碱性磷酸酶单克隆抗体对大鼠血管源性脑水肿的治疗作用

目的 观察碱性磷酸酶单克隆抗体 ( AAP)对大鼠血管源性脑水肿 ( VCE)的治疗作用。方法 60只大鼠随机分为正常组、VCE组与 AAP组。用 AAP注射到已制成的 VCE模型的 Wistar大鼠腹腔 ,通过远红外线水分分析仪分别测定各组脑灰、白质水分含量百分比。用 Evan' s blue( EB)测定血脑屏障 ( BBB)的通透性。结果 AAP组对减少 VCE大鼠脑灰、白质水分含量 ,降低 BBB通透性均有显著效果 (均 P <0 .0 1) ,而与正常组比较无显著差异 ( P >0 .0 5 )。结论 AAP具有治疗 VCE的作用 。

用铟-Ⅱ标记胎盘碱性磷酸酶单克隆抗体检查睾丸、卵巢及宫颈肿瘤

作者筛选出一种新的胎盘碱性磷酸酶（PLAP）和睾丸类胎盘样碱性磷酸酶的单克隆抗体(H17E2)。H17E2对PLAP—阳性肿瘤具有高度反应性,但对健康组织反应性极低。已证实用钢-Ⅲ作放射标记的H17E2对肿瘤与健康器官（肝脏除外）,能产生比放射性碘标记更好的对比效果。作者用铟-Ⅲ标记的H17E2检查15例患者,年龄21～70岁（平均40岁）,其中8例诊断为睾丸肿瘤,6例为卵巢肿瘤,1例为宫颈肿瘤。H17 E2源于小鼠IgGI。它靠环酐与二—乙撑三—胺（diethylenetriamine）五—乙酸相偶联。

抗小鼠SHP-1、SHP-2和SHIP三种蛋白酪氨酸磷酸酶单克隆抗体的制备及鉴定

为了制备抗小鼠蛋白酪氨酸磷酸酶的单克隆抗体（mAb），分别以SHP-1、SHP-2和SHIP重组蛋白为抗原免疫BALB／c小鼠，通过B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗相应磷酸酶的mAb。用Western blot检测mAb对重组蛋白和细胞中天然磷酸酶的反应性。共获得12株可稳定分泌抗磷酸酶mAb的杂交瘤细胞株。其中6株可分泌抗SHP—1 mAb（LX～SHPl．1～LX—SHP1．6），3株可分泌抗SHP-2 mAb（LX—SHP2．1～LX—SHP2．3），3株分泌抗SHIP mAb（LX—SHIP1～LX—SHIP3）。LX-SHP1．2～LX—SHP1．6，LX-SHP2．1和LXSHP2．3，以及LX—SHIP2和LX—SHIP3可应用于相应重组蛋白的Western blot检测。LX-SHP1．5，LX—SHP2，3，以及LX—SHIP2在EL-4细胞及原代T细胞相应天然磷酸酶分子的Western blot检测中有较好的实验效果。

宫颈酸性磷酸酶CAP单克隆抗体的制备及CAP在早期宫颈癌筛查中的临床意义

目的制备出宫颈酸性磷酸酶蛋白(CAP)的单克隆抗体,并对其相关的生物学特性进行鉴定;同时应用Mark-Pap试剂盒检测患者宫颈涂片中的CAP表达,并与TCT制片诊断确诊结果进行比较。方法将CAP蛋白免疫Balb/c雌性小鼠,常规聚乙二醇介导融合,以间接ELISA方法筛选阳性克隆,有限稀释法亚克隆筛选单克隆细胞株,并使用秋水仙素对其核型进行鉴定,使用ISO-2鼠源单克隆抗体亚型检测试剂盒检测其亚类,并检测其效价、特异性等;用Mark-PAP试剂盒检测CAP蛋白在350例行常规妇科体检女性宫颈组织细胞中的表达,细胞内出现红色沉淀即为CAP阳性,并与TCT制片诊断确诊结果进行比较。结果筛选出能够稳定分泌抗CAP单抗的杂交瘤细胞株1B11和3C12,其单克隆抗体的亚型经鉴定为IgG2b和IgG1,抗体的效价在106以上;宫颈酸性磷酸酶在宫颈癌患者组织细胞中呈阳性表达,而正常的子宫颈上皮细胞及炎症细胞中无CAP表达,差异有统计学意义(P<0.05)。结论本实验制备出了CAP蛋白单克隆抗体1B11和3C12;CAP在1例高度鳞状上皮内病变患者和1例确诊为早期宫颈鳞癌患者的组织切片中呈阳性表达,提示宫颈酸性磷酸酶在宫颈癌早期诊断中可能具有指导意义。

