鸡不同肠段碱性氨基酸转运载体mRNA表达的差异性研究

为研究肉鸡肠道不同肠段碱性氨基酸转运载体rBAT(系统b0,+)、y+LAT2(系统y+L)、CAT1(系统y+)、CAT4(系统y+)mRNA表达的差异性,以快大型黄羽肉鸡为动物模型,采集30日龄接近平均体重黄羽肉鸡的十二指肠、空肠、回肠和结直肠样品,采用相对定量RT-PCR方法研究不同肠段rBAT、y+LAT2、CAT1、CAT4mRNA表达丰度。结果显示:结直肠rBAT、y+LAT2的mRNA表达丰度极显著低于十二指肠、空肠和回肠(P<0.01),其在回肠表达丰度高于空肠、十二指肠,差异不显著(P>0.05)。结直肠CAT1 mRNA表达丰度极显著高于十二指肠、空肠和回肠(P<0.01),回肠极显著高于空肠(P<0.01),高出十二指肠27.9%(P=0.111)。结直肠CAT4 mRNA的表达丰度极显著高于其他各个肠段(P<0.01),十二指肠、空肠、回肠CAT4 mRNA的表达丰度依次降低,但相互之间无显著差异。结果表明,位于肠上皮黏膜细胞顶端的碱性氨基酸转运系统b0,+和基底部位的系统y+L转运载体mRNA的表达在肠道中的分布类似,显著区别于系统y+。

猪肠道碱性氨基酸转运载体(CAT1)mRNA表达的组织特异性和发育性变化

本研究旨在探讨不同品种猪肠道碱性氨基酸转运载体（CAT1）mRNA表达的组织特异性和发育规律。试验选取1、7、26、30、60、90和150日龄长白和蓝塘公猪各5头（同一品种同一日龄且体重接近），共70头，测体重后屠宰，采集十二指肠、空肠、回肠和结肠组织样品。以18S基因为内标，用实时荧光定量RT-PCR法（SYBR Green Ⅰ试剂盒）检测CAT mRNA在60日龄长白猪十二指肠、空肠、回肠和结肠表达的组织特异性，以及在长白和蓝塘猪不同日龄其十二指肠、空肠、回肠表达的发育性变化。结果显示：60日龄长白猪CAT1 mRNA的表达丰度从十二指肠到回肠呈逐渐升高的趋势，到结肠开始下降，回肠极显著高于其他3个肠段（P〈0．01），十二指肠最低；十二指肠和空肠CAT mRNA的表达在1～26d（即哺乳期）都呈上升的趋势，随后都开始有所下降；蓝塘猪十二指肠CAT1 mRNA的表达丰度在150d时显著低于其他各个阶段（P〈0．05），而长白猪90和150d都显著低于其他各阶段（P〈0．05）；空肠CAT1 mRNA的表达在26～150d各阶段都差异不显著，而26d显著高于1和7d（P〈0．05）；1～60d长白和蓝塘猪回肠CAT1 mRNA的表达都呈逐渐上升的趋势，60d后都显著下降（P〈0．05）。两品种猪不同日龄时十二指肠和空肠CAT1 mRNA的表达量都没有显著差异（P〉0．05）；长白猪回肠CAT mRNA表达在26d时显著高于蓝塘猪（P〈0．05）；在90和150d时，长白猪都显著低于蓝塘猪（P〈0．05），其他各阶段没有显著差异。结果说明，CAT mRNA在不同肠段及不同发育阶段的表达存在明显的差异，这可能与肠腔中氨基酸的浓度和氨基酸的需要水平及相关激素水平有关。

