碱裂解叶片两步快速制备PCR模板技术研究

广泛采用提取DNA作为PCR模板的方法主要有CTAB和SDS法2种,但步骤烦琐、耗时长。根据Taq酶储存液和PCR反应缓冲液所含K+离子、Cl-离子和Tween-20等成分,以0.05mol/LKOH为强碱裂解物、2%Tween-20为稳定剂配制碱裂解液,以0.05mol/L三羟甲基氨基甲烷盐酸(Tris-HCl)和2mmol/LEDTA为中和液,经加热裂解和中和两步制备PCR模板。以甘蔗叶片为材料,用新鲜配制含KOH和Tween-20的裂解液,将适量叶片放入一定体积的裂解液中加热裂解,再中和,形成裂解混合物。直接以裂解混合物为模板,甘蔗内源基因为靶基因,在优化KOH裂解浓度、模板体积、加热裂解时间以及添加适量聚合酶稳定剂的情况下,PCR反应稳定,重复性强。以有代表性的单子叶和双子叶植物叶片为材料,经过多种内源基因PCR反应的反复验证,证实了这种方法的广泛适用性。该方法通过两步制备PCR模板,无需DNA提取过程,使用材料少,可以实现活体PCR检测,为遗传分析和分子诊断提供简便、快速和高效的分析方法。

质粒DNA碱裂解提取法的改进

对质粒的碱裂解小量提取法进行了改进 ,改进的方法克服了以往质粒提取方法的RNA等杂质污染和操作烦琐费时等问题 ,该方法操作简单、经济实用 ,提取的质粒DNA得率稳定、质量好 ,符合大多数分子生物学常规实验的要求。

碱裂解法快速提取口腔拭子DNA对CHRNA3基因多态性的研究

目的建立一种快速的从口腔拭子中提取DNA的方法,研究其在尼古丁乙酰胆碱受体α3(CHRNA3)基因多态性分析中的应用。方法以NaOH和乙二胺四乙酸(EDTA)配制碱裂解液,以三羟甲基氨基甲烷-EDTA(TE)为中和液,经加热裂解和中和两步提取口腔拭子DNA。以提取的DNA为模板,用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)分析对CHRNA3基因的rs6495309进行分型。对不同基因型的样本测序验证。结果 PCR扩增和酶切的靶带清晰,无非特异性条带。酶切结果与测序结果吻合。结论碱裂解法提取口腔拭子DNA具有快速、简便、经济、可靠的特点,可以用于CHRNA3基因多态性的分析。

一种碱裂解菌液直接电泳快速筛选重组子的方法

目的 :从碱裂解法提取质粒DNA的原理 ,经过实验摸索获得一种快速、经济、结果可靠的菌液直接碱裂解电泳筛选重组子的方法。方法 :不需提取质粒DNA ,只需将细菌培养液碱裂解后直接进行普通琼脂糖凝胶电泳分析 ,就可以快速筛选出转化重组子。结果 :结果和提取质粒酶切鉴定鉴定结果一致。结论 :经实验证明菌液直接碱裂解电泳筛选重组子是一种快速、经济、可靠的方法。

碱裂解提取质粒DNA的改进

碱裂解提取质粒DNA是分子生物学实验中常用的方法 ,但通常方法所提取的质粒往往含有大量的RNA和其他杂质。本文适时加入较高浓度的RNA酶和适当延长冰浴时间 ,结果得到了几乎没有RNA和其他杂质的高纯质粒DNA ,不仅达到了分子生物学实验要求 ,而且可用作抗原检测抗dsDNA抗体。该法操作简单、经济。

改进的碱裂解法大规模提取质粒DNA

对质粒的碱裂解小量提取法进行了改进,改进的方法克服了以往质粒提取方法的RNA等杂质污染、操作烦琐费时、一般条件下不能大规模提取等问题,该方法操作简单、经济、实用且大规模提取,提取的质粒DNA得率稳定、质量好,符合大多数分子生物学常规实验的要求。

