大蒜2个中性/碱性转化酶基因AsNI的克隆与表达分析

中性/碱性转化酶作为植物蔗糖代谢的关键酶,主要参与植物生长发育、逆境胁迫响应等过程。为探究大蒜AsNI对逆境胁迫的响应模式,以乐都紫皮大蒜为试验材料,克隆得到2个中性/碱性转化酶基因,并进行了生物信息学和表达特性分析。结果表明,AsNI1和AsNI2的开放阅读框分别为522,1203 bp,编码173,400个氨基酸;AsNI1与AsNI2均为亲水性蛋白,预测定位于细胞质,具有Glyco_hydro_100结构域;但二者的氨基酸序列相似性仅为25.75%,AsNI2含有1个糖基化位点,而AsNI1未检测到糖基化位点,二者的亲缘关系较远。蛋白互作网络分析结果表明,AsNI2与AsNI1可能参与不同的生化过程。启动子序列分析发现,AsNI1和AsNI2的启动子区域含有多个与响应相关的顺式作用元件,其中AsNI2启动子的干旱和低温胁迫响应元件个数显著大于AsNI1。通过对启动子转录因子结合位点进行预测发现,二者含有不同种类及数量的结合位点,表明AsNI1和AsNI2可行使不同的基因功能。qRT-PCR检测发现,AsNI的表达具有明显的组织特异性,AsNI1和AsNI2分别在根和鳞茎中表达量最高。同时,逆境胁迫能够诱导AsNI表达,低温和干旱处理下均以AsNI2的响应程度强于AsNI1。其中,低温胁迫以诱导叶片AsNI2的表达为主,干旱胁迫以诱导根系AsNI2的表达为主。通过分析AsNI的序列特征和表达模式,验证了AsNI的抗逆功能。

甘蔗中性/碱性转化酶基因SoNIN1的克隆和表达分析

中性/碱性转化酶(Alkaline/Neutral Invertase)能不可逆地催化蔗糖分解为葡萄糖和果糖,在植物生长发育中起重要作用。本研究采用RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种GT28心叶中克隆到甘蔗中性/碱性转化酶基因全长cDNA序列,基因命名为SoNIN1。该基因全长2289 bp(GenBank登录号为JX109944),开放阅读框为1812 bp,编码603个氨基酸,相对分子量为67.79 kD,等电点为6.41。具有中性/碱性转化酶保守结构域,N-端不含跨膜结构和信号肽。其编码氨基酸序列与玉米、水稻和黑麦草的亲缘关系较近,属于同一进化分支。利用染色体步移技术克隆到SoNIN1基因5′侧翼启动子序列,长度为1174 bp(GenBank登录号为KC854419)。启动子序列含有多个CAAT-box和TATA-box等基本作用元件,参与分生组织特异性激活,参与干旱诱导的MYB结合位点,脱落酸、茉莉酸甲酯和赤霉素响应等作用元件。利用实时荧光定量PCR技术,在生理成熟期甘蔗茎、叶、花序和芽中均能检测到SoNIN1的表达,其表达量在叶中最高,芽中次之,而在+1节间最低。苗期根和叶中SoNIN1基因都受PEG和NaCl诱导表达。

茶树中性/碱性转化酶基因CsINV10的克隆与表达分析

基于课题组前期对茶树冷驯化系统的转录组测序分析结果,从中挑选出6条与中性/碱性转化酶基因高度相似的EST序列,电子拼接和RT-PCR验证后获得一条全长为2101 bp的核酸序列。该基因包含1923 bp的ORF,编码640个氨基酸,蛋白分子量为71.8 kD,理论等电点为5.69。根据BlastX同源性比对显示,该基因与荔枝LcNI相似性最高(80%),为G100家族成员,属于中性/碱性转化酶基因,将其命名为CsINV10(GenBank登录号为KT359348)。对CsINV10氨基酸序列的系统进化树分析显示,其与木薯MeNINV8亲缘关系最近。进一步分析显示,CsINV10的氨基酸序列无N端信号肽,无跨膜结构域,属于亲水性蛋白,并定位在叶绿体上。荧光定量PCR分析表明,CSINV10具有组织表达特异性,在茶树叶和花中的表达量最高,根系中最低。分析发现,低温(4℃)、干旱和盐胁迫分别处理茶树1 d后,成熟叶片中CsINV10的表达呈逐渐上升趋势;而在ABA条件处理下,该基因呈先升高后降低趋势,在处理5 d后基本不表达,表明该基因可能参与茶树对多种逆境胁迫的响应,这为后续进一步研究转化酶基因在茶树抗寒等逆境胁迫中的作用奠定基础。

