调节性T细胞的MACS分选和纯度鉴定

目的 建立CD4+ CD2 5 + 调节性T细胞 (RegulatoryTCells ,Treg)的磁珠 (MACS)分选方法 ,并对分选结果进行纯度鉴定。方法 采用T细胞纯化柱分离小鼠脾脏T淋巴细胞 ,以抗 CD8 FITC抗体和抗FITC标记磁珠相结合的阴性选择法剔除CD8+ T细胞 ,再以抗 CD2 5 FITC抗体和抗FITC标记磁珠相结合的阳性选择法选出CD2 5 + T淋巴细胞 ;以FACS流式细胞法检测分选的CD4+ CD2 5 + 调节性T细胞纯度。结果 MACS磁珠分选法能够成功分选出CD4+ CD2 5 + 调节性T细胞 ,分选平均纯度达到73 % ,分选细胞活力为 95 %。结论 MACS磁珠分选法能够分选出高纯度的Treg细胞 。

磁性活性细胞分选法对新鲜和冷冻精液优化效果的研究

目的探讨比较磁性活性细胞分选法(MACS)对新鲜精液和冷冻精液的优选效果,为MASC在辅助生殖实验室的应用提供可靠的数据基础。方法招募科研志愿者,收集健康男性精液,每份精液分为两份,每份1 mL,设置两个实验组,每组20例,一组做新鲜精液的MACS优化(新鲜精液组),一组制备为冷冻精液,解冻后进行冷冻精液的MACS优化(冷冻精液组)。比较分析各组优选前后精子浓度、前向运动精子活动率、膜完整性、正常形态率及DNA完整率等的差异。结果MACS优化后,新鲜精液组前向运动精子活动率[优选前(56.29±12.94)%vs.优选后(65.21±14.55)%]和冷冻精液组[优选前(34.13±17.01)%vs.优选后(22.71±13.51)%]优选前后无显著性差异(P>0.05),且冷冻精液组优化后前向运动精子活动率较优化前略低;新鲜精液组正常形态率[优选前(16.78±3.57)%vs.优选后(25.78±1.95)%]优化前后有显著性差异(P<0.05),冷冻精液组正常形态率[优选前(7.90±3.80)%vs.优选后(13.72±4.58)%]略有改善,但无显著性差异(P>0.05);新鲜精液组精子膜完整率[优选前(59.11±10.07)%vs.优选后(82.86±4.46)%]、DNA完整率[优选前(68.93±9.60)%vs.优选后(85.44±5.62)%]和冷冻精液组精子膜完整率[优选前(69.21±7.79)%vs.优选后(84.00±5.33)%]、DNA完整率[优选前(69.79±3.9)%vs.优选后(91.95±2.82)%]优选后均显著高于优选前(P<0.05)。结论新鲜精液经冷冻后会造成精子不同程度的物理和化学损伤,MACS可以显著提高新鲜精液和冷冻精液的精子膜完整率及DNA完整率,新鲜精液的前向精子运动活动率及正常形态率的优选效果优于冷冻精液。

磁性活性细胞分选技术在男性不育研究中的应用

磁性活性细胞分选法(MACS)根据细胞表面特异的标记物,在分子水平对目的细胞进行有效分选,具有简易、快速、灵活、特异性高的特点,在临床方面有着广泛的应用。MACS也为男性不育提供了一个新的研究平台,将MACS用于精液质量优化与生殖细胞分离是男性不育研究的一个新思路。本文简要介绍了MACS的基本原理,综述了MACS在精子优选、冷冻保存、精原干细胞及生精细胞分离等男性不育研究方面的应用现状和临床应用前景。

中枢神经系统细胞分离方法的研究进展

中枢神经系统细胞是由神经细胞和胶质细胞组成的混合体,在脑的正常生理活动和疾病发展过程中起不同作用,实现对每一种细胞特异性分离成为研究其功能的基础。随着科技发展,出现很多分离细胞的新技术,如磁性细胞分选法(magnetic cell sorting,MCS)、激光显微解剖术(laser-capture microdissection,LCM)、微流控技术等,这些技术的应用将为中枢神经系统细胞的研究提供很大帮助。