血清HBV-DNA模板不同提取方法的比较和选择

目的比较直接煮沸法、碱裂解法、浓缩碱裂解法和碱裂解3倍量提取法四种提取法提取样本核酸的差异;选择简便、可靠的检测乙肝病毒DNA(HBV-DNA)提取方法。方法运用中山医科大学达安基因股份有限公司生产的HBV-DNA试剂盒中推荐的浓缩碱裂解法,与直接煮沸法、碱裂解法、碱裂解3倍量提取法,分别提取血清样本核酸模板,用美国MJ实时荧光定量PCR仪检测HBV-DNA,对结果进行对比分析。结果共89例乙肝表面抗原(HB-sAg)阳性患者血清,浓缩碱裂解法和碱裂解3倍量提取法检测,两者均有62例HBV-DNA阳性(>1000拷贝/ml定性为阳性)阳性率69.6%,阳性拷贝/ml均值用对数形式表示分别为(6.652±1.301)和(6.601±1.282),两者间结果无明显差异(P>0.05);直接煮沸法检测出47例阳性(均在上述62例中)阳性率52.8%;碱裂解法测出57例阳性(均在上述62例中)阳性率64.0%,阳性拷贝/ml均值与浓缩碱裂解法和碱裂解3倍量提取法相比较,阳性检出率较低,有非常显著性差异(P<0.01)和显著性差异(P<0.05)。结论碱裂解3倍量提取法操作简单,省时、省材料,重复性好,阳性检出率与浓缩碱裂解法一致,建议使用碱裂解3倍量提取法检测HBV-DNA。

农杆菌质粒DNA提取方法的改良与鉴定

常规的农杆菌质粒DNA提取常采用碱裂解和酚、氯仿提纯方法 ,得率较低 ,一般在 5 0ng μl以下。针对常规碱裂解法的不足 ,利用含有pCGⅡ双价载体的LBA4 4 0 4菌株通过增加菌液收集量、改变提取流程中的反应条件等对常规方法进行了改良 ,去除了酚、氯仿提纯过程 ,减少了提取过程对人体的伤害 ,得率一般在 0 .5～ 2 μg μl。所提取质粒DNA可直接用于PCR。

茚三酮定量蛋白质方法的改进

首次结合高温碱裂解和乙二醇体系反应液的优势,对茚三酮定量蛋白质的方法进行了改进,同时对测量过程中的关键参数进行了优化,确定了测量波长为570nm、裂解时间为15min、显色时间为15min和冷却时间为5min.在该改进方法条件下,以BSA(牛血清白蛋白)作为标准样品绘制了标准曲线,验证了该方法具有良好的重复性和稳定性.将该方法与茚三酮直接测定法和考马斯亮蓝染色法进行比较,结果表明其具有更高的灵敏度和准确性,在生物、化学、医学等领域具有广泛应用前景.

烟草碱法提取基因组DNA的改进

为能够快速高效的对大量转基因烟草样品进行DNA提取,对碱法提取烟草组织DNA的方法进行了改进。采用0.01mol/L的Na OH溶液为提取液,破碎转基因烟草叶片组织后无需经过加热煮沸中和等步骤,上清液可直接用作PCR反应的模板。结果表明,0.01-0.1 mol/L之间的Na OH溶液制备的DNA模板均能成功扩增,该方法制备的DNA模板不依赖特殊的反应条件,多种品牌的PCR Mix均能成功进行扩增反应。与传统SDS提取法和试剂盒提取法获得的DNA相比,PCR结果没有明显差异。此提取方法在小麦、高粱、水稻、玉米等作物上也取得了很好的实验效果。通过本方法制备的DNA模板,其PCR扩增的产物可直接用来测序分析。该方法使用仪器少,样品消耗少,快速、简便、成本低,没有交叉污染,能够在短时间内处理大量样品,因此能够对大量的转基因烟草样品进行DNA的快速提取和鉴定。

一种简易的甘蔗叶组织PCR模板制备方法

以转基因甘蔗叶片为材料,少量嫩叶经碱并短暂高温处理,再中和,形成裂解混合物。直接以此为模板,转基因甘蔗外源基因bar、KP4、Cry1Ac-2A-gna融合基因及内源基因Shactin基因为靶基因,PCR扩增结果稳定、准确、重复性强,完全可以达到常规CTAB法提取的DNA扩增效果。用此方法制备的模板室温下2周之内,4℃、-20℃下一个月之内结果不变。经多种外源基因PCR反应的反复验证,证实了这种方法在转基因甘蔗检测中的广泛适用性。该方法快速制备PCR模板,无需DNA提取过程,具有使用样品量少,成本低、简便、快捷等优点。

