应用免疫磁珠分离法及荧光定量PCR技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157:H7

目的建立免疫磁珠分离法(immunomagnetic separation,IMS)联合荧光定量PCR(real-time PCR)技术快速检测肠出血性大肠埃希菌O157∶H7的方法。方法根据肠出血性大肠埃希菌O157∶H7抗原特异性基因rfbEO157设计引物和荧光探针,建立real-time PCR检测体系,并检测其特异性及敏感性;用O157免疫磁珠特异性捕获标本菌液中的O157∶H7大肠埃希菌,结合real-time PCR对磁珠捕获菌细胞的DNA进行检测分析。结果 Real-time PCR检测结果显示,O157∶H7大肠埃希菌可产生荧光信号,而其他常见致病菌均未见明显荧光信号;采用IMS-real-time PCR方法检测标本,菌液含菌量为3.3×102CFU/mL时即可被检出,检测全过程需时约4h。结论 IMS-real-time PCR检测方法具有特异性强、敏感度高、快速易操作等特点,该检测方法能提高O157∶H7大肠埃希菌的检出率和准确性,可用于标本的快速诊断、疾病监测和暴发疫情的病原学调查。

免疫磁珠分离法分选提纯骨髓造血干细胞CD117

目的:探讨用免疫磁珠分离法(magnetic activated cell sorting,MACS)从小鼠股骨、胫骨分离纯化骨髓造血干细胞CD117的方法。方法:收集小鼠骨髓细胞,台盼蓝染色观察其活力,用免疫磁珠分离法分选CD117细胞,流式细胞仪检测荧光标记CD117表达阳性率。结果;未分选前CD117细胞纯度为(41.56±18.77)%,MACS分选CD117细胞纯度(88.68±4.74)%,纯化前后有明显差异(P<0.05)。结论:MACS阳性选择法分选系统能有效分选骨髓造血干细胞CD117。

两种免疫磁珠分离法分选小鼠骨髓粒-单核祖细胞的效率比较

目的:提取小鼠骨髓细胞(bone marrow cell,BMC),用两种不同的免疫磁珠分离(magnetic activated cell sorting,MACS)试剂盒从小鼠BMC中分选提纯粒-单核祖细胞(granulocyte-monocyte progenitor,GMP),比较这两种免疫磁珠的分选效率。方法:从小鼠股骨和胫骨中提取BMC,通过两种不同的MACS试剂盒,即Lineage阳性细胞清除试剂盒和CD117阳性细胞分选试剂盒,分别得到Lineage-细胞群和CD117+细胞群,用代表GMP细胞表面标志物的荧光抗体标记,孵育后通过流式细胞荧光分选技术得到GMP细胞,并且对比得到GMP细胞的效率。结果:每2只野生型C57BL/6J小鼠可共收集骨髓细胞(7.02±1.24)×10^(7)个,细胞活力为(91.86±5.24)%。经过Lineage阳性细胞清除试剂盒得到的细胞数量为(5.71±2.86)×10^(6)个;经过CD117阳性细胞分选试剂盒得到的细胞数量为(2.70±0.56)×10^(6)个。Lineage磁珠分选纯化得到的GMP细胞数占总细胞数的比例为(10.90±1.37)%,CD117磁珠分选纯化得到的GMP细胞数占总细胞数的比例为(4.83±2.08)%。结论:Lineage阳性细胞清除试剂盒能更有效分选小鼠骨髓细胞中的粒-单核祖细胞。

改良贴壁培养法简单的骨髓基质干细胞分离纯化法

骨髓基质干细胞（marrow stromal cells，MSCs）来源广泛，取材容易，体外培养可迅速增殖，移植物抗宿主反应轻，体外诱导可分化为神经胶质细胞和神经元样细胞等。近年来，MSCs移植已被用于神经系统变性疾病及脑缺血的治疗研究中。目前MSCs的常用分离方法主要有4种，即贴壁筛选法、密度梯度离心法、流式细胞仪分离法、免疫磁珠分离法，各有优缺点。本文介绍一种比较理想、简单的分离纯化方法改良贴壁培养法。