不同浓度赖氨酸对猪肠黏膜上皮细胞碱性氨基酸转运载体mRNA表达的影响

研究通过建立猪肠黏膜上皮细胞(Intestinal epithelial cells,IEC)原代培养的方法,研究了赖氨酸对体外培养的猪小肠黏膜上皮细胞碱性氨基酸转运载体mRNA表达的影响。用机械刮取初生仔猪小肠黏膜加胶原酶Ⅱ消化的方法,成功地在体外培养了新生仔猪IEC;分别用浓度为0、2、8mmol/L赖氨酸处理细胞96h,提取细胞总RNA,采用实时荧光定量PCR方法,检测了碱性氨基酸转运载体在不同处理细胞中的表达丰度。结果表明:高浓度的赖氨酸对CAT-1 mRNA的表达有上调作用,差异极显著(P<0.01),并且呈剂量依赖效应;不同浓度的赖氨酸对CAT-2 mRNA的表达影响不大,8mmol/L和2mmol/L赖氨酸组CAT-2 mRNA的表达丰度均有低于0mmol/L的趋势,但二者之间差异不显著(P>0.05);不同浓度的赖氨酸对y+LAT1 mRNA表达影响差异不显著(P>0.05);高浓度的赖氨酸可提高4F2hc mRNA的表达;0mmol/L和2mmol/L赖氨酸组4F2hc mRNA的表达丰度均低于8mmol/L,且差异显著(P<0.05);0mmol/L和2mmol/L赖氨酸组之间差异不显著(P>0.05)。

碱性氨基酸转运载体的研究进展

碱性氨基酸转运载体广泛分布于动物机体中,并对动物机体内氨基酸的转运和调节起着重要作用,其变异会导致胱氨酸尿症、赖氨酸尿性蛋白不耐症等疾病,引起氨基酸吸收代谢紊乱。综述了碱性氨基酸转运载体的结构、表达、功能及其调节的研究进展。

兔抗鸡碱性氨基酸转运载体b^(0,+)AT多克隆抗体的制备及其效价和特异性分析

为了获得兔抗鸡碱性氨基酸转运载体b0,+AT多克隆抗体,并对多克隆抗体进行特异性分析,本试验利用鸡b0,+AT cDNA全序列(GenBank登录号HQ338713)进行生物信息学分析,预测其蛋白质理化性质、跨膜区域、二级结构及抗原表位,并设计出1段抗原多肽;构建鸡pET-32a(+)-b0,+AT质粒,原核表达融合蛋白经纯化后,注射于新西兰大白兔,经3次加强免疫后,制备兔抗鸡b0,+AT多克隆抗体,并采用酶联免疫分析(ELISA)和蛋白质免疫印迹(Westernblot)技术分析其效价和特异性。结果如下:1)鸡肠道b0,+AT分子质量为53.8 ku,等电点为8.27,编码493个氨基酸,其中含33个强碱性氨基酸残基(K、R)、28个强酸性氨基酸残基(D、E)、235个疏水性氨基酸残基(A、I、L、F、W、V)、122个极性氨基酸残基(N、C、Q、S、T、Y);经推测,b0,+AT有12个跨膜螺旋结构,由32.05%α-螺旋、25.96%延伸链和41.99%无规则卷曲组成。2)成功构建了鸡pET-32a(+)-b0,+AT质粒并获得兔抗鸡b0,+AT多克隆抗体,抗体效价可达到1∶204 800,且特异性较好。3)利用制备的兔抗鸡b0,+AT多克隆抗体作为一抗,肠道组织膜蛋白为抗原,采用Western blot验证获得预期的特异性条带,一抗稀释比例为1∶4 000。结果提示,本试验成功制备了与膜蛋白b0,+AT特异性较好的多克隆抗体,同时其在鸡肠道组织中具有较好的应用效果。

草鱼碱性氨基酸转运载体y^＋ LAT2 cDNA基因克隆与表达

利用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)方法,克隆y+LAT2基因cDNA序列,并利用实时荧光定量PCR探讨y+LAT2在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)各组织中的表达情况以及饥饿对其mRNA的影响。结果表明,获得的y+LAT2基因的cDNA序列片段为1849bp,含1371bp的核心序列,编码456个氨基酸。预测草鱼氨基酸序列与斑马鱼(Danio rerio)的同源性高达96.5%,与哺乳动物和两栖动物的同源性在78%～83%,构建的系统进化树与传统形态学分类一致。在草鱼的肌肉、脑、鳃、心、肾脏、肝、后肠、中肠、前肠、脾脏组织均检测到y+LAT2基因的表达。草鱼脾脏、肾脏以及前肠、中肠的y+LAT2 mRNA表达水平对禁食的反应不同,在短期饥饿(14d)期间,其y+LAT2 mRNA表达水平均呈下降趋势。草鱼碱性氨基酸转运载体y+LAT2基因全长cDNA序列的获得,有利于进一步探讨鱼类氨基酸的吸收转运机制。

