磁性细胞分选技术的应用与生物学评价

磁性细胞分选技术是一种利用超顺磁性纳米复合材料进行细胞分选的细胞高度特异性快速分选技术,在免疫学、干细胞学、肿瘤学和临床医学等领域应用广泛。本文综合阐述了磁性细胞分选技术的分类和应用,讨论了近几年出现的几项基于磁性细胞分选的新技术和面临的挑战。重点分析了磁性细胞分选产品生物学评价的必要性,并提出了10项与磁性细胞分选产品相关的生物学评价技术参数:得率、纯度、无菌、细胞毒性、细胞形态、活率、细胞的光散射特性、细胞的荧光抗体标记能力、细胞活化、细胞增殖,该评价技术参数的提出对磁性细胞分选规范化应用具有重要的推动作用。

利用磁性细胞分选技术阴性选择法分离外周血嗜酸性粒细胞

目的 :从健康献血者和哮喘等变态反应性疾病病人的外周血中分离出高纯度、高存活率的嗜酸性粒细胞。方法 :采用磁性细胞分选技术的阴性选择法分离外周血嗜酸性粒细胞 ,并检测分离后嗜酸性粒细胞的纯度、存活率 ,计算其回收率。结果 :①健康献血者外周血嗜酸性粒细胞的回收率为 6 9.7%± 6 .8% ,存活率 95 .4%± 1.8% ,纯度为 90 .7%± 4.3% ;②哮喘等变态反应性疾病病人外周血嗜酸性粒细胞的回收率为 6 0 .4%± 5 .4% ,存活率为 96 .1%± 0 .7% ,纯度为 92 .6 %± 5 .1%。结论 :采用磁性细胞分选技术的阴性选择法 ,能从外周血中分离出高纯度、高存活率的嗜酸性粒细胞 ,因此该方法是一种高效的分离外周血嗜酸性粒细胞的免疫学方法。

正负向磁性细胞分选技术纯化血小板方法的比较

目的获得纯化的血小板,为血小板免疫功能的研究提供实验基础。方法应用磁性细胞分选技术纯化血小板;流式法评价纯化后血小板活化率;白细胞绝对计数法评价有核细胞清除率。结果分选前血小板基础活化率为(2.39±1.10)%,负向分选后为(2.56±1.08)%,正向分选后为(16.76±4.04)%;正、负向分选的有核细胞清除率分别为(98.44±0.24)%及(98.47±0.18)%。正负向分选后血小板回收率分别为(76.5±1.49)%及(79.2±2.61%)。结论磁性细胞负向分选技术适合进行血小板纯化。

应用自动磁性细胞分选器分选人CD_4^+CD_(25)^+调节T细胞

目的:建立应用自动磁性细胞分选器(autoMACS)分选人CD4+CD2+5免疫调节T细胞(Tregs)的方法。方法:应用密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞,应用autoMACS分选其中的CD4+CD2+5T细胞,流式细胞技术检测分选细胞的纯度。结果:分别从5.7×107及5.6×107外周血单个核细胞中分选出6.9×105及6.7×105个CD4+CD2+5T细胞,其纯度>98%。结论:应用autoMACS可高效分选出高纯度的CD4+CD25+T细胞,为深入研究其功能打下了基础。

磁性细胞分选技术在纯化血小板中的应用

目的应用磁性细胞分选技术对血小板进行分选纯化,并评价分选效果,为血小板免疫功能的研究提供实验基础。方法血细胞分离机单采外周血中的血小板,分别采用磁性细胞MS柱和LD柱纯化浓缩血小板,采用白细胞绝对计数法对分选前后血小板中的有核细胞进行检测,计算有核细胞去除率。采用流式细胞术检测分选前后血小板活化膜分子CD62P的表达情况,比较分选前后血小板活化程度差异。结果分选前血小板基础活化率为(2.39±1.10)%,经LD柱负向分选后为(2.56±1.08)%,MS柱正向分选后为(16.76±4.04)%;MS柱、LD柱分选后有核细胞清除率分别为(98.44±0.24)%及(98.47±0.18)%。结论LD柱负向磁性细胞分选技术可高效去除有核细胞,且对血小板影响较小。