磁珠分离结合定量PCR法检测单克隆抗体产品中CHO细胞DNA残留量

目的 利用磁珠分离法结合定量PCR技术，建立单克隆抗体产品中CHO细胞DNA残留量的检测方法，并进行验证及初步应用。方法通过磁珠分离法提取样品中的残留DNA，再利用Taqman探针法对样品和标准DNA进行定量PCR测定，根据标准曲线对样品中的DNA残留量进行分析。对建立的方法进行种属特异性、准确性及精密性验证，并对5个厂家15批单克隆抗体类产品中的残留DNA进行测定。结果该方法检测CHO细胞DNA残留的最低准确定量浓度可达1×10^-3pg／μl，DNA含量在1×10^-3～10^2 pg／μl范围内曲线线性良好，标准曲线的相关系数为0.994；该方法能特异性地检测CHO细胞DNA，对其他种属的DNA无扩增反应；该方法检测不同DNA加标量样品的DNA回收率相近，均值均在90％以上，3次测定的相对标准偏差均小于20％，92.6％加标样品的DNA回收率在70％～130％之间；该方法检测15批单克隆抗体类产品的DNA残留量均小于100pg／剂量，符合《中国药典》三部（2010版）有关CHO细胞残余DNA的要求。结论磁珠分离法可解决残留DNA检测中样品前处理的技术难点，定量PCR法能够简便、快速、准确地对不同工艺的单克隆抗体产品中CHO细胞DNA残留进行定量测定。

双阴性选择法纯化培养人骨髓多能成体祖细胞

目的建立体外分选纯化及培养人骨髓来源多能成体祖细胞(MAPCs)的方法.方法取健康成人志愿者适量骨髓采用梯度密度离心法分离获取单个核细胞,贴壁培养后,将获取的骨髓贴壁细胞通过CD45、血糖蛋白A(GlyA)免疫微磁珠(miniMACS)负分选,流式细胞术鉴定分选后细胞纯度;对传代到不同阶段的细胞进行CD45、GlyA流式细胞分析,初步了解MAPCs在培养、增殖过程中的免疫学稳定性.结果通过miniMACS分选,平均每1×106/ml骨髓贴壁细胞可分选出约(5～10)×104/ml的MAPCs,分选前后细胞活力分别为(96.7±1.7)%和(96.0±2.4)%,无明显差异;自制的培养基培养分选后的MAPCs生长良好,最长传代到第16代;流式细胞仪分析获取的CD45、G1yA-细胞纯度大于98%;流式细胞仪分析传代第4、8、12代MAPCs,CD45-、G1yA-细胞纯度大于98%.结论CD45、GlyA miniMACS负分选可从骨髓中分离高纯度的MAPCs;MAPCs在本室自制的人MAPCs培养基中体外有较强的增殖能力,且能保持较长时间的稳定状态.

江苏省建湖地区肠出血性大肠杆菌O157∶H7监测分析

目的了解建湖地区腹泻患者肠出血性大肠杆菌O157∶H7感染情况,家禽、家畜O157∶H7带菌情况,水源水中O157∶H7污染情况。方法在2008年5月—9月采集腹泻患者和家禽、家畜的粪便以及水源水、肉制品、苍蝇等标本计836份,应用免疫磁珠浓集、山梨醇麦康凯琼脂(SMAC)分离、生化和血清学反应进行鉴定。结果共检出肠出血性大肠杆菌O157∶H7阳性标本17份,其中腹泻患者阳性率为1.15%,4种动物粪便、肉制品均检出阳性标本,但水、苍蝇标本中均未检出阳性。菌株对青霉素耐药性最高,达100%,对其他受试抗生素均敏感。结论该地区腹泻患者和家禽、家畜中存在肠出血性大肠杆菌O157∶H7感染,且具潜在的流行性危险。

卵巢癌细胞系SKOV3冻融抗原诱导CTL特异性杀瘤效应的研究

目的探讨卵巢癌冻融抗原对T淋巴细胞的增殖作用及其诱导的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)在体外杀伤卵巢癌细胞的抗原特异性细胞毒性效应。方法采用免疫磁珠分离法(magneticactivatedcellsorting,MACS)分离纯化正常人外周血CD+3T细胞,体外以SKOV3卵巢癌细胞中提取的可溶性肿瘤抗原加以刺激。溴标法检测肿瘤抗原对T细胞增殖的影响;MTT法测定肿瘤抗原诱导的CTL体外杀伤卵巢癌细胞的能力;利用绒毛膜癌细胞抗原对比观察肿瘤抗原诱导CTL杀伤肿瘤细胞的抗原特异性。结果卵巢癌细胞抗原有很强的促进T淋巴细胞增殖的作用,且存在时间依赖性,在24h时促进作用最强。SKOV3抗原诱导的CTL在体外对SKOV3细胞的杀伤率为68.38%,显著高于它对JAR绒毛膜癌细胞的杀伤率(18.31%);而JAR细胞抗原诱导的CTL对JAR和SKOV3细胞的杀伤率分别为61.02%和14.79%,有显著的抗原特异性(P=0.0001)。结论卵巢癌细胞冻融抗原诱导的CTL在体外具有很强的增殖能力和抗原特异性杀伤卵巢癌细胞的作用。