前列腺酸性磷酸酶单克隆抗体的制备及临床应用

作者应用纯化的前列腺酸性磷酸酶(PAP)免疫BALB/c小鼠,制备了4株分泌PAP-McAb的杂交瘤细胞株。应用PAP-McAb建立了免疫化学法测定血清中的PAP。318例正常男性,血清中PAP为0～1.6ng/ml。9例病理确诊的前列腺癌。有7例阳性,阳性率为77.8％,而同时应用化学法测定血清中的酸性磷酸酶(ACP),阳性率只有44.4％。

抗人双特异性磷酸酶DUSP18单克隆抗体的制备及鉴定

双特异性磷酸酶(Dual Specificity Phosphatase)是酪氨酸磷酸酶家族中的一员,这个家族中的成员既能对磷酸化酪氨酸去磷酸化,也能对磷酸化丝/苏氨酸去磷酸化.此外,它们还在有丝分裂原激活蛋白磷酸酶信号途径(MAPK)中起重要生理功能.为了制备抗人双特异性磷酸酶的单克隆抗体(mAb),以DUSP18重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,通过B淋巴细胞杂交瘤技术制备抗相应磷酸酶的mAb.用Western blot检测mAb对重组蛋白和细胞中天然磷酸酶的反应性,共获得6株可稳定分泌抗磷酸酶mAb的杂交瘤细胞株,为进一步研究双特异性磷酸酶的去磷酸化作用机理以及其在有丝分裂原激活蛋白磷酸酶信号途径(MAPK)中的信号转导提供强有力的工具.

基于纳米抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的一步酶联免疫吸附分析法检测黄曲霉毒素B_1

从噬菌体展示的抗黄曲霉毒素B1(AFB_1)纳米抗体文库中,通过四轮亲和淘选,得到抗AFB_1纳米抗体G8。将编码纳米抗体G8的基因与碱性磷酸酶(AP)基因融合,构建了重组融合表达载体pET25b(+)-G8-AP,将其转化大肠杆菌BL21(Rosetta,DE3)感受态细胞,异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导融合基因表达。SDS-PAGE结果表明,融合蛋白G8-AP为可溶性表达,Ni^(2+)-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白,对硝基苯磷酸二钠(pNPP)法测得纯化后的G8-AP的碱性磷酸酶比活力为(364.5±8.3)U/mg。ELISA检测结果表明,G8-AP具有特异识别AFB1的活性,与其它真菌毒素(AFB_2、AFG_1、AFG_2、脱氧雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、伏马菌素B_1)无交叉反应。基于G8-AP建立了检测AFB1的一步ELISA法。在优化的条件下,即甲醇浓度20%、盐离子浓度20 mmol/L、pH 7.4条件下,方法的半数抑制浓度(IC_(50))为19.8 ng/mL,线性范围为4.3~92 ng/mL,检出限为2.6 ng/mL。对玉米和小麦样品加标回收实验结果表明,基质对本方法的干扰不明显,可用于实际样品检测。

单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的制备

目的 :制备单链抗体 碱性磷酸酶融合蛋白。方法 :把碱性磷酸酶编码区插入pSTE2 8E5质粒DNA ,用scFvC6 6的重链和轻链可变区DNA取代scFv 8E5的重链和轻链可变区DNA ,构成表达载体pSTE2 C6 6 Ap在大肠杆菌中表达 ,用聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法分析产物活性。结果 :获得一个分子量为 75kD的scFvC6 6 Ap融合蛋白 ,可结合来自KG1a细胞裂解物中的一个分子量约 6 0kD的蛋白质带 ,其结合功能可通过其碱性磷酸酶活性直接测定。结论 :建立了一个用大肠杆菌制备单链抗体 碱性磷酸酶融合蛋白的方法 ,它可能取代常规的碱性磷酸酶标记方法而用于免疫检测。