两种DNA提取法对腐败胎盘组织STR分型结果的比较

在法医物证检验工作中,对于新鲜的人体组织检材,一般采用Chelex-100法提取DNA就可得到理想的STR分型结果,但是对于高度腐败的人体组织,单纯地依靠此法检测存在失败的可能。笔者运用两种不同的DNA提取法对高度腐败的胎盘组织进行了DNA提取，并对其STR基因座分型的检出率、DNA含量及纯度进行了比较。

不同地域来源的家蚕微孢子虫DNA特异片段序列及同源性分析

利用碱裂解方法抽提到山东株系的家蚕微孢子虫 (Nosemabombycis,N .b)的基因组DNA ,通过PCR技术扩增得到了N .b的一段特异的DNA片段 ,经测序发现 ,该片段大小为 317bp。将其与日本株N .b和广东株N .b的序列比较得知 ,山东株N .b和广东株N .b ,山东株N .b和日本株N .b ,以及广东株N .b和日本株N .b之间的序列同源性分别为 94 .0 0 %、96 .2 1%、92 .11%。进一步聚类分析发现 ,山东株N .b和日本株N .

质粒DNA制备方法的改进

目的 :改进碱裂解制备质粒DNA的方法。方法 :在小规模制备中 ,采用 7 5mol/LNH4 Ac中和碱溶液及室温下异丙醇沉淀 ;在中规模制备中 ,采用三步沉淀将质粒分离纯化 ;在大规模制备中 ,用两步清洗弃去由于量大而不宜除掉的杂物 (碎屑物、杂蛋白等 )。结果 :建立了一套快速、高效、无毒、经济的方法。

广东株家蚕微孢子虫特异DNA片段的克隆与序列分析

利用碱裂解方法抽提广东株家蚕微孢子虫(NosemabombycisNaёgeli,N.b.)基因组DNA,通过PCR技术扩增得到了N.b.的一段特异DNA片段。对该目的片段的序列分析发现,该特异DNA片段大小为317bp,与Malone等报道的日本株N.b.特异DNA片段大小一致,但核苷酸序列同源性仅为92.1%。

单条固定线虫基因组DNA提取及18S rRNA基因PCR扩增

根据线虫18S核糖体RNA基因PCR扩增效果比较了丙酮、乙醇、乙醇+0.05mol/LEDTA(pH8.0)和5%海水福尔马林4种固定剂,碱裂解和蛋白酶K处理2种单条线虫基因组DNA提取方法的优劣。用乙醇固定的样品最适合制备PCR模板DNA,而5%海水福尔马林固定的样品能最完整地保持样品形态。蛋白酶K处理获得的DNA较碱裂解获得的更适合PCR扩增。结果有助于分子生物学方法在海洋线虫分类、多样性和生态学研究中的应用。

重组质粒pVAX1-PENK大规模制备研究

目的：建立质粒pVAX1-PENK的大规模制备2--艺。方法：对大肠杆菌工程菌DH5α-pVAX1-PENK进行补料发酵，利用自行发明的连续碱裂解过程对菌体进行裂解，经超滤浓缩后，用Sepharnse 6 Fast Flow层析柱分离DNA与RNA，再经Plasmidselect Xtra层析柱分离超螺旋质粒DNA与开环或线性质粒DNA，最后经Source 15Q层析柱精制质粒DNA。结果：发酵获得质粒pVAX1-PENK的产率为182mg／L，经碱裂解及层析分离后，最终制备的质粒DNA超螺旋比例大于98％，总回收率为60.5％，纯度（D260nm／D280nm）为1.8～2.0。结论：建立的质粒DNA生产工艺可以制备大量高纯度的质粒DNA，并避免了使用动物源性的酶及有毒试剂。

基因治疗用质粒DNA生产面临的问题及研究进展

基因治疗已成为21世纪一些重大疾病的有效治疗策略,目前携带治疗基因的重组质粒已作为基因药物进入临床研究。对用于基因治疗的生物制品的生产与质量控制都有相当严格的要求。虽然已建立大规模符合药学规格的质粒DNA生产工艺,能满足临床需求,但在这些生产工艺中还存在一些难以克服的瓶颈,如:载体构建、细胞裂解、细菌染色体DNA去除、细菌内毒素去除、生产过程中质量控制等。就近年来大规模生产临床用质粒DNA遇到的相关问题及解决方案作一综述。