免疫磁性分选骨髓干细胞亚群Thy-1^(low) Lin^- Sca-1^+

目的 采用免疫磁性细胞分选系统 (MACS)分离纯化骨髓干细胞亚群Thy 1lowLin Sca 1+ 。方法 收集小鼠股骨骨髓细胞 ,用MACS系统 ,通过三步分选步骤选择Thy 1lowSca 1+ 细胞 ,去除Lin+ 细胞 ,得骨髓干细胞亚群Thy 1lowLin Sca 1+ ,流式细胞仪分析其纯度 ,计算回收率。结果 分选出的Thy 1lowLin Sca 1+ 细胞纯度和回收率分别为 72 .3 6% ,82 .43 % ,达到MACS分选CD3 4+ 细胞水平。结论 MACS系统能有效分选骨髓干细胞亚群Thy 1lowLin Sca 1+ ,纯度和回收率高。

免疫磁性活化细胞分选方法优化及纯化后细胞的生物学特性检测

目的:改良常规免疫磁性活化细胞分选(MACS)的分离纯化方法,提高分选后细胞的纯度并确保细胞仍具有良好活性及功能。方法:以干细胞抗原-1(Sca-1)标记的Sca-1+造血干/祖细胞(Sca-1+HSC/HPC)为例,分别用改良后和常规MACS法分选出小鼠骨髓细胞Sca-1+细胞,流式细胞术检测两种分选方法获得Sca-1+细胞纯度;计算阳性细胞回收率;台酚蓝染色检测分选细胞存活百分率;CCK-8检测细胞增殖,混合造血祖细胞(CFU-Mix)体外培养评价分选Sca-1+细胞分化能力。结果:改良MACS法分选获得的Sca-1+细胞纯度达93%以上(常规MACS法仅为87%),阳性细胞的回收率可达73%(常规法仅为62.3%);细胞存活率、细胞增殖和CFU-Mix集落形成能力两种分选方法无明显差别。结论:改良法能明显提高细胞分选纯度及回收率,细胞活性和功能保持良好,值得各种细胞免疫磁性分选参考采用。

磁性活性细胞分选技术在男性不育研究中的应用

磁性活性细胞分选法(MACS)根据细胞表面特异的标记物,在分子水平对目的细胞进行有效分选,具有简易、快速、灵活、特异性高的特点,在临床方面有着广泛的应用。MACS也为男性不育提供了一个新的研究平台,将MACS用于精液质量优化与生殖细胞分离是男性不育研究的一个新思路。本文简要介绍了MACS的基本原理,综述了MACS在精子优选、冷冻保存、精原干细胞及生精细胞分离等男性不育研究方面的应用现状和临床应用前景。

磁性激活细胞分选技术分离胃癌患者外周血、门静脉血癌细胞及临床初步应用

目的 建立一种分离血液中肿瘤细胞的磁性激活细胞分选 (MACS)技术并评价其临床价值。方法 采用胃肿瘤细胞膜表位的MG7、CEA、QY和MMP9单抗分别与溴化氰活化的Sepharose 4B磁珠交联 ,从胃癌患者外周血、门静脉血中分离出肿瘤细胞。结果 应用MACS技术从外周血中分离出肿瘤细胞的阳性率为4 9.15 % (2 9/5 9) ,从门静脉血中分离出肿瘤细胞的阳性率为 90 .32 % (2 8/31) ,两者比较差异有显著性 (P <0 .0 5 )。用MACS技术从外周血、门静脉血中分离出肿瘤细胞的阳性率与患者临床分期无关。结论 MACS技术是一种有效分离肿瘤细胞的可靠方法 ,可从胃癌患者外周血中分离出少量肿瘤细胞 ,有助于进一步探讨恶性肿瘤的发生、发展、浸润转移。