小鼠CD4^＋CD25^＋调节性T细胞的分离纯化及鉴定

目的:调节性T细胞(Treg)是近年来免疫学研究的热点。文中研究获取高纯度Treg的方法及其表型的鉴定。方法:流式细胞术(FACS)分析正常小鼠脾脏中CD4+、CD4+CD25+、CD4+CD25-3个细胞亚群的表型;采用二步磁性细胞分选法(MACS)纯化小鼠脾细胞中CD+CD25+Treg,并对分离后的细胞表型进行鉴定。结果:①依CD25表达水平不同将小鼠天然CD4+T细胞划分为3群,转录因子Foxp3、细胞毒T淋巴细胞相关分子-4(CTLA-4/CD152)、糖皮质激素诱导肿瘤坏死因子受体(GITR)、CD69在CD4+CD25+细胞亚群呈显著性高表达(P<0.01),CD4+CD25+T细胞主要存在于CD45RB低表达细胞亚群,CD28的表达在CD4+CD25+细胞亚群明显下降(P<0.05)。②使用二步MACS法从正常小鼠脾脏中分离CD4+CD25+T淋巴细胞的得率为1%～1.2%,纯度为87.29%～92.04%。FACS分析结果显示,Foxp3优先表达于CD4+CD25+T细胞亚群,表达率为(66.60±1.03)%,而在CD4+和CD4+CD25-T细胞亚群呈低水平表达,分别为(23.97±2.00)%和(16.78±3.24%)。CTLA-4在CD4+CD25+T细胞亚群表达率为(77.37±1.67)%,明显高于在CD4+和CD4+CD25-T细胞亚群的表达[(21.97±2.39)%和(18.04±3.16)%]。纯化的CD4+CD25+T细胞亚群表现为CD127的低表达。结论:MACS阴性加阳性二步分选法避免激惹CD4分子,可获得高纯度且具有天然CD4+CD25+Treg细胞表型及功能特征的细胞。

Nycodenz-密度渗透压介质离心分离人外周血单核细胞研究

目的研究人外周血单核细胞分离方法。方法采集24名健康志愿献血者外周血,分别以EDTA-K2、肝素钠、枸橼酸钠抗凝,将抗凝全血或单个核细胞悬液缓慢加入不同密度和渗透压组合的Nycodenz-NaCl溶液上层,离心分离单核细胞;EDTA抗凝血经Ficoll-Hypaque密度梯度离心获得的单个核细胞,再分别用Nycodenz-NaCl密度渗透压介质离心法、Percoll密度梯度离心法、贴壁法、MACS(抗CD-14磁珠)分离单核细胞。结果如上4种方法获得的单核细胞纯度和收获率中位数(M)分别为98.9%和68.5%、89.6%和64.5%、64.8%和60.5%、94.1%和73.5%,比较显示Nycodenz法获得的单核细胞纯度最高(P<0.01);吞噬指数和趋化指数分别为188.8±11.2和26.8±5.9、187.8±12.2和26.1±5.1、144.4±24.8和15.4±7.3、177.1±18.3和18.9±6.7,统计表明Percoll法和Nycodenz法获得的单核细胞的吞噬指数、趋化指数高于贴壁法和MACS法(P<0.05);单核细胞受LPS刺激分泌细胞因子IL-12p70、IL-10、TNF-α水平(pg/ml)分别为2 545±341、1 216±397、3.999±418,2 489±425、1080±277、3 891±446,2 147±223、794±180、3268±411,35±12、142±81、407±199,比较得知MACS的单核细胞受LPS刺激分泌细胞因子IL-12p70、IL-10、TNF-α水平非常显著低于其他方法(P<0.01);单核细胞经典亚群CD14+CD16-HLA-DR+百分比和非经典亚群CD14+CD16+HLA-DR+百分比(M)分别为89%和5%、88%和1%、73%和1%、51%和36%,统计表明MACS法的单核细胞经典亚群百分比明显低于其他分离方法(P<0.01),而非经典亚群百分比明显高于其他方法(P<0.01)。结论 Nycodenz-NaCl密度渗透压介质离心法能够分离获得较高纯度、较多经典型的单核细胞。

