凝结芽孢杆菌抗葡萄糖分解代谢物阻遏突变株合成培养基的筛选和发酵特性研究

以实验室前期选育的耐高温菌凝结芽孢杆菌Bacillus coagulans HL5-C以及其突变株5E-1为研究对象,筛选适合两菌株生长和代谢的合成培养基并对其发酵特性进行研究。单因素添加实验结果表明,合成培养基中尿嘧啶是影响HL5-C生长的关键物质,而赖氨酸、脯氨酸和苯丙氨酸则是影响5E-1生长的关键因素,由此分别得到了适合于HL5-C和5E-1生长的合成培养基MCDM4和MCDM5。在此基础上,考察了HL5-C和5E-1在单一碳源和混合碳源条件下的发酵情况,结果表明当非速效碳源与葡萄糖共存时,出发菌株HL5-C优先利用葡萄糖,其他糖的利用被延滞,即出现了碳源分解代谢物阻遏效应(carbon catabolite repression,CCR);突变株5E-1在利用葡萄糖的同时还利用非速效碳源生产乳酸,说明5E-1能消除碳源利用顺序的差异,即5E-1能有效解除或缓解葡萄糖引起的分解代谢物阻遏。本文研究结果为后续凝结芽孢杆菌葡萄糖分解代谢物阻遏效应机制研究奠定了基础。

嗜热厌氧杆菌分解代谢物调控蛋白A的克隆鉴定

分解代谢物调控蛋白A(CcpA)在低GC含量的革兰氏阳性菌株中,是一类非常重要的全局调控蛋白。本研究中,克隆获得了嗜热厌氧杆茵CcpA的编码基因及其上下游各约400 bp片段的基因序列。研究表明,克隆所得的ccpA基因编码长度为336个氨基酸的蛋白质,其理论等电点为5.69。序列比对分析结果显示,其N端的DNA结合位点具有非常高的序列保守性。在CcpA启动子上游含有cre序列,表明该基因转录存在自体调控。此外考察了克隆所得的CcpA编码基因在葡萄糖存在下,工程茵B.subtilis TA-1中amyE基因的表达及酶活均受到抑制。ccp4基因敲除的枯草芽孢杆菌中过量表达克隆所得的CcpA,证明所获蛋白在葡萄糖存在下,能够有效抑制淀粉酶的活力,且对枯草芽孢杆茵的生长产生负影响。

微生物同步利用葡萄糖和木糖代谢工程概述

现阶段,随着资源枯竭和环境污染问题的日益突出,利用农业废弃物等木质纤维素原料发酵生产生物产品、生物能源和生物材料已经成为学术界和社会的共识.微生物同步利用葡萄糖和木糖是木质纤维素生物炼制的重要内容,同时也有利于提高芳香族氨基酸等产品的发酵性能.然而,由于碳分解代谢物阻遏(葡萄糖效应)的存在,大多数微生物并不具备这种特性,迫切需要采用代谢工程手段构建高效同步利用葡萄糖和木糖的菌株.首先对微生物同步利用葡萄糖和木糖的意义进行了说明,然后阐述了氨基酸和核苷生产菌大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和谷氨酸棒杆菌葡萄糖效应的分子机制和破除策略,同时介绍了一些能够同步代谢葡萄糖和木糖的工程菌株的实际应用.

垃圾中含碳有机物厌氧降解过程的独立性探讨

混合垃圾中单物质纤维素、淀粉、脂肪和蛋白质降解的独立性与否可为模拟和预测填埋场任意时刻的产气特性和稳定化进程提供依据。本文对单物质降解的独立性进行了探讨,已有的试验研究结果表明,在厌氧填埋环境下,单物质的厌氧产气量具有可叠加性,即各种单物质的降解是独立的。但是根据葡萄糖效应,在单一菌种纯培养试验中,会出现分解代谢物的阻遏作用,即难降解有机物的分解转化会受到易降解有机物的抑制。在垃圾填埋过程中,由于微生物生态系统复杂,可能会在具体环境中产生一些特殊的抗分解代谢物阻遏作用的微生物。如要从理论上确定填埋垃圾中有机物厌氧降解过程的独立性问题,需要设计专门的微生物学和酶学试验作进一步研究。