碱性氨基酸转运载体基因在骨骼肌中的表达规律及其调控

骨骼肌是机体的重要组成成分,与生命体的生长、运动和代谢等密切相关。研究表明,骨骼肌质量的增加主要依赖于蛋白质合成与降解的相对速率,而蛋白质合成的效率与饲粮氨基酸的组成和含量直接相关。赖氨酸(Lys)等碱性氨基酸作为动物体限制性或必需氨基酸,其吸收利用效率对动物的生长发育至关重要。前期研究发现,碱性氨基酸转运载体(CATs)是细胞吸收碱性氨基酸的主要转运载体,在Lys、精氨酸等碱性氨基酸的吸收过程中发挥重要作用。本文就CATs的分类、功能、表达规律及其调控机制等方面进行综述,为机体氨基酸的高效利用和肌肉生长发育调控提供理论参考。

氨基酸转运载体的研究进展

氨基酸转运载体是介导氨基酸跨膜转运的膜蛋白,在医学、营养等生命科学领域有着重要的研究意义。本文就氨基酸转运载体家族成员及组织分布,生物学特征、生理功能和影响因素等方面进行了综述。

不同品种肉鸡肠道rBAT和y^＋LAT2 mRNA表达的发育性变化

选用遗传背景相同的1日龄父母代雄性Arbor Acre(AA)和父母代雄性岭南黄肉雏鸡各160羽,采用相对定量RT-PCR方法,以AA肉鸡和岭南黄肉鸡十二指肠、空肠和回肠样品为模板,研究不同品种肉鸡肠道碱性氨基酸转运载体rBAT和y+LAT2 mRNA表达的发育性变化。结果显示:十二指肠和空肠rBAT和y+LAT2 mR-NA表达的发育性变化与回肠有着较大的差异。不同品种肉鸡rBAT和y+LAT2 mRNA在十二指肠和空肠的表达具有相同的发育模式,从2~30 d不断升高,44 d下降,55 d回升;岭南黄肉鸡rBAT和y+LAT2 mRNA表达丰度的变化幅度小于AA肉鸡,AA肉鸡rBAT和y+LAT2 mRNA表达丰度在2~30 d时均高于岭南黄肉鸡。回肠rBAT和y+LAT2 mRNA表达的发育性变化在岭南黄肉鸡和AA肉鸡间有显著差别,岭南黄肉鸡回肠rBAT和y+LAT2 mRNA表达在后期(30~58 d)高于前期(2~16 d);而AA肉鸡回肠rBAT和y+LAT2 mRNA表达在58d显著高于其它时间点,在16 d时最低。以上结果说明:(1)十二指肠和空肠rBAT、y+LAT2 mRNA表达的发育性变化与回肠有着较大的差异,这表明肠道近端和远端在碱性氨基酸吸收的功能上可能有差异;(2)不同品种肉鸡十二指肠和空肠rBAT、y+LAT2 mRNA的表达具有相同的发育模式,但在时间点上有一定的差异,而与回肠的表达模式不同,表明rBAT和y+LAT2 mRNA的表达受到发育阶段、品种和肠段的影响;(3)回肠rBAT和y+LAT2mRNA表达的发育性变化在岭南黄肉鸡和AA肉鸡间有显著差别。

不同基因型肉鸡肠道CAT1和CAT4 mRNA表达的发育性变化

选用遗传背景相同的1 d父母代雄性Arbor Acre（AA）和父母代雄性岭南黄肉雏鸡各160羽,采用相对定量RT-PCR方法,以AA肉鸡和岭南黄鸡十二指肠、空肠和回肠样品为模板,研究不同基因型肉鸡肠道CAT1和CAT4mRNA表达的发育性变化。结果显示：十二指肠和空肠CAT1和CAT4mRNA表达的发育性变化与回肠有着较大的差异;岭南黄肉鸡十二指肠和空肠CAT1和CAT4 mRNA表达的发育性变化与AA肉鸡分别有显著差别;岭南黄肉鸡十二指肠和空肠CAT1 mRNA表达从2~58d逐渐降低,AA肉鸡除在44d有所降低,在其他时间点的表达丰度基本一致;岭南黄肉鸡十二指肠和空肠CAT4 mRNA从2~44d有降低的趋势,58d有所回升,AA肉鸡在58d的丰度最低,其他时间点的表达丰度基本一致;岭南黄肉鸡回肠CAT1 mRNA的表达丰度在2~44d呈逐渐降低的趋势,58和44d接近,而AA肉鸡则在58d达到最高,其他时间点接近;2~44d岭南黄肉鸡回肠中CAT4 mRNA表达的发育性变化与AA肉鸡一致,但58d出现差异,AA肉鸡降到最低而岭南黄肉鸡显著上升。以上结果说明：十二指肠与空肠中CAT1和CAT4 mRNA表达的发育性变化与回肠有着较大的差异,这表明肠道近端和远端在碱性氨基酸吸收的功能上可能有所差异;不同基因型肉鸡十二指肠、空肠和回肠CAT1和CAT4 mRNA表达的发育模式不同,表明CAT1和CAT4 mRNA表达受到发育阶段、品种和肠段的调控。