CD4^+CD25^+调节性T细胞活化对CCR4/CCR5膜表达及功能的影响

目的探讨CD3/CD28抗体包被磁珠刺激活化的小鼠CD4+CD25+调节T细胞(Treg)表面趋化因子受体CCR4/CCR5表达及免疫抑制功能变化。方法采用磁性激活细胞分离器(MACS)纯化C57BL/6小鼠脾细胞中的CD4+CD25+T细胞,采用CD3/CD28抗体包被磁珠与鼠重组白细胞介素2刺激0、2、4 d后,流式细胞仪检测CCR4与CCR5的表达,3H-TdR掺入法检测细胞增殖活性。结果活化的CD4+CD25+T细胞CCR4的表达率明显高于CD4+CD25-T细胞对照组,CCR5的表达率明显低于对照组细胞。CD4+CD25+调节T细胞CCR4、CCR5的表达随活化时间延长持续增强,CD4+CD25-T细胞CCR5表达则逐渐减弱、CCR4表达无显著变化。活化的CD4+CD25+T细胞可明显抑制CD4+CD25-T细胞增殖,当比值为1∶1时抑制率达88.4%。结论 CD3/CD28抗体包被磁珠刺激可以增强CD4+CD25+T细胞膜表面CCR4、CCR5表达;活化CD4+CD25+T细胞免疫抑制功能强于新鲜分离的CD4+CD25+T细胞。

四种精液处理方法优选冷冻精子的比较

目的 探讨洗涤法(SW)、密度梯度离心法(DGC)、上游法(SU)、磁性活性细胞分选法(MACS)对冷冻精液的优选效果,为供精人工授精(AID)和供精体外受精(IVF-D)提供可靠的数据。方法 门诊收集健康男性精液,制备冷冻精液。冷冻精液复苏后,根据优选处理方法不同分为4组:SW组、DGC组、SU组和MACS组,每组样本各20例。比较分析各组优选前后精子浓度、前向运动精子活率、膜完整性、正常形态率及DNA碎片率等的差异。结果 SW组,处理前后前向运动精子活率、精子膜完整性、正常形态率及DNA完整率,均无显著性差异(P>0.05);DGC和SU组中,优选后前向运动精子活率[分别为(78.19±12.13)vs.(34.17±8.61)、(82.20±7.17)vs.(42.86±16.38)]、精子膜完整率[分别为(84.62±5.84)vs.(68.17±6.74)、(81.44±4.47)vs.(65.19±6.15)]、正常形态率[(20.42±4.63)vs.(12.16±5.75)、(25.02±4.61)vs.(10.24±5.37)]及DNA完整率[(86.73±7.07)vs.(67.98±6.45)、(88.49±3.09)vs.(67.44±5.89)]均显著高于同组优选前(P<0.05);MACS组中,优选后冷冻精子的膜完整性[(84.00±5.33)vs.(69.21±7.79)]、正常形态率[(13.72±4.58)vs.(7.90±3.80)]及DNA完整率[(91.95±2.82)vs.(69.79±3.90)]亦显著高于优选前(P<0.05),但前向运动精子活率没有显著改善(P>0.05)。结论 四种方法在处理冷冻精子方面各有优缺点,临床可以根据精液标本的质量或者对于精液制备液的要求来选择不同的精子优化方法。MACS可以较好地优化DNA完整率,其在辅助生殖领域的应用具有一定前景。

性别控制技术在畜牧业中的应用研究现状与发展

随着生活水平的提高,人们对肉、奶等畜禽产品的需求也不断提高,因此畜禽繁育工作就显得尤为重要,而性别控制技术是加快畜禽繁育工作的重要环节,其是一类通过人为干预方式来控制畜禽后代性别以满足市场需求的技术。目前生命科学领域发展迅速,已经有多种相对成熟的性别控制技术,如流式细胞仪分选法、免疫学分离法、改变精子生存环境法、基因编辑法、磁性细胞分选(magnetic activated cell sorting,MACS)法等,笔者对上述性别控制技术进行综述,以期为性别控制技术在畜牧业中的应用提供参考。

应用DGC结合MACS技术优选精子的效果评价

目的:评价密度梯度离心(DGC)结合磁性活性细胞分选法(MACS)优选精子质量的效果。方法:应用DGC结合MACS技术优选精液标本40份,比较优选前、DGC优选及DGC结合MACS技术优选后精子活率、前向精子活动力、正常形态百分率、DNA损伤的变化。结果:DGC结合MACS技术优选后,精子活率、前向活动力及DNA完整性较优选前原液及单用DGC法优选均明显提高(P<0.01)。结论:DGC结合MACS技术可以优选出精子活率、活动力、形态较好而DNA结构受损比例较小的精子群体,可作为一种优良的精子优选方法。