磁性活性细胞分选法对新鲜和冷冻精液优化效果的研究

目的探讨比较磁性活性细胞分选法(MACS)对新鲜精液和冷冻精液的优选效果,为MASC在辅助生殖实验室的应用提供可靠的数据基础。方法招募科研志愿者,收集健康男性精液,每份精液分为两份,每份1 mL,设置两个实验组,每组20例,一组做新鲜精液的MACS优化(新鲜精液组),一组制备为冷冻精液,解冻后进行冷冻精液的MACS优化(冷冻精液组)。比较分析各组优选前后精子浓度、前向运动精子活动率、膜完整性、正常形态率及DNA完整率等的差异。结果MACS优化后,新鲜精液组前向运动精子活动率[优选前(56.29±12.94)%vs.优选后(65.21±14.55)%]和冷冻精液组[优选前(34.13±17.01)%vs.优选后(22.71±13.51)%]优选前后无显著性差异(P>0.05),且冷冻精液组优化后前向运动精子活动率较优化前略低;新鲜精液组正常形态率[优选前(16.78±3.57)%vs.优选后(25.78±1.95)%]优化前后有显著性差异(P<0.05),冷冻精液组正常形态率[优选前(7.90±3.80)%vs.优选后(13.72±4.58)%]略有改善,但无显著性差异(P>0.05);新鲜精液组精子膜完整率[优选前(59.11±10.07)%vs.优选后(82.86±4.46)%]、DNA完整率[优选前(68.93±9.60)%vs.优选后(85.44±5.62)%]和冷冻精液组精子膜完整率[优选前(69.21±7.79)%vs.优选后(84.00±5.33)%]、DNA完整率[优选前(69.79±3.9)%vs.优选后(91.95±2.82)%]优选后均显著高于优选前(P<0.05)。结论新鲜精液经冷冻后会造成精子不同程度的物理和化学损伤,MACS可以显著提高新鲜精液和冷冻精液的精子膜完整率及DNA完整率,新鲜精液的前向精子运动活动率及正常形态率的优选效果优于冷冻精液。

小鼠CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的分离纯化及鉴定

目的:调节性T细胞(Treg)是近年来免疫学研究的热点。文中研究获取高纯度Treg的方法及其表型的鉴定。方法:流式细胞术(FACS)分析正常小鼠脾脏中CD4+、CD4+CD25+、CD4+CD25-3个细胞亚群的表型;采用二步磁性细胞分选法(MACS)纯化小鼠脾细胞中CD+CD25+Treg,并对分离后的细胞表型进行鉴定。结果:①依CD25表达水平不同将小鼠天然CD4+T细胞划分为3群,转录因子Foxp3、细胞毒T淋巴细胞相关分子-4(CTLA-4/CD152)、糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体(GITR)、CD69在CD4+CD25+细胞亚群呈显著性高表达(P<0.01),CD4+CD25+T细胞主要存在于CD45RB低表达细胞亚群,CD28的表达在CD4+CD25+细胞亚群明显下降(P<0.05)。②使用二步MACS法从正常小鼠脾脏中分离CD4+CD25+T淋巴细胞的得率为1%～1.2%,纯度为87.29%～92.04%。FACS分析结果显示,Foxp3优先表达于CD4+CD25+T细胞亚群,表达率为(66.60±1.03)%,而在CD4+和CD4+CD25-T细胞亚群呈低水平表达,分别为(23.97±2.00)%和(16.78±3.24%)。CTLA-4在CD4+CD25+T细胞亚群表达率为(77.37±1.67)%,明显高于在CD4+和CD4+CD25-T细胞亚群的表达[(21.97±2.39)%和(18.04±3.16)%]。纯化的CD4+CD25+T细胞亚群表现为CD127的低表达。结论:MACS阴性加阳性二步分选法避免激惹CD4分子,可获得高纯度且具有天然CD4+CD25+Treg细胞表型及功能特征的细胞。

脐血造血细胞的冷冻保存方法的比较

目的 :比较程控降温和 - 70℃冰箱直接保存脐血造血细胞对细胞活性的影响及免疫磁珠分离法对细胞生物学活性的影响。方法 :用密度梯度离心法分离出脐血中单个核细胞后 ,采用联合冷冻保护剂经程控降温后存放于液氮和直接存放于 - 70℃冰箱两种方法冷冻保存一个月 ,从细胞活力、细胞回收率、集落形成能力、集落回收率等方面比较这两种冷冻方法的优劣。另外 ,用免疫磁珠分离法正性分选脐带血中CD34+细胞 ,流式细胞仪计数分选前后的CD34+细胞的纯度及回收率 ,并分别进行分选前后的细胞培养。结果 :细胞活力、细胞回收率、集落形成能力、集落回收率在冷冻的两组间差异不显著。用免疫磁珠分选后CD34+细胞纯度达 88.3% ,回收率为 4 6 .2 % ,分选后的CD34+细胞比分选后CD34 细胞的细胞活力及集落形成能力明显要高。结论 :两种方法均可对脐血造血细胞进行保存。免疫磁珠分选法能够提供高纯度的造血干细胞 ,其分选过程不会影响细胞的活力及集落形成能力 。