巴西橡胶树中碱性转化酶HbNINa基因的克隆和表达模式分析

检索橡胶树EST和基因组数据库,发现了1个在叶片中高丰度表达的中碱性转化酶基因。采用RT-PCR和RACE技术获得了该基因的cDNA和基因组序列,命名为HbNINa。序列分析结果显示,HbNINa基因cDNA序列的编码区(CDS)序列长度为1 719 bp,对应的基因组序列为3 696 bp。序列分析表明,该基因编码571个氨基酸多肽,推测其分子量大小为65.7 ku,等电点为6.36。HbNINa蛋白包含植物中碱性转化酶的全部保守结构域。基因组结构分析显示HbNINa基因包含4个外显子和3个内含子。QPCR分析结果表明,HbNINa基因在在胶乳中表达水平极低,而在其他组织如树皮、树叶和雌花中的表达丰度相对较高。在叶片发育过程中,HbNINa在叶片发育的初期高丰度表达,推测HbNINa可能参与叶片蔗糖利用,进而在橡胶树叶片发育过程中起重要作用。

芒果中性/碱性转化酶MiNI基因的克隆与表达分析

采用RT-PCR技术克隆了1个编码NI基因的cDNA序列,命名为MiNI基因,并对不同来源的中性/碱性转化酶的分子特征及系统进化进行比较分析。结果表明:MiNI基因开放阅读框为2034 bp,编码677个氨基酸,相对分子量为76.6 kDa,理论等电点为6.24;生物信息学分析结果显示,NI二级结构α螺旋占38.85%,无规则卷曲占35.45%,伸展链占18.91%,β折叠占6.79%;MiNI具有glycoside hydrolase family 100结构保守域,与克里曼丁桔、龙眼、巴西橡胶树和番木瓜都具有一致的motif位点;MiNI基因编码的氨基酸序列与克里曼丁桔、龙眼氨基酸序列同源性最高;构建NI系统进化树分析表明,与芒果遗传距离最近的是克里曼丁桔,最远的是玉米和枸杞。qRT-PCR分析显示,果皮MiNI基因表达量远高于果肉;花后10~40 d,果皮MiNI基因表达量显著下降;花后40~100 d,果皮MiNI基因表达量维持在一个相对稳定水平;花后100~130 d,随着果实成熟,果皮MiNI基因表达量又显著上升;而花后10~40 d,果肉MiNI基因表达量显著下降,至果实发育后期果肉MiNI基因表达量始终处于极低水平。该研究为进一步了解MiNI基因在芒果果实蔗糖代谢过程中的作用以及从分子角度阐明芒果糖代谢机理奠定理论和技术基础。

橡胶树中碱性转化酶基因HbNIN8的克隆与表达分析

蔗糖是高等植物光合产物的重要存储方式,而转化酶和蔗糖合酶是水解蔗糖的主要酶。研究基于橡胶树的基因组和转录组数据,采用RT-PCR技术克隆到一个中碱性转化酶基因HbNIN8的全长cDNA。该基因预测编码630个氨基酸。同源和亚细胞定位分析表明,HbNIN8属于α类中碱性转化酶,叶绿体定位。应用毕赤酵母真核表达获得其重组蛋白,分析了其酶活性特点,HbNIN8在毕赤酵母中重组蛋白的最适pH为7.5,最适温度为45℃。实时荧光定量PCR分析表明,HbNIN8主要在叶片中表达,其表达量随着叶片的成熟而逐渐增加,在稳定期叶片中达到最大,在成熟叶片中,HbNIN8的表达呈现明显的昼夜差异,晚上的表达水平相对高于白天。因此,HbNIN8很可能是负责将叶绿体中的蔗糖水解为单糖,从而调控橡胶树叶绿体内蔗糖和淀粉的分配。