重组人碱性成纤细胞生长因子单克隆抗体的制备、鉴定及初步应用

目的制备重组人碱性成纤维细胞生长因子(recombinant human basic fibroblast growth factor,rhbFGF)单克隆抗体,鉴定其特性,建立双抗体夹心ELISA检测方法。方法以rhbFGF为免疫原,免疫Balb/c小鼠,通过细胞融合技术建立能稳定分泌抗rhbFGF杂交瘤细胞株,制备抗rhbFGF单克隆抗体,采用Ig亚类ELISA试剂盒鉴定抗体亚类,间接ELISA法检测抗体效,Western blot鉴定抗体特异性。HRP标记McAb并建立夹心ELISA检测方法。结果获得2株(分别命名2D3、5F7)可分泌特异性McAb的强阳性细胞株,腹水抗体效价在10-5以上,IgG亚类均为IgG1,轻链为K链。Western blot证明2株McAb特异性良好,双抗体夹心ELISA检测rhbFGF最低检测限达到2 ng/ml。结论成功制备高效价的抗rhbFGF单克隆抗体,建立抗rhbFGF双抗体夹心ELISA定量检测方法。

抗玉米赤霉烯酮毒素单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的表达

根据抗玉米赤霉烯酮毒素单链抗体的氨基酸序列及大肠杆菌偏爱密码子,用重叠延伸PCR法合成了单链抗体的重链和轻链,经(Gly4Ser)2Linker连接,获得完整的单链抗体基因ZEN2 scFv。将ZEN2 scFv与碱性磷酸酶(AP)编码序列连接形成融合蛋白基因ZEN2 scFv-AP,构建到pET载体,转化大肠杆菌菌株BL21(DE3),经IPTG诱导表达及亲和层析纯化,在SDS-PAGE和Western blot分析中均检测到1条分子质量为75 ku的可溶性蛋白条带,ELISA分析证实,细菌表达的ZEN2 scFv-AP融合蛋白具有碱性磷酸酶活性。这一研究结果为建立快速、灵敏、经济的玉米赤霉烯酮毒素的ELISA检测奠定了基础。

碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体ELISA微量检测技术

目的:用本室制备的单克隆抗体建立间接ELISA检测微量bFGF的技术。方法:将抗重组牛碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的杂交瘤细胞株,经再克隆化,选择高亲和力的抗bFGF杂交瘤细胞2H2。用ProteinA亲和层析法对2H2腹水型单抗进行纯化。结果:用2H2mAb建立了高灵敏度的间接、竞争ELISA检测bFGF方法,灵敏度分别达到10和1.0pg/孔,并用间接ELISA检测神经胶质瘤细胞SWO38上清中的bFGF含量。结论:为实验研究和临床应用提供了微量bFGF的检测方法。

碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体联合洛铂对肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

目的:研究碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体(monoclonal antibody to basic fibroblast growth factor,b FGF m Ab)联合洛铂(lobaplatin,LBP)对肺癌A549细胞增殖和凋亡的影响及其可能机制。方法:CCK-8法检测药物对A549细胞活性的影响。Annexin V-FITC/PI检测细胞凋亡率。激光共聚焦显微镜观察细胞核的形态。Western blotting检测细胞内凋亡相关蛋白表达。结果:CCK-8法检测结果显示,细胞培养48 h后,bFGF mAb组和LBP组的细胞增殖受到抑制,但两药联用后的增殖抑制作用明显高于单用LBP及bFGF mAb(P<0.05)。Annexin V-FITC/PI结果显示,联合组早期、晚期凋亡率分别为(27.83±1.23)%和(39.32±1.01)%,与b FGF mAb的(6.25±0.19)%、(14.54±0.25)%和LBP的(16.54±0.39)%、(21.02±0.98)%相比,明显高于单药组的抑制率(P<0.01)。激光共聚焦显微镜显示联合用药诱导的细胞核裂解率较单用b FGF m Ab及LBP的细胞核裂解率明显增多。Western blotting检测结果显示联合组BAX、Caspase-3、Caspase-9、PARP表达量较药物单用组明显增加,而Bcl-2、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9、cleaved-PARP表达量明显降低。结论:b FGF m Ab联合LBP通过抑制Bcl-2、cleaved-Caspase-3、cleaved-Caspase-9、cleaved-PARP表达,上调BAX、Caspase-3、Caspase-9和PARP蛋白表达,对肺腺癌A549细胞起到抑制增殖和诱导凋亡的作用。

抗HBsAg-碱性磷酸酶双功能抗体分子的构建

为构建带有碱性磷酸酶活性的双功能基因工程抗体 ,用PCR方法克隆大肠杆菌碱性磷酸酶基因 ,通过酶切分析和DNA序列测定核实后 ,将其重组到抗乙肝表面抗原 (HBsAg)Fab段的Fd羧基端 ,构建重组融合蛋白表达载体pHBFAP ,转化大肠杆菌XL1 Blue ,经异丙基硫代 β D 半乳糖苷诱导表达后 ,采用ELISA法检测到培养上清中存在与HBsAg的结合活性和碱性磷酸酶的催化活性 ,显示抗HBsAg 碱性磷酸酶双功能抗体分子在大肠杆菌中获得了表达 .

