猪胃黏蛋白偶联磁珠和聚乙二醇富集检测青葱和葡萄中诺如病毒的比较研究

目的:以青葱与葡萄为材料,建立以猪胃黏蛋白偶联磁珠(PGM-MB)和聚乙二醇8000(PEG8000)富集检测水果、蔬菜中诺如病毒的方法。方法:确定病毒原液中的相对病毒量,梯度稀释病毒原液并进行实时荧光-聚合酶链式反应检测,以每个反应管内的荧光信号达到设定的域值时所经历的循环数值与病毒量(实时荧光-聚合酶链式反应单位数)的常用对数值绘制标准曲线和线性方程;人工接种诺如病毒于青葱与葡萄表面,洗脱后,分别用PEG8000和PGM-MB富集诺如病毒,实时荧光-聚合酶链式反应扩增,用标准曲线对回收的病毒进行相对定量。结果:基质为青葱时,高接种量条件下,两种富集方法的病毒回收效果相当,低接种量下,PGM-MB法的富集回收率高于PEG8000法,且PGM-MB的检测下限更低;基质为葡萄时,PGM-MB法的富集回收率均高于PEG8000法,且检测下限更低。结论:PGM-MB富集效果良好,快速方便,适合应用于水果和蔬菜中的诺如病毒的富集检测。

氨基磁珠偶联法解析地榆皂苷Ⅱ作用蛋白

目的采用磁珠偶联法解析地榆皂苷Ⅱ作用蛋白。方法地榆皂苷Ⅱ具有羧基端,将其活化后,羧基端与氨基磁珠的氨基端偶联。将0、2、10 mmol·L-1地榆皂苷Ⅱ与磁珠形成配合物后,与等量TF-1细胞蛋白裂解产物共孵育,使地榆皂苷Ⅱ结合潜在作用靶蛋白;利用磁力架捕获上述磁珠,解离地榆皂苷Ⅱ的结合蛋白;经过SDS-PAGE电泳分离,采用高分辨质谱鉴定PAGE胶上的蛋白,呈现与地榆皂苷Ⅱ相结合的蛋白;通过基因本体论和京都基因与基因组百科全书数据库分析差异蛋白;通过特异性肽段数量及基于强度的绝对蛋白质定量(IBAQ)值的高低,从中筛选可信度较高的地榆皂苷Ⅱ作用蛋白。结果鉴定空白磁珠及化合物偶联磁珠结合蛋白共计226种。扣除空白磁珠结合蛋白本底,鉴定出66种地榆皂苷Ⅱ特异性作用蛋白,通过特异性肽段与IBAQ值综合分析可知:与地榆皂苷Ⅱ作用相关的蛋白主要为DNA依赖性蛋白激酶催化亚基、翻译激活剂GCN1及酰基甘油激酶等。结论利用氨基磁珠偶联法解析地榆皂苷Ⅱ的潜在作用蛋白,可为进一步阐释地榆皂苷Ⅱ及地榆的作用机制提供依据。

磁珠法解析奈非那韦抗多发性骨髓瘤作用蛋白

目的采用磁珠法捕获与奈非那韦抗多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)相关作用蛋白,并对其进行分析,为探明奈非那韦抗MM作用机制提供理论依据。方法将环氧基磁珠和奈非那韦偶联,然后与MM.1S细胞蛋白裂解产物共孵育,结合奈非那韦作用蛋白,通过缓冲溶液解离奈非那韦偶联蛋白,进行SDS-PAGE(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis)电泳和银染分析,对胶上蛋白进行高分辨质谱鉴定,再通过GO(Gene Ontology)数据库和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)数据库预测蛋白质参与的生物学意义。结果奈非那韦捕获蛋白中可信度较高的蛋白:L-乳酸脱氢酶、核糖体蛋白S3和电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1。上述蛋白与肿瘤细胞增殖关系密切。生物信息学分析发现奈非那韦可能和其他潜在生物学功能相关,例如:碳水化合物代谢、脂代谢以及嘌呤代谢等。结论采用一种简单、高效的捕获靶蛋白新方法,为挖掘奈非那韦抗MM作用靶点奠定了理论基础,为药物新靶标筛选和潜在生理功能提供新的思路和方法。