免疫磁珠法分离人外周血CD4^+ CD25^+调节性T细胞

目的建立人外周血单个核细胞中CD4+CD25+调节性T细胞(regulatery T cells,Treg)免疫磁性细胞分离方法(megnetic activated cell sorting,MACS),并鉴定其分离效率。方法采用免疫磁珠两步法(即阴性分选和阳性分选2步)分离人外周血单个核细胞中的CD4+CD25+调节性T细胞,首先采用生物素标记的鸡尾酒抗体和抗生物素标记的磁珠阴性分选CD4+T细胞,再用抗CD25+的磁珠阳性分选CD4+CD25+T细胞。分离后的细胞经抗体染色后再通过流式细胞仪检测其分离纯度;胞内因子染色检测其转录因子FOXP3的表达频率;台盼蓝染色检测细胞的存活率;3H-TdR掺入法检测其对CD4+CD25-T细胞增殖抑制效应。结果阴性分选CD4+T细胞的纯度为(92.2±1.7)%,阳性分选后CD4+CD25+Treg细胞的纯度为(95.1±1.2)%。胞内因子染色FOXP3在CD4+CD25+Treg细胞中的表达率为(80.4±1.2)%,台盼蓝染色细胞存活率为(95.6±3.3)%3。H-TdR掺入法检测其对CD4+CD25-T细胞具有明显的抑制作用。结论采用免疫磁性细胞分离技术能够高效、快速地得到一群纯度高并且细胞活力好的CD4+CD25+Treg,为进一步研究其功能提供了方便。

免疫磁珠两步法分离大鼠脾脏CD4^+ CD25^+调节性T细胞

目的探索利用磁性细胞分离(MACS)系统高效、快速地分离大鼠脾脏CD4+CD25+调节性T细胞。方法采用免疫磁珠两步法分离大鼠脾脏内的CD4+CD25+调节性T细胞,首先采用“鸡尾酒”抗体和抗IgG磁珠阴性分选CD4+T细胞,再用抗CD25PE抗体和抗PE磁珠阳性分选获得CD4+CD25+T细胞。分离后的细胞经流式细胞仪检测分离纯度;台盼蓝染色检测细胞存活率;体外增殖实验检测其对CD4+CD25-T细胞的免疫抑制作用。结果阴性分选获得的CD4+T细胞纯度为(83.6±2.5)%(79%～87%),阳性分选后获得的CD4+CD25+T细胞纯度为(90.2±1.8)%(86%～93%),细胞存活率为(92.8±3.4)%(92%～95%),体外增殖实验表明,CD4+CD25+T细胞能明显抑制CD4+CD25-T细胞的增殖(P<0.01)。结论采用MACS系统阴性加阳性分选可以高效、快速地获得理想纯度和有免疫抑制功能的大鼠CD4+CD25+调节性T细胞。

免疫磁珠选择性清除人异基因反应性T细胞的实验研究

本研究用磁性细胞分离系统清除CD25+和CD69+人同种异体反应性T细胞,为减轻异基因骨髓移植后的移植物抗宿主病探索新的手段。对健康供者外周血单个核细胞与白血病缓解病人的骨髓单个核细胞进行单向混合淋巴细胞培养。3天后,通过磁性细胞分离系统清除CD25+和CD69+的同种异体反应性T细胞;通过3H-TdR掺入实验,观察处理后的供者外周血单个核细胞对同一病人的骨髓单个核细胞及无关者外周血单个核细胞的反应性。结果表明:与未清除组相比,清除后供者细胞对同一病人抗原的反应性降低50%,但保留了大部分对无关者抗原的反应性。结论:在体外反应中清除同种异体反应性T细胞可降低对刺激抗原反应,同时保留大部分对无关者抗原的反应。

非小细胞肺癌的循环肿瘤细胞计数的临床研究

目的:探讨非小细胞肺癌(Non-small cell lung cancer,NSCLC)的循环肿瘤细胞计数的临床价值。方法:本次研究选择40例对象包括20例非小细胞肺癌病人,10例肺部良性肿瘤病人,10例健康的志愿者,治疗开始前从外周血中收集循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells,CTCs),采用磁性激活细胞分离技术(Magneticactivated cell separation,MACS),经CD326免疫磁珠阳性分选富集CTCs后,行CK-FITC、CD45PE荧光抗体标记,应用多参数流式细胞仪对外周静脉血CTCs进行定量检测。结果:全组中Ⅰ、Ⅱ期病人共14例,CTCs外周静脉血阳性4例(28.57%);Ⅲ、Ⅳ期病人6例,CTCs外周静脉血阳性3例(50%)。结论:在非小细胞肺癌病人外周循环血中能检测循环肿瘤细胞,循环肿瘤细胞计数可能反映非小细胞肺癌病人疾病状态。非小细胞肺癌CTCs水平的定量检测是较为敏感的肿瘤进展、治疗反应和预后预测的评价指标,本研究建立的免疫磁珠富集联合流式细胞分析技术检测肺癌病人外周血CTCs方法,敏感性和特异性均较高,相信随着肺癌肿瘤特异性分子标志物的发现,CTCs细胞系的分离建立和生物学特性的进一步研究,必将具有广泛的临床应用前景。