木薯中性/碱性转化酶基因家族11个成员在染色体上的定位

中性/碱性转化酶(Alkaline or neutral invertase,N/A-lnv)是木薯淀粉合成过程中的一种关键酶。笔者以木薯华南6号古铜期嫩叶为材料制备染色体标本,利用荧光原位杂交和原位PCR技术对N/A-lnv基因家族的11个成员进行了物理定位。结果表明,基因MeNINV5,MeNINV9和MeNINV10均位于第4号染色体上,其中基因MeNINV9和MeNINV10位于短臂上,到信号点的百分距离分别为68.52和95.35,基因MeNINV5位于长臂上,到着丝粒的百分距离为22.71;基因MeNINV4和nINV1均位于第6号染色体长臂上,到着丝粒的百分距离分别为43.16和80.71;基因MeNINV6和MeNINV7分别位于第7号和第17号染色体的长臂上,信号点到着丝粒的百分距离分别是15.38和57.97;基因MeNINV1,MeNIN,V2,MeNINV3和MeNINV8分别位于第11号、第9号、第5号和第16号染色体的短臂上,信号位点到着丝粒的百分距离分别是40.10,51.88,91.75和76.33。中性/碱性转化酶基因家族内部部分成员之间存在连锁关系。研究结果可为木薯淀粉的高效积累机制及木薯种质遗传改良提供分子细胞遗传学依据。

钙驱动的赤泥碱性稳定化调控研究进展

赤泥是铝工业生产过程中排放的强碱性固体废物,综合利用率<3%,迄今尚无经济可行的规模化消纳方法。有效抑制碱性矿物的缓释行为、控制碱性调控过程的pH回升现象,是赤泥碱性稳定化调控的关键。本文在综述赤泥矿物学特性和碱性矿物赋存形态的基础上,探讨游离碱选择性去除-含碱矿物稳定化的调碱思路,综合分析钙驱动赤泥碱性稳定化特性,阐明了长效稳定调控过程中赤泥含碱矿物的演变特征及规律,提出未来赤泥修复的“土壤化”策略,为推进赤泥土壤化及堆场生态修复提供新策略。

毛白杨碱性/中性转化酶基因PtoNIN1的克隆与功能研究

【目的】蔗糖转化酶作为植物蔗糖代谢过程中的关键酶,在植物生长发育过程中发挥着重要作用。本研究对毛白杨碱性/中性转化酶基因PtoNIN1进行同源基因克隆、生物信息学分析、基因表达分析和遗传转化研究,以期为进一步揭示毛白杨蔗糖代谢调控过程奠定基础。【方法】基于毛果杨同源基因PtrNIN1对毛白杨碱性/中性转化酶成员PtoNIN1进行同源克隆和生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR的方法对不同组织部位(根、茎、叶和成熟叶)和不同发育时期下雌雄花芽中PtoNIN1的基因表达量进行分析,同时构建过表达载体,并对模式植物拟南芥开展遗传转化研究。【结果】PtoNIN1的编码区长度为2073 bp,共编码690个氨基酸,蛋白分子量为77.80 kDa,含有糖苷酶超家族100(glycosyl-hydrolase-100 superfamily)的特征结构域,类属于线粒体型的转化酶成员,在根、茎、叶以及成熟叶和雌雄花芽中均具有明显表达,且随着雌雄花芽的发育呈现先下降后保持稳定的表达趋势。拟南芥遗传转化研究表明:PtoNIN1的过表达显著增加了转基因植株莲座叶、茎及角果的鲜质量,提高了茎及角果中蔗糖的含量,同时也提高了蔗糖代谢通路其他关键基因的表达。【结论】毛白杨PtoNIN1属于线粒体型转化酶家族成员,在毛白杨各个组织部位均具有明显表达,且在雌雄花芽的发育前期具有特异地高表达,在拟南芥中过表达PtoNIN1可显著增加生物量。该研究为杨树转化酶成员功能验证提供了借鉴,为揭示杨树蔗糖代谢过程奠定了基础。

