枯草杆菌蛋白酶E的蛋白质工程

用定点突变和随机突变的方法，对枯草杆菌碱性蛋白酶Ｅ基因进行改造。突变后的基因插入大肠杆菌枯草杆菌穿梭质粒ｐＢＥ２中，在碱性和中性蛋白酶缺陷型的枯草杆菌ＤＢ１０４中进行表达，得到突变种的碱性蛋白酶，它们的突变位点分别是（Ｍ２２２Ａ）、（Ｍ２２２Ａ、Ｎ１１８Ｓ）、（Ｍ２２２Ａ、Ｎ１１８Ｓ、Ｑ１０３Ｒ）、（Ｍ２２２Ａ、Ｎ１１８Ｓ、Ｑ１０３Ｒ、Ｄ６０Ｎ）。各突变种酶的性质测定结果表明，Ｍ２２２Ａ突变使酶抗氧化，Ｎ１１８Ｓ突变使酶增加热稳定性，Ｑ１０３Ｒ和Ｄ６０Ｎ突变虽然能增加酶的比活，但使酶的热稳定性大大下降，尤其是Ｄ６０Ｎ突变使酶变得极不稳定。野生型碱性蛋白酶与（Ｍ２２２Ａ）突变种的等电点均为８９２，而（Ｍ２２２Ａ，Ｎ１１８Ｓ），（Ｍ２２２Ａ，Ｎ１１８Ｓ，Ｑ１０３Ｒ）和（Ｍ２２２Ａ，Ｎ１１８Ｓ，Ｑ１０３Ｒ，Ｄ６０Ｎ）突变酶分别为８８８，９１０和９１７。用ＮｓｕｃＡＡＰＦｐＮＡ作为底物时酶反应最适ｐＨ值为７５～９５，而用酪蛋白作底物时最适ｐＨ值为１０～１２。

非纯培养物细菌蛋白酶DNA片段的克隆与表达(英文)

为了构建更多的蛋白酶基因工程菌，以及进行蛋白酶基因的直接进化研究，从非纯培养细菌总DNA中扩增各种编码蛋白酶的DNA片段．根据MEROPS和GenBank数据库中的枯草杆菌类蛋白酶的编码区和成熟肽编码序列设计并合成了10条引物．富集培养胞外蛋白酶产生菌并提取了12个总DNA样品，分别用每对引物在降落PCR（Touchdown PCR，TD-PCR）条件下进行蛋白酶编码序列的扩增．选择了19个长800～1200bp的扩增片段测序，其结果为：8个是蛋白酶DNA片段，它们应属于4种不同的蛋白酶基因序列；同一对引物扩增到的基因序列差异性可达到32％，说明只使用基于已知序列的PCR方法从混合菌中获得新蛋白酶基因是可行的．将克隆到的1个与碱性蛋白酶E（GenBank No．AJ539133）的编码区99％相似的蛋白酶DNA片段插入pTWIN1载体，在大肠杆菌ER2566中进行表达．结果表明，表达的成熟蛋白酶可分泌到培养基中，能在牛奶平板上产生水解圈，对大肠杆菌有致死作用．