CD4^+CD25^+调节性T细胞活化对CCR4/CCR5膜表达及功能的影响

目的探讨CD3/CD28抗体包被磁珠刺激活化的小鼠CD4+CD25+调节T细胞(Treg)表面趋化因子受体CCR4/CCR5表达及免疫抑制功能变化。方法采用磁性激活细胞分离器(MACS)纯化C57BL/6小鼠脾细胞中的CD4+CD25+T细胞,采用CD3/CD28抗体包被磁珠与鼠重组白细胞介素2刺激0、2、4 d后,流式细胞仪检测CCR4与CCR5的表达,3H-TdR掺入法检测细胞增殖活性。结果活化的CD4+CD25+T细胞CCR4的表达率明显高于CD4+CD25-T细胞对照组,CCR5的表达率明显低于对照组细胞。CD4+CD25+调节T细胞CCR4、CCR5的表达随活化时间延长持续增强,CD4+CD25-T细胞CCR5表达则逐渐减弱、CCR4表达无显著变化。活化的CD4+CD25+T细胞可明显抑制CD4+CD25-T细胞增殖,当比值为1∶1时抑制率达88.4%。结论 CD3/CD28抗体包被磁珠刺激可以增强CD4+CD25+T细胞膜表面CCR4、CCR5表达;活化CD4+CD25+T细胞免疫抑制功能强于新鲜分离的CD4+CD25+T细胞。

中枢神经系统细胞分离方法的研究进展

中枢神经系统细胞是由神经细胞和胶质细胞组成的混合体,在脑的正常生理活动和疾病发展过程中起不同作用,实现对每一种细胞特异性分离成为研究其功能的基础。随着科技发展,出现很多分离细胞的新技术,如磁性细胞分选法(magnetic cell sorting,MCS)、激光显微解剖术(laser-capture microdissection,LCM)、微流控技术等,这些技术的应用将为中枢神经系统细胞的研究提供很大帮助。

睾丸Leydig干细胞分离、纯化及鉴定的体外研究

目的改进Leydig干细胞的分离及纯化方法,观察其生物学特性并进行鉴定。方法通过胶原酶消化、差速贴壁法及双抗体免疫磁珠分选法,从大鼠睾丸内获得Leydig干细胞。以条件培养液进行培养,采用CCK法测定增殖能力。通过PDGFRα、LIFR及3β-HSD免疫组织化学染色鉴定Leydig干细胞。经定向诱导分化后,检测Leydig细胞的睾酮分泌能力。结果每个睾丸约可获得83 000个干细胞,经免疫组织化学染色分析,PDGFRα阳性率为(98.0±0.8)%。在条件培养液中培养的SLCs增殖明显,在1个月内能稳定维持其干性而未向Leydig细胞系分化。免疫组织化学染色结果表明,PDGFRα、LIFR阳性表达,3β-HSD为阴性表达。Leydig干细胞在含有T3和HCG的培养液中培养后,第5天即可测到睾酮分泌,分化后的细胞3β-HSD+。结论由差速贴壁法及双抗体免疫磁珠分选法能获得纯化的PDGFRα+/LHR-细胞,这些细胞符合SLCs所必须具有的特征。采用该方法获取SLCs,操作简便,细胞损伤小并且获取纯度高。

磁性分选肺腺癌始动细胞的异常miRNAs验证

目的利用磁性活细胞分选法(magnetic activated cell sorting,MACS)从人A549肺腺癌细胞中分离得到CD133+标记细胞,通过CD133/CD326双阳性检测探讨分离效果,初步分析差异表达miRNAs对该亚群细胞的调控功能。方法将对数生长期的A549细胞离心收集,重悬于无血清培养基中,培养至第二代后利用CD133磁珠标记后分选,流式细胞术及免疫荧光验证分选后细胞的CD133/CD326双阳性率;结合前期实验miRNA芯片结果,挑选兴趣分子进行定量PCR验证。结果利用CD133磁珠分选得到的阳性细胞亚群高表达CD133/CD326分子,结合前期miRNA芯片结果,选出在CD133+/CD326+细胞亚群中表达上调的miR-663,miR-183,miR-125a-5p,miR-127,miR-520h及表达下调的miR-18b,miR-29ab,miR-17和miR-155行定量PCR检测证实miR-29ab,miR-155,miR-183,miR-127-3p及miR-17的表达趋势与芯片结果相符。结论利用磁珠分选方式能获得CD133+/CD326+高表达肺腺癌始动细胞亚群且包括miR-183等在内的6条分子与芯片结果一致,可能在肺腺癌始动细胞生物学行为的调控中发挥重要作用。