铁皮石斛中性/碱性转化酶(DoNI2)基因的克隆和表达分析

目的克隆珍稀濒危兰科药用植物铁皮石斛中性/碱性转化酶(alkaline/neutral invertase,NI)家族基因成员,并对其进行定量表达以及生物信息学分析。方法采用转录组测序和RACE技术相结合克隆NI基因的cDNA序列,利用生物信息学工具对其进行分析,并采用实时荧光定量PCR方法检测NI基因在铁皮石斛根、茎和叶中的表达情况。结果克隆获得1个新的铁皮石斛NI基因,命名为DoNI2(Gen Bank登录号KY794404),全长2 397 bp,开放阅读框(ORF)为1 836 bp,编码611个氨基酸。DoNI2蛋白预测的理论相对分子质量和等电点分别为69 050和6.38,不稳定系数为42.95,疏水性系数为-0.232。DoNI2基因在铁皮石斛根、茎和叶中均有表达,其中在茎中表达量最高,根中最低。不同生长年限茎中DoNI2基因表达量与NI酶活性呈显著正相关。结论克隆了线粒体型的DoNI2基因的全长c DNA序列,为进一步阐明该基因在铁皮石斛蔗糖代谢途径中的重要作用奠定基础。

橡胶树中碱性转化酶HbNIN9表达及酶学特性分析

转化酶作为蔗糖分解代谢的关键酶,在植物生长发育、生物与非生物胁迫响应等生理过程中发挥重要作用。基于对橡胶树不同组织转录组数据库的分析,本研究克隆了一个在橡胶树种子中有较高丰度表达的中碱性转化酶基因HbNIN9;系统进化分析和在线软件预测均显示其亚细胞定位为线粒体,属于中碱性转化酶α亚族成员;利用原核表达体系成功获得Hb NIN9优化表达的重组蛋白,优化表达的诱导条件为0.5 mmol/L IPTG,25℃培养6 h;酶学特性分析表明,HbNIN9蛋白酶活反应的最适温度为45℃,最适pH值为7.5,米氏常数Km值为18.09 mmol/L。本研究从蛋白水平证实了Hb NIN9为典型的中碱性转化酶,有助于深入揭示线粒体型转化酶在橡胶树种子糖代谢中生理功能,丰富橡胶树中碱性转化酶家族成员的生理生化研究。

铁皮石斛中性/碱性转化酶家族基因的克隆和表达分析

为了探究铁皮石斛中性/碱性转化酶(neutral/alkaline invertase,NI)家族基因的生物学特性和组织表达特性,本试验从铁皮石斛转录数据库中筛选DoNI基因,采用PCR技术克隆到4个新的铁皮石斛DoNI家族基因,分别命名为DoNI1、DoNI3、DoNI4和DoNI5,并利用生物信息学软件分析家族蛋白的理化特性,采用荧光定量PCR检测和分析该家族基因的时空表达特性。结果显示:DoNI1、DoNI3、DoNI4和DoNI5分别编码611、651、554和555 aa,其蛋白分子量为63.18~73.23 kD,等电点为5.84~6.66,氨基酸序列同源性为50%~90%。具有中性转化酶的保守结构域,属于糖基水解酶GH100家族。DoNI1属于线粒体型,DoNI3属于叶绿体型,DoNI4和DoNI5属于细胞质型。在铁皮石斛花、茎、叶和根中都能检测到DoNI家族基因的表达,DoNI1和DoNI3在根中基因表达量最高,DoNI4和DoNI5在花中基因表达量最高。DoNI1在2年生茎中基因表达量最高,1年生茎中次之,3年生茎中最低。不同生长年限茎中的DoNI3与DoNI1基因表达模式相反,而DoNI4和DoNI5基因表达模式相同,都呈逐渐降低的趋势,可溶性糖含量与DoNI4和DoNI5基因表达量呈显著正相关。本研究为开展DoNI家族基因的功能研究提供了理论依据。

