一株产低温碱性蛋白酶海洋细菌Pseudoalteromonas flavipulchra HH407的筛选与生长特性

对从连云港海域筛选的一株产低温碱性蛋白酶的海洋适冷菌HH407进行的鉴定和生长特性研究结果表明,该菌为革兰氏阴性杆菌,好氧,端生鞭毛,无芽孢及荚膜,大小为0.4～0.7μm×1.0～1.8μm,在酪蛋白培养基的菌落特征为椭圆金黄色、光滑、半透明、四周隆起。根据其生理生化性质、16S rDNA同源性和系统进化树分析初步鉴定该菌属于Pseudoalteromonas flavipul- chra。该菌的生长温度范围为0～40℃,最适生长温度为20℃;pH范围为5.5～11.0,最适生长pH值为8.5;NaCl质量浓度范围为0.5～13 g/dL,最适生长NaCl质量浓度为4 g/dL,无NaCl时不能生长。该菌能较好利用胰蛋白胨、酵母膏和蛋白胨等蛋白质物质,对糖的利用较差。该菌株所产蛋白酶在pH 10.0和35℃时表现最高酶活。

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶性质鉴定

对黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130菌株产低温碱性蛋白酶的理化性质研究表明 ,该酶由 2 56个氨基酸组成 ,分子量为 330 0 0 Dar,等电点 p I为 9.4 5,米氏常数 Km为 5× 10 -3 m mol/ L;酶的最适作用p H范围为 9.5～ 10 .5,最适作用温度 30℃ ,具有一定的抗氧化稳定性。Ca2 +、Mn2 对酶有激活作用 ,而 Hg2 +、Ag+对酶有抑制作用。 DFP、NBS严重抑制酶的活性 ,而同时该酶也能被 EDTA抑制。结果表明该低温碱性蛋白酶为一新型的丝氨酸蛋白酶。

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶的制备工艺研究

对黄海黄杆菌所产低温碱性蛋白酶的工业生产技术和电泳纯级试剂酶的分离纯化工艺进行了实验。按照设计的中试生产技术 ,每吨发酵液可得酶粉 2 0 kg,粗酶比活大于 2 0× 10 4 U/ g;同时运用一系列纯化手段和条件 ,制备出电泳纯级试剂酶 ,纯化过程蛋白回收率在 7%左右 ,活性回收率在60 %以上 ,比活性也稳定在 1.9× 10 3U/ mg以上 ,激光灰度扫描结果试剂酶纯度大于 99% ,可以作为试剂酶满足进一步生物学研究和实际应用。其产品质量和制造工艺均达到了中试放大规模的要求。

产低温碱性蛋白酶黄海黄杆菌YS-9412-130的复合诱变原生质体选育

以黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130突变株 SW1- 10 4为出发菌 ,在原生质体形成和再生的最佳条件下制备原生质体 ,对原生质体进行复合诱变 ,对大量再生突变株进行筛选和淡水驯化 ,最终获得了高产、稳定的碱性蛋白酶产生菌 SW2 - 10 4 ,在自来水培养基中能够大量产酶 ,产酶活力为 3910 U/ ml。从而解决了黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130低温碱性蛋白酶大规模工业化生产设备和产业化区域的局限性。

微生物低温碱性蛋白酶的研究进展

综述了微生物源低温碱性蛋白酶的研究状况 ,包括酶的微生物来源、生产菌株的选育、酶学特性、酶的结构及人工进化和安全性评价 。

海洋细菌QD80低温碱性蛋白酶的基因克隆和性质

对海洋细菌QD80所产低温碱性蛋白酶进行了基因克隆和序列分析,对此酶的性质进行了初步研究.此酶基因开放阅读框架为1377bp,分子量为49.9kD.此序列上游-8bp处为该基因的SD序列,-10区和-35区分别有5′TAGAAT3′和5′TTGACC3′的保守序列.该酶最适pH为9.5,最适反应温度为30℃,在10℃酶活力仍能保持30%以上.该酶对氧化剂H2O2的抗氧化作用明显,浓度达到4gL时酶活仍保留85%.该蛋白酶的低温适应性和抗氧化特性将对其在低温洗涤领域的应用提供广泛的潜在应用价值.