四种精液处理方法优选冷冻精子的比较

目的 探讨洗涤法(SW)、密度梯度离心法(DGC)、上游法(SU)、磁性活性细胞分选法(MACS)对冷冻精液的优选效果,为供精人工授精(AID)和供精体外受精(IVF-D)提供可靠的数据。方法 门诊收集健康男性精液,制备冷冻精液。冷冻精液复苏后,根据优选处理方法不同分为4组:SW组、DGC组、SU组和MACS组,每组样本各20例。比较分析各组优选前后精子浓度、前向运动精子活率、膜完整性、正常形态率及DNA碎片率等的差异。结果 SW组,处理前后前向运动精子活率、精子膜完整性、正常形态率及DNA完整率,均无显著性差异(P>0.05);DGC和SU组中,优选后前向运动精子活率[分别为(78.19±12.13)vs.(34.17±8.61)、(82.20±7.17)vs.(42.86±16.38)]、精子膜完整率[分别为(84.62±5.84)vs.(68.17±6.74)、(81.44±4.47)vs.(65.19±6.15)]、正常形态率[(20.42±4.63)vs.(12.16±5.75)、(25.02±4.61)vs.(10.24±5.37)]及DNA完整率[(86.73±7.07)vs.(67.98±6.45)、(88.49±3.09)vs.(67.44±5.89)]均显著高于同组优选前(P<0.05);MACS组中,优选后冷冻精子的膜完整性[(84.00±5.33)vs.(69.21±7.79)]、正常形态率[(13.72±4.58)vs.(7.90±3.80)]及DNA完整率[(91.95±2.82)vs.(69.79±3.90)]亦显著高于优选前(P<0.05),但前向运动精子活率没有显著改善(P>0.05)。结论 四种方法在处理冷冻精子方面各有优缺点,临床可以根据精液标本的质量或者对于精液制备液的要求来选择不同的精子优化方法。MACS可以较好地优化DNA完整率,其在辅助生殖领域的应用具有一定前景。

棕榈酸棕榈酯对人外周血单核细胞增殖的影响

目的观察棕榈酸棕榈酯对人外周血单核细胞增殖的影响。方法通过人淋巴细胞分离液及磁性细胞分选技术(MACS)分离纯化得到人外周血单核细胞,用不同浓度棕榈酸棕榈酯(0、1、2.5、5、20μM)干预,CCK8法检测人外周血单核细胞生长增殖的情况。结果棕榈酸棕榈酯能促进单核细胞的增殖。促增殖效应在20μM24h末达峰值,且棕榈酸棕榈酯浓度在0～20μM之间呈剂量依赖关系,在8～24h呈时间依赖关系(P<0.05)。结论棕榈酸棕榈酯能显著促进人外周血单核细胞的增殖,对人体可能具有毒性作用。

性别控制技术在畜牧业中的应用研究现状与发展

随着生活水平的提高,人们对肉、奶等畜禽产品的需求也不断提高,因此畜禽繁育工作就显得尤为重要,而性别控制技术是加快畜禽繁育工作的重要环节,其是一类通过人为干预方式来控制畜禽后代性别以满足市场需求的技术。目前生命科学领域发展迅速,已经有多种相对成熟的性别控制技术,如流式细胞仪分选法、免疫学分离法、改变精子生存环境法、基因编辑法、磁性细胞分选(magnetic activated cell sorting,MACS)法等,笔者对上述性别控制技术进行综述,以期为性别控制技术在畜牧业中的应用提供参考。

应用DGC结合MACS技术优选精子的效果评价

目的:评价密度梯度离心(DGC)结合磁性活性细胞分选法(MACS)优选精子质量的效果。方法:应用DGC结合MACS技术优选精液标本40份,比较优选前、DGC优选及DGC结合MACS技术优选后精子活率、前向精子活动力、正常形态百分率、DNA损伤的变化。结果:DGC结合MACS技术优选后,精子活率、前向活动力及DNA完整性较优选前原液及单用DGC法优选均明显提高(P<0.01)。结论:DGC结合MACS技术可以优选出精子活率、活动力、形态较好而DNA结构受损比例较小的精子群体,可作为一种优良的精子优选方法。