酿酒酵母氮代谢物阻遏效应及其对发酵食品安全的影响

综述了国内外发酵食品中氨(胺)类代谢物的研究进展,包括氨基甲酸乙酯的5种形成机制、生物胺和亚硝酸胺的形成机制,阐述了上述生物危害物形成的本质原因——发酵微生物的氮代谢阻遏效应;重点介绍了酿酒酵母胞内5大调控因子(Gln3p、Ure2p、Gat1p、Dal80p和Gzf3p)对其氮源利用的全局调控作用.并以精氨酸和尿素代谢为例,详细介绍了氮代谢阻遏效应的作用机理.酿酒酵母氮代谢物阻遏效应的研究结果,可为解决由于相关含氮有害代谢物积累导致的普遍存在于发酵中的食品安全问题提供理论依据和技术支撑.

代谢调控蛋白A调控革兰阳性菌代谢与毒力偶联的研究进展

代谢调控蛋白A(catabolite control protein A,CcpA)是革兰阳性菌重要的多效调节因子,在磷酸烯醇丙酮酸依赖的磷酸转移酶系统辅助下,能与靶基因上的特异性DNA序列——代谢反应元件结合,促进或阻遏靶基因表达,从而调控细菌的生理过程和毒力。CcpA通过介导微生物碳分解代谢物阻遏效应,控制细菌摄取与利用外界环境中营养物质,保障其高效利用能源。CcpA通过直接或间接调控细菌的代谢过程和毒力基因表达,将细菌的代谢与毒力偶联。该文介绍了CcpA的作用机制及其对细菌多种代谢途径和致病性调控的研究进展。

微生物分解代谢物控制蛋白CcpA的研究进展

碳分解代谢物阻遏(carbon catabolite repression,CCR)是指微生物在混合碳源发酵时优先利用速效碳源(通常为葡萄糖),且该碳源的代谢产物会抑制其他非速效碳源代谢相关的基因表达和蛋白活性,从而影响非速效碳源利用的现象。在低GC含量革兰氏阳性菌中,CCR效应的关键调控因子为分解代谢物控制蛋白CcpA(catabolite control protein A)。该调控蛋白具有多效性功能,除参与CCR外,还与中心碳、氮代谢的调控、生物被膜的形成和毒性基因的表达等多种生理过程相关。综述了近年来有关CcpA蛋白的功能、作用机制及分子结构的研究进展。

巨大芽孢杆菌β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中诱导表达及碳代谢去阻遏

【背景】β-淀粉酶在食品和医疗领域应用广泛。目前工业上使用的β-淀粉酶主要从植物中提取,生产成本高,限制了β-淀粉酶的应用。微生物生产的β-淀粉酶尽管早有报道,但由于产酶水平低下,因而一直未能实现工业化。【目的】实现巨大芽孢杆菌β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效诱导表达,缓解碳分解代谢物阻遏(Carbon catabolite repression,CCR)对该重组酶表达的影响,并研究其酶学性质。【方法】克隆枯草芽孢杆菌木糖诱导启动子,构建木糖诱导表达载体以介导巨大芽孢杆菌1514的β-淀粉酶编码基因amyM在枯草芽孢杆菌中的异源表达。定点突变位于amyM信号肽编码区的分解代谢物响应元件(Catabolite responsive element,CRE),降低碳源代谢对重组β-淀粉酶施加的阻遏。【结果】构建了诱导表达β-淀粉酶基因的重组枯草芽孢杆菌菌株。同义替换amyM-CRE保守碱基在不同程度上缓解了碳源所施加的CCR效应,重组酶的表达水平得到显著提高。重组酶的分子量为57 kD,水解可溶性淀粉主要生成麦芽糖和少量葡萄糖,其中麦芽糖含量为72%。该酶最适作用温度为50°C,最适反应pH为6.0。Co2+、Ca2+对重组β-淀粉酶具有激活作用。【结论】通过木糖诱导表达系统和碳代谢去阻遏实现了β-淀粉酶在枯草芽孢杆菌中的高效表达,酶活最高可达97.16 U/mL发酵液,比amyM基因来源菌巨大芽孢杆菌1514的β-淀粉酶产量提高了440倍,为β-淀粉酶发酵生产的工业化提供了支撑。