海洋低温碱性蛋白酶的急性毒性研究

应用酶工程技术 ,得到在室温下有较高酶活力的海洋低温碱性蛋白酶。为对海洋低温碱性蛋白酶进行安全性评价 ,作者应用小鼠和大鼠急性毒性试验及最大耐受量 ( MTD)测定 ,观察海洋低温碱性蛋白酶对小鼠 1次口服后产生的急性毒性反应和大鼠完整皮肤短期内接触海洋低温碱性蛋白酶所产生的毒性反应。结果表明 ,小鼠 1次口服海洋低温碱性蛋白酶的 MTD>2 0 g/kg为实际无毒物 ,其中毒的靶器官是肝脏 ,未见大鼠经皮的急性毒性反应。

海洋假单胞杆菌QD80低温碱性蛋白酶的化学修饰

海洋假单胞杆菌QD80低温碱性蛋白酶(QDAPr)具有良好的低温适应性,且与常见的增稠剂及表面活性剂有良好的配伍性.因此该蛋白酶在日用化学领域,尤其是低温洗涤领域,具有广泛的应用价值.为研究其结构与功能之间的关系,用EDC、PMSF、N-AI、2,3-丁二酮等8种化学修饰剂修饰该低温碱性蛋白酶,然后检测残余酶活力,借以研究酶分子中氨基酸侧链基团与酶活性中心的关系.结果表明,羧基、丝氨酸、ε-氨基、巯基等残基与酶活性无关;而色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基侧链的化学修饰引起酶活性的大幅度下降,说明色氨酸、组氨酸、酪氨酸残基是酶活力所必需的基团.精氨酸残基侧链的化学修饰引起酶活性的轻微下降,说明精氨酸对酶活性具有一定贡献,但不处于活性中心.

海洋低温碱性蛋白酶的刺激性研究

探究海洋低温碱性蛋白酶的刺激性 ,并为其应用提供实验依据。作者应用新西兰大耳白兔 ,以 4 0 %、2 0 %和 5‰浓度的海洋低温碱性蛋白酶进行皮肤急性刺激试验 ,5‰海洋低温碱性蛋白酶的皮肤多次刺激性试验 ,1‰的海洋低温碱性蛋白酶的兔角膜刺激性试验 ,评价其安全性。结果表明 ,5‰和 2 0 %海洋碱性蛋白酶单次应用实验皮肤未出现红斑和水肿 ,对皮肤无刺激性。 4 0 %海洋低温碱性蛋白酶液对皮肤有中度刺激性。皮肤病理学显示 5‰的海洋低温碱性蛋白酶液未见皮肤的慢性刺激反应 ,皮肤结构完整、层次清晰。

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶活性必需基团分析

用化学修饰法结合酶的紫外吸收光谱变化研究黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130分泌的海洋低温蛋白酶的功能基团性质 ,结果表明 ,羟基、咪唑基、ε-氨基及胍基均与酶活性有关 ,而羧基、巯基与酶活性无关。酶的性质与丝氨酸蛋白酶有很大的相似性。

海洋低温碱性蛋白酶的皮肤变态反应研究

利用酶工程技术制得的海洋低温碱性蛋白酶 ,主要用于加酶的洗涤剂 ,在室温下有较高的酶活力。为确保海洋低温碱性蛋白酶使用的安全性 ,并为其应用提供实验依据 ,本文以豚鼠为受试动物 ,进行皮肤致敏反应试验。结果表明 ,经致敏接触和激发接触 ,2 ,4 -二硝基氯苯组 ( DNCB)皮肤最大平均反应值为 3.3,致敏率为 10 0 %。海洋低温碱性蛋白酶组皮肤最大平均反应值为 0 .0 5,致敏率为5%。

壳聚糖固定化海洋低温碱性蛋白酶YS-80-122的研究

以壳聚糖为固定化载体,采用吸附交联法,以戊二醛为交联剂,对海洋低温碱性蛋白酶YS-80-122进行固定化。通过单因素和正交试验优化得到最佳固定化条件为pH7·0,戊二醛终浓度0·2%,吸附时间50min,酶载体比例40mg/g,交联时间16h,交联温度10℃,固定化酶酶活回收可达47·52%。固定化酶和游离酶的最适作用温度均为30℃,最适作用pH分别为9·0和10·0,相比游离酶,固定化酶可在更宽的温度和pH范围内发挥高活性,且其温度和pH稳定性得到显著提高。室温下经冷冻干燥的固定化酶贮存90d后活性基本保持不变,贮藏半衰期约为190d。以酪蛋白为底物,重复使用7次后酶活仍保留有79·2%,操作半衰期约为21次使用率。

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶的基因克隆和序列测定

黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130具有稳定的分泌低温碱性蛋白酶的能力。将其染色体 DNA用 Sau3A 部分酶切后 ,低熔点琼脂糖回收 2 - 10 Kb的 DNA片段 ,用 Klenow大片段酶半补齐 ,与用 Sal 酶切且半补齐的质粒 p UC19连接后 ,转化 E.Coli.JM10 9,构建基因文库。用酪蛋白平板法和酶联免疫吸附 ( EL ISA)的活性筛选方法从基因文库中筛选到一株产海洋低温碱性酶的阳性克隆 (命名为p HH1)。序列测定分析表明 ,此重组质粒包含有长度为 768bp低温碱性蛋白酶基因的完整的开放读码框架 ( ORF)和上游基因调控序列。此片段编码由 2 56个氨基酸组成的酶 ,计算分子量为 330 0 0 Dal。通过 Southern杂交证实了此片段来自于黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130基因组 DNA。