6063铝合金碱性钼酸盐化学转化工艺及膜层性能

采用碱性钼酸盐转化工艺在6063铝合金表面制得耐蚀性良好的转化膜。转化液组成为:钼酸钠10.0g/L,乙二胺四乙酸二钠2.0 g/L,三乙醇胺3.0g/L,氟化钠5.0g/L,含硫无机促进剂2.0 g/L。研究了转化液pH、温度和处理时间对转化膜耐蚀性的影响。结果表明,在pH=11.0、温度50℃的条件下处理6063铝合金6.0 min所得转化膜耐蚀性最优。所得转化膜呈均匀的灰色略泛绿,表面粗糙但无裂纹,厚度达30μm以上,由Al_2O_3、MoO_3、Al_2(MoO_4)_3、Na_3AlF_3等化合物构成。

黑皮果蔗中碱性蔗糖转化酶基因ShINV6的克隆与表达分析

在高等植物中,蔗糖转化酶广泛参与调节植物的生长发育、生物和非生物胁迫应答等过程,在控制光合产物在不同库组织的分配上起重要作用,是决定作物经济产量的关键酶。本研究以黑皮果蔗‘Badila’为实验材料,克隆了一个果蔗蔗茎中碱性转化酶基因ShINV6,并对其序列特征、表达特性及其编码蛋白的酶学特征进行了分析。生物信息学分析发现ShINV6基因cDNA全长共2859 bp,其中编码区为1254 bp,共编码417个氨基酸,其中精氨酸(Arg)含量最高,为12.7%,分子质量为46.29 kD,理论等电点为10.89,进化关系分析发现ShINV6蛋白与甘蔗、玉米、高粱等单子叶作物的中碱性蔗糖转化酶高度同源,具有典型的Glyco_hydro_100结构域,多重序列比对发现ShINV6蛋白的C端比其他转化酶少约130个氨基酸,细胞定位和亲水性分析预测ShINV6蛋白可能为细胞质中的亲水性蛋白。在果蔗生长发育过程中,观测蔗茎中的蔗糖含量变化,发现随着种植时间的延长蔗糖含量逐渐增加,其中10月至11月是糖分积累最多的月份。荧光定量PCR结果显示9月份ShINV6表达量达到最大值,结合果蔗生长期生物产量增长规律推测ShINV6很可能参与了蔗茎生长旺盛期光合作用产物蔗糖在蔗茎(库)中的卸载过程,把蔗糖转化成己糖以供蔗茎快速生长。

高等植物中转化酶生理生化特性的研究进展

在高等植物中,转化酶是决定植物体内碳水化合物库组织分配的关键基因家族,在作物经济产量形成与果实品质改良中发挥重要作用。笔者综述了高等植物转化酶的种类、结构特征、代谢途径、生化特性、生理功能的研究现状,着重讨论不同类型转化酶生理生化特性与生理功能的差别。同时,简要介绍了笔者实验室在橡胶树胶乳转化酶基因克隆、表达调控、分离纯化和酶学特性研究上的最新进展。

菠萝AcNINV家族全基因组分离及表达分析

【目的】鉴定出菠萝NINV家族全基因组成员,初步阐明NINV基因与蔗糖代谢的关系。【方法】采用生物信息学方法鉴定并分析菠萝NINV家族全基因组成员,通过实时荧光定量PCR分析其表达特性,利用HPLC对蔗糖含量进行测定。【结果】在菠萝中共鉴定出6个NINV基因,分布于5条不同染色体上,其二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成,该基因家族启动子区域光反应元件数量最多。AcNINV外显子数量介于4~6个之间,其中AcNINV3、6外显子的数量为6个,亚细胞定位预测发现这2个基因都分布于叶绿体,属于α亚族;AcNINV1、2、4、5外显子的数量为4个,亚细胞定位预测发现这4个基因都分布于质膜,属于β亚族。在果柄、果皮、果心中表达量最高的是AcNINV2基因,在果肉中表达量最高的是AcNINV6基因。蔗糖含量随着菠萝果实成熟呈先升高后降低的变化趋势,而AcNINV4基因在菠萝果实成熟过程中呈下调表达。【结论】AcNINV4可能是催化果实蔗糖降解的水解酶基因。

