIT1、SMIT2基因对碱度环境的应答,为后续SMIT1和SMIT2基因在碱度环境下参与肌醇转运的分子机制奠定基础。【方法】利用PCR技术扩增、克隆SMIT1、SMIT2基因CDS区,并对其进行生物信息学分析;利用实时荧光定量PCR技术检测SMIT1和SMIT2基因在淡水环境下青海湖裸鲤鳃、肾脏、脑等8个组织中的表达情况,以及不同碱度胁迫(0、J25、J50、J75、J100)下鳃和肾脏组织中2个基因表达的规律;利用气相色谱质谱法(GC-MS)检测不同碱度胁迫下鳃和肾脏组织中的肌醇含量变化。【结果】SMIT1基因CDS区为2 130 bp,共编码709个氨基酸,其氨基酸序列与犀角金线鲃相似性最高(86.5%),与多鳞白甲鱼亲缘关系最近;SMIT2基因CDS区为2 016 bp,共编码671个氨基酸,其氨基酸序列与多鳞白甲鱼的相似性最高(90.3%),与犀角金线鲃、多鳞白甲鱼的亲缘关系较近。SMIT1和SMIT2均属于溶质体超家族的SLC5家族成员,其中SMIT1蛋白包含2个SLC家族保守结构域。实时荧光定量PCR结果显示,淡水环境下SMIT1和SMIT2基因在青海湖裸鲤不同组织中均有表达,其中,SMIT1基因在脑和肾脏中表达量较高,SMIT2基因在肾脏中表达量最高,均显著高于其他组织(P<0.05)。随着碱度的升高,与对照组相比,J25、J50、J100时SMIT1基因在青海湖裸鲤鳃中表达量均显著升高(P<0.05),在肾脏中整体表达量均显著升高(P<0.05);J25时SMIT2基因在青海湖裸鲤鳃中表达量显著升高(P<0.05),J50、J75、J100时在肾脏中表达量均显著降低(P<0.05)。GC-MS结果显示,随着碱度的升高,青海湖裸鲤鳃中肌醇含量均显著高于对照组(P<0.05);肾脏中肌醇含量与对照组相比无显著变化(P>0.05)。【结论】SMIT1、SMIT2基因CDS区分别长2 130和2 016 bp,分别编码709和671个氨基酸,SMIT1基因在青海湖裸鲤脑组织中高表达,而SMIT2基因在青海湖裸鲤肾脏中高表达。不同碱度胁迫下SMIT1、SMIT2基因在青海湖裸鲤鳃、肾脏中的表达规律不同;肌醇含量在鳃组织中显著升高,且在J50时达到最高,在肾脏中变化不显著。研究结果为进一步探究青海湖裸鲤适应碱度环境的分子机制提供参考依据。

碱度胁迫对尼罗罗非鱼鳃离子细胞形态以及鳃、肾和肠中HCO3^-转运因子的影响

采用扫描电镜观察了不同碱度(0、2、4 g/L Na HCO_3)胁迫对尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)鳃离子细胞形态变化的影响,并采用免疫组化技术观察了鳃、肾、肠中4个HCO_3^-转运因子碳酸酐酶(CAⅡ、CAⅣ)、碳酸氢钠协同转运载体(SLC4A4)、Cl^-/HCO_3^-离子交换体(SLC26A6)的阳性反应变化。扫描电镜结果表明,鳃离子细胞分布在鳃小片基部。根据其表面开孔形状和尺寸,可分为Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型和Ⅳ型4种亚型,各亚型离子细胞的开孔尺寸随碱度胁迫强度增高呈正比增大,Ⅲ型离子细胞开孔尺寸变化最明显(P<0.01);离子细胞总数目也随碱度升高而增加,Ⅲ型离子细胞数目上升最为显著(P<0.01)。免疫组化结果表明,在淡水、碱水组中,CAⅡ、CAⅣ、SLC4A4、SLC26A6在鳃小片基部和肾中均有阳性反应,且随着碱度升高,阳性反应增强,但在肠道中未观察到阳性反应。本研究结果初步表明,尼罗罗非鱼可通过鳃离子细胞形态和数量调节适应碱度变化,鳃和肾为主要应答调节器官。

miR-192在尼罗罗非鱼应答碱度胁迫中的表达及靶基因

采用实时荧光定量、生物信息学、双荧光素酶报告和体内miRNA抑制的方法,探究miR-192在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)应答碳酸盐碱度胁迫中的作用。结果如下:(1)实时荧光定量PCR实验表明,在急性碱度胁迫(6 g/L NaHCO3)尼罗罗非鱼6 h后,鳃组织中miR-192的表达显著下调,溶质转运蛋白基因(solute carriers16A7,SLC16A7)表达显著上调(P<0.05);(2)借助生物信息分析预测到SLC16A7可能是miR-192的靶基因;(3)利用双荧光素酶报告实验发现miR-192会与SLC16A7的3′UTR结合;(4)体内对miR-192抑制后,SLC16A7的表达显著上调(P<0.05)。证实了miR-192参与了尼罗罗非鱼应答碱度胁迫中的调控过程,SLC16A7是miR-192的直接靶基因,为探明miRNAs调控尼罗罗非鱼应答碱度胁迫的分子机制提供了一定的依据。

碱度对尼罗罗非鱼血清渗透压、离子浓度及离子转运酶活力的影响

为了探讨鱼类在碱水环境中的渗透调节机制,将尼罗罗非鱼从淡水直接转入2 g·L^(–1)和4 g·L^(–1)NaHCO_3碱水中进行急性胁迫试验,分别检测胁迫后0、3、6、12、24、48、72、96和192 h时血清渗透压、血清Na^+、K^+、Cl~–和HCO_3~–浓度以及鳃、肾和肠中离子转运酶碳酸酐酶(CAⅡ、CAⅣ)、碳酸氢钠协同转运载体(SLC4A4)、Cl~–/HCO_3~–离子交换体(SLC26A6)活力变化。结果显示:不同碱度胁迫下,尼罗罗非鱼血清渗透压、离子浓度以及鳃、肾、肠中离子转运酶活力均与碱胁迫浓度呈正相关。随时间推移,血清渗透压、离子浓度呈现先上升、后下降的变化趋势,24 h达到峰值;鳃、肾和肠中CAⅡ、CAⅣ、SLC4A4、SLC26A6活力均呈现先短时间降低、后升高、再降低并趋于稳定的趋势。研究表明,尼罗罗非鱼具有一定的碱环境适应能力,CAⅡ、CAⅣ、SLC4A4、SLC26A6参与碱胁迫下离子转运、渗透压平衡调节。