海洋低温碱性蛋白酶亚慢性毒理学研究

应用大鼠经口、经皮肤亚慢性毒性试验 ,对海洋低温碱性蛋白酶毒理学进行研究。 12 0只Wistar大鼠 ,随机分为 6组 :对照组 ,海洋低温碱性蛋白酶 1.2 g/ kg(经口 ) ,1.2 g/ kg、0 .135g/ kg、0 .0 15g/ kg(经皮 )和 1.2 g/ kg(经皮追踪组 ) ,用药周期 90 d,追踪组增加 2 8d观察。记录和检测大鼠的一般状况和体质量增长、脏器系数、血常规、凝血时间、肝肾功、部分血液生化和离子浓度及病理检查。结果表明 ,海洋低温碱性蛋白酶各组 (经皮、经口 )大鼠的各项指标与对照组比较均未见明显异常 ( P均 >0 .0 5) ,提示大鼠能耐受长期给予 1.2 g/ kg(经皮、经口 )

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶多克隆抗体的制备

利用纯化的黄海黄杆菌海洋低温碱性蛋白酶 ( Marine L ow- temperature Alkaline Protease,MLAP) ,采用背皮内多点注射和皮下组织注射免疫相结合的方法对新西兰白兔进行免疫 ,制备了多克隆抗体 ,并对多克隆抗体进行了纯化。用 EL ISA的方法对其效价检测表明 ,其效价为 12 80 0 0。作者所做的

海洋低温碱性蛋白酶的遗传毒理学研究

应用 NIH纯系小鼠骨髓细胞微核试验和染色体畸变试验 ,探究海洋低温碱性蛋白酶的遗传毒性作用及对人类的潜在危害。观察并计数嗜多染红细胞 ( PCE)与正红细胞 ( NRBC)的比值、微核率 ;染色体的畸变类型和畸变率 ,检测海洋低温碱性蛋白酶的诱变作用。结果表明 ,皮下注射环磷酰胺的小鼠 ,P/ N比值 <1,微核率为 2 2 .97‰ ,染色体畸变率为 18.32 % ,与生理盐水 ( NS)对照组比较差异极显著 ( P<0 .0 1) ,而海洋低温碱性蛋白酶各组小鼠微核率均 <4‰ ,染色体畸变率为 0 .19%～0 .2 5% ,与 NS组比较无显著性差异 ( P>0 .0 5)。未见海洋低温碱性蛋白酶各组对小鼠骨髓细胞的遗传毒性。

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶的应用研究Ⅱ.——洗涤剂用包覆型酶的配伍特性与应用效果评价

论述了洗涤剂中的低温碱性蛋白酶的物理和化学特性、去污性能及它与常规洗涤助剂的配伍性。实验结果表明 ,该包覆型酶最适反应温度为 35℃ ,p H为 10。在温度 4 0℃以下、p H5～ 11范围内均具有良好的稳定性 ,同时对低温有突出的适应性和抗氧化稳定性 ;与常规洗涤剂各成分配伍性良好 ,且低温条件下能有效地降解蛋白污渍 。

低温碱性蛋白酶高产菌株的选育与发酵条件研究

利用实验室保藏的枯草芽孢杆菌为出发菌株,采用紫外诱变进行选育,得到1株低温碱性蛋白酶的高产菌株,编号为B.Sub3.采用摇瓶液体发酵方式,考察碳源、氮源等营养条件及温度、发酵时间等发酵条件对发酵的影响,结果表明以上因素对低温碱性蛋白酶的生产均有影响.在单因素基础上设计4因素3水平的正交实验,确定B.Sub3的最佳发酵条件为:葡萄糖5 g/L,蛋白胨5 g/L,酵母粉3 g/L,pH=8.0,接种比例为5%,50 mL三角瓶装液量为20 mL,32℃发酵28 h,发酵液的低温蛋白酶活力为2 231 U/mL.

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶发酵过程动力学研究

应用自动控制发酵设备 ,对黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130碱性蛋白酶发酵动力学和工艺条件进行了研究。从基本的动力学概念和方程出发 ,通过分批发酵试验摸索了黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130生长与代谢的基本规律 ,证明了发酵过程中低温碱性蛋白酶的形成为生长部分关联型。采用补料分批培养方法限制生长基质浓度 ,确定其一系列参数值 。

产低温碱性蛋白酶黄海黄杆菌YS-9412-130高产菌株的选育

以黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130菌株为出发株 ,经亚硝基胍、硫酸二乙酯、紫外线 ( UV)与微波( MI)复合诱变和自然选育 ,获得 1株产低温碱性蛋白酶高产稳定的突变株 YS- 94 12 - 130 - SW1- 10 4 ,其产低温碱性蛋白酶为出发株的 16倍。在摇瓶发酵培养条件下 ,酶活力达 2 32 0 U/ ml( 2 0℃测定 ) ,该诱变株具有 Refr、Strr、Ampr和 Met-、Lys-标记。突变株与出发菌株在细胞形态上比较 。