革兰氏阳性菌代谢调控蛋白A研究进展

代谢调控蛋白A(catabolite control protein A,CcpA)是革兰氏阳性菌重要的全局性转录调节因子,通过与靶基因代谢反应元件(cre基序)结合,调控基因的转录与表达,参与碳分解代谢物阻遏效应、物质代谢、毒力及抗菌药物耐受等众多生命活动的调节。本文就CcpA蛋白的分子结构、作用机制、表达调控、生物学功能等方面的研究进展进行综述,以增加对CcpA蛋白及细菌复杂转录调控网络的认识,为革兰氏阳性菌感染的防控提供潜在靶标。

枯草芽孢杆菌ccpA基因敲除及对其核黄素产量的影响

CcpA蛋白是介导枯草芽孢杆菌碳分解代谢物阻遏(CCR)的全局调控因子,由ccpA基因编码。CCR效应的存在影响B.subtilis对葡萄糖的利用,降低B.subtilis生产发酵产品的效率。采用基因重组技术敲除了核黄素发酵菌株B.subtilis24/pMX45的ccpA基因,构建了CcpA缺陷株B.subtilis24A1/pMX45。发酵结果显示:B.subtilis24A1/pMX45能够在70h内基本耗尽10%的葡萄糖,生物量达到1.5×109个细胞/mL,溢流代谢产物积累量减少,在8%和10%葡萄糖浓度下,B.subtilis24A1/pMX45核黄素产量分别比B.subtilis24/pMX45提高了62%和95%。CcpA的缺陷,可以缓解葡萄糖引起的CCR效应,显著提高菌株的核黄素产量。

产纤维素酶细菌的选育研究

以产黄纤维单胞菌ＣＬ１和芽孢杆菌ｘｘ－０１为出发株，经诱变处理后，在含葡萄糖的产酶培养基平板上筛选到能形成较大透明圈的抗分解代谢物阻遏突变株．其中ＣＬ１的突变株ＣＭＣ酶活可提高２．１倍（６０．１Ｕ／ｍｌ），微晶纤维素酶可提高３～４倍（３９．５Ｕ／ｍｌ），芽孢杆菌ｘｘ－０１的ＣＭＣ酶活可提高５．０倍（７８０Ｕ／ｍｌ）。

果糖和麦芽糖作为有氧碳源对大肠杆菌NZN111两阶段发酵中厌氧发酵的影响

为了了解磷酸转移酶转运系统(PTS)依赖和非PTS依赖代谢的糖类对大肠杆菌生产琥珀酸的影响,进行了两阶段培养,有氧阶段采用PTS依赖型的果糖或非PTS依赖型的麦芽糖作为丙酮酸甲酸裂解酶(PFL)和乳酸脱氢酶(LDH)双突变株NZN111的碳源,研究其对NZN111厌氧阶段代谢葡萄糖的影响。5 L罐发酵结果表明,以果糖和麦芽糖为碳源有氧培养的细胞恢复了在厌氧条件下快速代谢葡萄糖的能力,琥珀酸和丙酮酸成为主要代谢产物,最终琥珀酸得率分别为0.84和0.75 mol/mol,丙酮酸得率分别达到了0.65和0.83 mol/mol,琥珀酸和丙酮酸终浓度比分别为1.73∶1和1.21∶1。果糖和麦芽糖培养的NZN111与葡萄糖培养的菌体代谢的明显差异推测是cyclic AMP(cAMP)依赖型和非cAMP依赖型的分解代谢物阻遏调控这两种机制共同作用的结果。