抗克伦特罗单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白表达条件的初步研究

初步研究抗克伦特罗单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白(CBLscFv-AP)的表达条件,提高CBLscFv-AP融合蛋白的表达量。采用液体发酵法培养抗克伦特罗单链抗体-碱性磷酸酶融合蛋白(CBLscFv-AP)基因工程菌,研究不同宿主菌、初始pH、诱导时期、诱导时间和培养基对CBLscFv-AP融合蛋白表达量的影响以及重组质粒的稳定性。选用E·coliBL21(DE3)pLysS为宿主菌,在初始pH为7·4的LB培养基中培养至A600nm为0·8～0·9时,诱导表达8h,为CBLscFv-AP融合蛋白最佳表达条件。而且重组质粒pBV220-scFv-phoA具有较好的结构稳定性。在该表达条件下,提高了CBLscFv-AP融合蛋白的表达量,为进行大规模发酵生产CBLscFv-AP融合蛋白奠定基础。

鲨鱼单域抗体-碱性磷酸酶融合蛋白的表达及热稳定性分析

酶标抗体的稳定性对酶联免疫吸附实验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)至关重要,但常规化学偶联方法制备的酶标抗体具有热稳定性不足的缺点,这限制了酶标抗体在ELISA中的应用。本研究利用基因工程技术克隆表达出碱性磷酸酶与特异性鲨鱼单域抗体的融合蛋白,并对融合蛋白的亲和力和热稳定性进行了研究。结果表明:在16℃下,0.05 mmol/L的异丙基β-D-1-硫代半乳糖苷(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导可实现融合蛋白的可溶性表达,表达出的融合蛋白分子量约为63 kDa,与目标抗原的亲和常数可达7.80×10^(-8) mol/L,具有良好的抗原结合能力;融合蛋白在58℃处理180 min后热稳定性良好,证明该融合蛋白可以作为ELISA检测中一种潜在的免疫诊断剂。

碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体在小鼠体内药代动力学研究

目的研究碱性成纤维细胞生长因子单克隆抗体(basic fibroblast growth factor monoclonal antibody,bFGF-mAb)在小鼠体内的药代动力学特征。方法首先制备bF-GF-mAb并纯化,然后用氯胺T法制备125I-bFGF-mAb,γ放射免疫计数仪检测三氯醋酸(TCA)沉淀前后血浆、组织的放射性计数,用3P97软件拟合药代动力学房室模型,并计算相应药代动力学参数。结果氯胺T法制备的125I-bFGF-mAb,其放化纯度≥98%,TCA沉淀率(90.8±10.2)%。T12α为0.1～0.2 h,T12β为1.05～1.84 h和T 12γ为81.6～90.3 h。125 I-bFGF-mAb在小鼠的心、肝、肺等组织器官中有较高的放射性计数,在脑和眼中放射性计数较低。结论 125I-bFGF-mAb的药代动力学符合三室模型,且具有组织分布特异性。

抗HBS-碱性磷酸酶双功能抗体的分析及试用

抗ＨＢＳ－碱性磷酸酶双功能抗体的分析及试用①１０００３７北京海军总医院高荣凯王琰刘克金化冰朱迎春刘群英陈宇萍关键词肝炎表面抗原，乙型；碱性磷酸酶；双功能抗体中国图书资料分类号Ｒ４４６．６１酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）在对微量抗原或抗体的检测中具有重...

抗HBsAg碱性磷酸酶双功能抗体的构建及对临床标本的初步检测

酶联免疫吸附试验(ELISA)在对微量抗原或抗体的检测中具有重要意义,酶标记物主要是抗体,其标记酶一般为辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AP),常规的酶标抗体都是采用化学交联方法制备的,需要交联、纯化等多步蛋白质操作,易失活、成本高。随着分子生物学技术的发展,采用基因工程方法可将抗体基因和酶基因融合表达,获得既有抗体的抗原结合活性又有酶的催化活性的双功能抗体融合蛋白,不仅易于大量制备、成本低。