肝干细胞及其应用的研究进展

肝干细胞(hepatic stem cell,HSC)是一类具有同时向肝细胞及胆管细胞分化和增殖以及自我更新潜能的原始细胞,当肝实质损伤尤其是肝脏大部分切除后,HSC会发生分化和高效增殖,参与到肝脏的再生和修复过程中,为机体细胞的更新提供潜在的无限细胞来源。相对于手术而言,HSC治疗具有损伤小、并发症少的优势,为终末期肝病的治疗提供了崭新的思路[1]。本文就HSC的研究和治疗进展进行综述。1 HSC的分类目前认为,HSC按照其来源可分为肝源性和非肝源性两种。肝源性HSC来源于前肠内胚层,

肝干细胞的来源与移植应用

目的:肝干细胞的研究已成为近年的热点,本文检索了肝干细胞的分类、诱导、分离、培养及移植后的鉴定方法,分析了它们与肝病的关系和临床应用前景。资料来源:应用计算机检索PUBMED2000-01/2005-01和EBSCO2000-01/2005-01期间的相关文章,检索词为“hepaticstemcells”,并限定文章语言种类为英文。同时计算机检索万方数据库2000-01/2005-01期间的相关文章,检索词为“肝干细胞”,并限定文章语言种类为中文。资料选择:对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文。纳入标准:文章所述内容应与肝干细胞的研究相关。排除标准:重复研究或Meta分析类文章。资料提炼:共收集到161篇相关文献,37篇文献符合纳入标准,排除的124篇文献中是由于内容陈旧或重复。资料综合:37篇文献中,28篇涉及肝干细胞的分类,6篇涉及肝干细胞的诱导、分离、培养及移植后的鉴定,3篇涉及肝干细胞的临床应用。一般认为肝干细胞是多源性的,可分为内源性和外源性两大类。目前已经建立的细胞分离方法主要是基于细胞表面标志的免疫分离法,包括应用流式细胞仪的荧光激活细胞分离法和免疫磁珠分离法,它们根据表面标志的有无和表达的高低来确定细胞的类型和特征。这样可能会忽略了一些标志阴性却具有肝细胞分化潜能的肝干细胞,所以肝干细胞的分离有待改进。在临床应用中,肝细胞移植为病损肝脏的细胞重建及衰竭肝脏的功能恢复提供了一种全新的治疗策略,具有移植技术简单、对受体影响小、价格相对低廉等优点,但免疫排斥、肝细胞的来源、移植肝细胞在体内的增殖等问题尚未完全解决。结论:目前对急性或晚期肝病引起的肝功能衰竭,最佳治疗方法是肝移植,包括原位肝移植、肝细胞移植和生物人工肝3种方法。原位肝移植受肝源缺乏和免疫排斥所限,受益者很少;后两者均因肝细胞来源问题,临床价值受限。而利用肝干细胞移植和肝组织工程治疗各种肝病其前景已得到肯定。

HLA-B27水平检测与强直性脊柱炎的相关性

目的探讨HLA-B27检测在强直性脊柱炎临床诊断中的应用价值。方法采用免疫磁珠分离技术和荧光显色技术相结合的单克隆干板法,对疑诊为强直性脊柱炎(AS)及有相似症状的854例患者进行HLA-B27检测。结果确诊为AS的患者中HLA-B27阳性率为90.9%(20/22)且集中在中青年男性。结论HLA-B27与AS的相关性是迄今为止所知的HLA与疾病相关性中最强的,HLA-B27抗原检测可作为AS确诊的重要辅助指标。

两种细胞因子诱导人骨髓多能成体祖细胞向肝样细胞分化的作用

本实验用免疫磁性分离(MACS)方法分选骨髓间充质干细胞(MSCs)亚群MAPCs[1],用成纤维细胞生长因子-4(FGF-4)及肝细胞生长因子(HGF)诱导其向肝细胞方向分化,并采用不同方法鉴定了细胞分化能力.