甘蔗SoNIN1基因结构及其内含子信息分析

根据前期克隆得到的So NIN1基因的全长c DNA和部分启动子序列设计引物,应用PCR技术从甘蔗叶片g DNA中克隆So NIN1基因,并利用生物信息学方法分析基因的结构。结果表明,So NIN1基因的DNA序列长4 938 bp,包含6个外显子和5个内含子,Gen Bank登录号KF563902。在该基因5'非翻译区存在一个268 bp内含子序列,同时5个内含子序列中含有与低温、干旱和激素等胁迫响应相关的作用元件,这些可能对So NIN1基因转录表达起调控作用。依据So NIN1蛋白聚类和外显子-内含子基因结构可以将植物NINs分为两类。

分子荧光法快速测定饲料中的金霉素

为快速测定饲料中金霉素含量,将实验样品采用超声波浸提后,用分子荧光法快速测定。结果表明,盐酸金霉素的最佳分析条件为：激发波长350 nm,发射波长421 nm,转化时间60 min,转化温度40℃,p H 11.50,超声温度60℃,超声功率160 W,料液比1∶50。工作曲线的回归方程为Y=798.32X＋21.208,相关系数r=0.9996,检出限为0.544 ng/m L,定量限1.813 ng/m L;样品加标回收率为92.00%~103.83%,相对标准偏差（RSD）小于1%（n=11）。

木薯碱性/中性转化酶MeNINV1基因启动子的克隆及激素应答表达分析

为了解木薯碱性/中性转化酶基因MeNINV1对激素的应答模式及调控机制本研究采用PCR技术,从木薯基因组中分离出MeNINV1基因启动子序列。分析结果显示该启动子长度1 714 bp,含有TATA box和CAAT box保守元件,以及四个激素响应元件:ERE(乙烯应答)、ABRE(ABA应答)、TAC-element(SA应答)和P-box(GA应答)。根据启动子上存在的参与激素应答相关的顺式作用元件信息,选用30μmol/L GA3、30μmol/L ABA、100μmol/L SA和1%乙烯利四种外源激素胁迫处理木薯SC8组培苗,利用实时荧光定量PCR技术,研究MeNINV1基因在不同激素处理下的表达模式。结果表明,MeNINV1基因的表达受激素的调控,因此推断碱性/中性转化酶基因MeNINV1启动子上的激素应答元件响应激素诱导,调控基因的表达。研究结果为进一步研究激素信号如何调控木薯块根蔗糖的分解代谢提供理论基础。

木薯碱性／中性转化酶MeNINV4酵母功能互补

木薯(Manihot esculenta Crantz)为大戟科植物,其块根富含淀粉,主要用于食用、饲用,同时木薯淀粉还可广泛应用于工业生产中。木薯块根淀粉的合成需要蔗糖提供碳水化合物和能量,碱性/中性转化酶在木薯块根蔗糖分解利用时起关键作用。前期已从木薯基因组中克隆获得了11个碱性/中性转化酶基因,其中Me NINV4主要在茎中表达。本研究主要利用转化酶酵母突变菌株SEY2102进行酵母功能互补实验,鉴定Me NINV4是否具有催化蔗糖分解的功能。结果发现,转了p DR196-Me NINV4的SEY2102酵母可以在以蔗糖为唯一碳源的培养基中生长,表明Me NINV4能催化分解蔗糖。提取含有p DR196-Me NINV4质粒的SEY2102酵母粗酶液,进行碱性/中性转化酶活性检测,发现其能催化蔗糖分解成还原糖。这些结果为进一步研究Me NINV4的酶学特性及生理功能提供参考。