不同品种肉鸡肠道rBAT和y+LAT2 mRNA表达的发育性变化

选用遗传背景相同的1日龄父母代雄性Arbor Acre(AA)肉仔鸡和父母代雄性岭南黄肉雏鸡各160羽,采用相对定量RT-PCR方法,以AA肉鸡和岭南黄肉鸡十二指肠、空肠和回肠样品为模板,研究不同品种肉鸡肠道碱性氨基酸转运载体rBAT和y+LAT2 mRNA表达的发育性变化。结果显示,十二指肠和空肠rBAT和y+LAT2 mRNA表达的发育性变化与回肠有着较大的差异。不同品种肉鸡rBAT和y+LAT2 mRNA在十二指肠和空肠的表达具有相同的发育模式,从2～30d不断升高,44d下降,55d回升;岭南黄肉鸡rBAT和y+LAT2 mRNA表达丰度的变化幅度小于AA肉鸡,AA肉鸡rBAT和y+LAT2 mRNA表达丰度在2～30d时均高于岭南黄肉鸡。回肠rBAT和y+LAT2 mRNA表达的发育性变化在岭南黄肉鸡和AA肉鸡间有显著差别,岭南黄肉鸡回肠rBAT和y+LAT2的mRNA表达在后期(30～58d)高于前期(2～16d);而AA肉鸡回肠rBAT和y+LAT2 mRNA表达在58d显著高于其他时间点,在16d时最低。以上结果说明:①十二指肠和空肠rBAT、y+LAT2 mRNA表达的发育性变化与回肠有着较大的差异,这表明肠道近端和远端在碱性氨基酸吸收的功能上可能有差异;②不同品种肉鸡十二指肠和空肠rBAT、y+LAT2 mRNA的表达具有相同的发育模式,但在时间点上有一定的差异,而与回肠的表达模式不同,表明rBAT和y+LAT2 mRNA的表达受到发育阶段、品种和肠段的影响;③回肠rBAT和y+LAT2 mRNA表达的发育性变化在岭南黄肉鸡和AA肉鸡间有显著差别。

CAT1基因在尼罗罗非鱼肌肉和肝的节律性表达研究

为了探究碱性氨基酸转运载体(CAT1)基因在尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)饥饿0、7 d肌肉和肝的昼夜表达规律,实验分别在尼罗罗非鱼饥饿0,7 d 06:00、09:00、12:00、15:00、18:00、21:00和24:00、第2天03:00、06:00,分别对应区时(Zone time,ZT)ZT0、ZT3、ZT6、ZT9、ZT12、ZT15、ZT18、ZT21、ZT24采样,采样在一昼夜内完成。每组随机取3尾鱼进行解剖,取其肌肉和肝样品分析。结果表明:CAT1基因在正常投喂的尼罗罗非鱼肌肉表达具有显著性时间差异(p<0.05),呈现昼低夜高的节律性振荡(p<0.3),达到峰值的时间为ZT 0.72。饥饿7 d后,虽然在各时间点上CAT1基因表达有显著性差异(p<0.05),但无昼夜节律性(p>0.3);CAT1基因表达为在光周期先升后降,在暗周期先降后升,峰值相位在光照阶段,为ZT 7.44。在尼罗罗非鱼肝中,CAT1基因在正常投喂时表达具有显著性时间差异(p<0.05),呈现节律性振荡(p<0.3),CAT1基因表达为在光周期先降后升,在暗周期则先升后降,峰值相位在黑暗阶段,达到峰值的时间为ZT 16.56。饥饿7 d后,在各时间点上CAT1基因表达无显著性时间差异(p>0.05),且表达无昼夜节律性(p>0.3);CAT1基因表达为在光周期先降后升,在暗周期则先升后降,峰值相位在黑暗阶段,为ZT 21.60。以上结果说明CAT1基因在尼罗罗非鱼肌肉和肝表达的昼夜节律不同。