联合UV及SDS-PAGE监测并优化碳二亚胺偶联法制备多肽免疫原

建立了一种多肽免疫抗原偶联的双监测法,获得一种操作简便、成功率高、适用范围广的碳二亚胺偶联法,并应用于多种肿瘤相关多肽标志物的免疫抗原制备。以合成多肽SP0104为标准品,牛血清白蛋白(BSA)为载体蛋白,碳二亚胺(EDC)为偶联剂,对加样顺序、投料比、偶联时间等关键条件进行考察,采用UV和SDS-PAGE对反应产物进行联合监测,以偶联比和偶联率联合评价反应条件。加样顺序为多肽和载体蛋白先混合再加到碳二亚胺中,三者质量比为1∶1∶1,偶联时间为12 h,偶联比在4∶1～12∶1之间,偶联率在9%～20%之间,所得SP0104多抗效价达到1∶80 000,MALDI-TOF质谱分析证实该抗体准确捕获目标抗原。用优化的偶联方法制备多肽SPC09、SPC15、SPG01、SPG03、SPG04的免疫抗原,所得免疫血清效价均在1∶1万以上,最高可达1∶51.2万。所建碳二亚胺多肽偶联联合监测法简便实用,可提高多肽抗体制备的成功率。

基于乳铁蛋白介导的阿霉素纳米脂质载体的构建

目的:建立乳铁蛋白介导的阿霉素纳米脂质载体的制备方法,并对其进行表征。方法:通过对制备条件、表面活性剂种类、脂质材料及有机溶剂等单因素考察,采用乳化-溶剂挥发法制备阿霉素纳米脂质载体;用碳化二亚胺偶联法,将乳铁蛋白连接到纳米脂质载体表面,制备载阿霉素-乳铁蛋白配体纳米脂质载体;对阿霉素纳米脂质载体及乳铁蛋白介导的阿霉素纳米脂质载体形态学特性通过透射电子显微镜(TEM)检测,并采用激光散射粒径测定仪测定其粒径分布、Zeta电位和PDI。结果:根据优化工艺制备出阿霉素纳米脂质载体,并成功将乳铁蛋白偶联至该纳米脂质载体表面;外观形态良好,分散性较好,粒度较为均匀;空白纳米脂质载体粒径在194 nm左右,载药后,粒径有所增大,但变化不明显,当载药的纳米脂质载体连接上乳铁蛋白后,粒径增大到241.0 nm。结论:从TEM形态学观察和粒径的变化上均能证明乳铁蛋白的成功连接,本研究成功制备了乳铁蛋白介导的阿霉素纳米脂质载体,有望成为载阿霉素的新型肺癌靶向制剂。

达氟沙星人工抗原的合成与鉴定

采用碳二亚胺偶联法将达氟沙星分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)载体蛋白偶联,制备达氟沙星人工抗原DFLX-BSA和DFLX-OVA,并用FeC l3显色反应、紫外扫描和酶联免疫吸附试验对制备的人工抗原进行鉴定。结果表明:DFLX与BSA和OVA的偶联比为14∶1和16∶1时可成功地制备达氟沙星人工抗原。

三种蛋白质生物素化化学方法的比较研究

本文以N-羟基丁二酰亚胺(N-Hydroxy succinimide,NHS)活化酯偶联法原理为基础,探究结晶偶联法、反应液直接偶联法及二环己基碳二亚胺(dicyclohexylcarbodiimide,DCC)偶联法之间的优劣。旨在为实验室安全有效、快捷便利地进行蛋白质生物素化提供更优选择。分别用上述三种方法对牛血清白蛋白(bovine albumin,BSA)进行生物素偶联实验,用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)以及紫外波谱扫描特征吸收峰鉴定偶联产物,用凝胶成像系统及Image Lab软件操作系统测定偶联产物相对分子质量,以此确定偶联比。结合上述定性、定量结果对三种偶联方法进行评价。结果显示,三种方法均可以将生物素偶联到BSA上。结晶偶联法首先通过化学合成活化酯并结晶,产率为37.28%,熔点为214~217,偶联比为8.9,单次反应成本128.71元;直接偶联法偶联比为7.0,单次反应成本34.01元;DCC偶联法偶联比为2.2,单次反应成本33.81元。综上可知,反应液直接偶联法相较于结晶法,其偶联效果与结晶偶联法相差无几;相较于DCC偶联法,其偶联反应进行过程中对载体蛋白的变性损失更小。且反应液直接偶联法操作简单,用时较短,过程安全,价格低廉。