采用IMS-RT-PCR方法快速检测肉制品中大肠杆菌O157

建立免疫磁珠分离法（immunomagnetic separation,IMS）与实时荧光定量PCR（Real-time fluorescent quantitative PCR,RT-PCR）技术相结合快速检测肉制品中肠出血性大肠杆菌（EHEC）O157的方法。利用改良热酚-水法提取EHEC O157的O-特异性多糖（O-specific polysaccharides,O-SP）作为筛选抗原,制备抗EHEC O157 O-SP单克隆抗体。将PM 3-50纳米磁珠经3-乙基碳二亚胺（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）活化后,与抗EHEC O157 O-SP单克隆抗体结合,得到偶联量为150μg/mg的免疫磁珠。免疫磁珠的最高捕获量为13748.33 CFU/0.2 mg,在肉制品中特异性捕获的最低检测限为2.2 CFU/m L。根据EHEC 0157血清型的特异性基因rfb E（Gen Bank登录号：S83460）设计引物和荧光探针,将IMS与RT-PCR相结合进行检测EHEC O157。当肉制品中EHEC O157含量≥1 CFU/g（2.5 g样本）,免疫磁珠能捕获,并通过EC肉汤培养基增殖3h后,RT-PCR即可成功检测,全程只需6-7 h。IMS-RT-PCR相结合的检测方法,在大大缩短了检测时间的基础上,再次降低了EHEC O157的检测限,在防范肉制品源性致病性EHEC O157传染方面具有重要意义。

2012年东台市肠出血性大肠埃希菌O157︰H7监测分析

目的了解肠出血性大肠埃希菌O157︰H7在东台市动物宿主和腹泻患者中带菌及毒力基因携带与耐药情况。方法于流行季节采集动物宿主、腹泻患者粪便及生熟食品和苍蝇标本,mEC肉汤增菌后,用特异性免疫磁珠集菌、科玛嘉显色平板分离,纯化的菌株经生化鉴定,血清分型,以K-B纸片法进行药敏试验,采用PCR方法检测uida基因和stx1、stx2、eaeA、hly等4种毒力基因。结果 683份标本共检出O157︰H7菌株35株,检出率为5.12%,其中动物粪便检出率为10.59%(34/321),检出率最高的为牛粪(26.92%),其次为山羊粪(7.50%)和猪粪(7.32%),腹泻患者的检出率为0.39%(1/256)。35株菌株均检出eaeA和hly毒力基因,而牛粪中stx2、eaeA和hly等3种毒力基因组合型检出率达12.82%。35株菌株对氨苄西林敏感率为14.3%,对其余17种抗生素敏感率均>90%。结论东台市动物宿主和腹泻患者均不同程度携带肠出血性大肠埃希菌O157︰H7,且存在流行的潜在危险。

两种测定生物制品宿主细胞DNA残留量方法的建立

目的建立特异性强、检测限低、准确度高的生物制品中宿主细胞DNA残留量的检测方法。方法通过优化,提高磁珠分离法和化学沉淀法提取样品中残留DNA的准确度,再利用Taqman探针法对样品和标准DNA进行定量PCR(quantitative PCR,q PCR)检测,分析样品中DNA残留量。对建立的两种检测体系进行专属性、精密度、准确度、耐用性验证,并确定两种方法的检测限和定量限。结果建立的q PCR体系标准曲线的相关系数(R2)均高于0. 99,能特异性地检测CHO细胞DNA,对其他种属DNA无扩增反应。不同DNA加标量样品的DNA回收率相近,均值均在60. 0%~140. 0%,3次测定的相对标准偏差(RSD)均小于30%。不同的退火温度反应条件下,RSD不大于30%。基于磁珠分离法的qPCR检测体系能检测出DNA残留浓度为5 pg/m L的DNA样品,定量限可达10 pg/mL;基于化学沉淀法的qPCR检测体系能检测出DNA残留浓度为0. 125 pg/m L的DNA样品,定量限可达1. 5 pg/mL。结论建立并优化了两种准确测定生物制品宿主细胞DNA残留量的处理样品方法,其中化学沉淀法检测限和定量限较低,更适合低浓度生物制品的样品处理。