磁珠富集法开发毛竹SSR标记引物

用磁珠富集法筛选毛竹基因组DNA的SSR分子标记,利用磁珠法对毛竹基因组DNA的AFLP片段进行了富集,分别构建了富含GT、AG、CCA重复基元的富集文库,利用克隆PCR法对文库进行筛选,检测菌落数分别为1080、620、630个,阳性菌落中含目的重复的序列分别为137、73、41个,富集效率分别为12.7%、11.8%、6.5%。双碱基重复的富集效率高于三碱基富集效率。根据获得的序列结果,设计了53对SSR引物,其中31对引物在毛竹中成功扩增出目的大小的条带,扩增成功率为58.9%。

用磁珠富集法从AFLP片段中分离微卫星DNA标记

研究将花生基因组DNA经酶切后转变成AFLP DNA片段,然后用生物素标记的简单重复序列(SSR)作探针与其杂交,杂交复合物固定到包被有链亲和素的磁珠上,经过一系列的洗涤过程,含有SSR的AFLP片段被吸附在磁珠表面。这些片段经洗脱下来后,先用对应的AFLP引物扩增,再进行克隆和测序,根据SSR两端的保守序列设计引物,经过多态性分析后,便可得到微卫星DNA标记。整个实验过程操作简单、消耗少,可在一周内完成,可作为从植物中分离SSR的一种简单有效的方法。

磁珠富集法构建播娘蒿SSR文库及特性分析

为构建播娘蒿SSR文库，通过Dynal磁珠富集法富集生物素标记的（AC）8，（AG）8和（ATG）12探针与播娘蒿基因组的酶切片段杂交的片段，捕获含有SSR位点的DNA序列，连接到pMD18-T载体上，并转入感受态细胞DH5d，共获得778个克隆．挑选阳性克隆，利用SuperSNX24一F引物对茵液克隆进行PCR检测．利用M13F，M13R载体引物和探针结合的方法对文库进行2次筛选，获得93个长度为400～1000bp的克隆并测序．结果表明，82条序列舍有SSR位点，占测序条数的88．17％．共有SSR位点数127个．其中完全型SSR位点102个，不完全型SSR位点10个．混合型SSR位点15个，分别占SSR位点总数的80．31％，7．87％，11．81％．SSR重复基元中，以二核苷酸（CT）n，（AC）n，（GT）n，三核苷酸（GAT）n最为常见，得率分别为20．47％，26．77％，21．26％和15．75％．

磁珠富集法分离小黄李基因组微卫星DNA片段

将微卫星探针5′端生物素化后与链亲和素磁珠特异结合,用磁珠和探针的结合物与两端连接已知序列人工接头的中国李品种小黄李(Prunus salicinacv.Xiaohuangli)基因组DNA酶切片段杂交,以此杂交片段为模板用人工接头序列为引物进行PCR扩增,根据PCR产物测序结果设计引物作为微卫星DNA的标记引物.结果在随机挑选的36个克隆进行菌落PCR检测时,从31个阳性克隆中挑选18个克隆进行测序后获得了12条特异序列,设计的8对SSR引物均在5个中国李受试品种上获得了预期的扩增产物,其中4对引物在受试品种上表现出多态性.

半夏SSR分子标记的开发及四种叶型半夏的初步鉴定

采用磁珠富集法,以芍药叶型半夏作为开发基因组SSR分子标记的材料,利用获得的部分SSR引物进行了4种叶型半夏品种的初步鉴定工作,共筛选到841条半夏基因组序列,其中可用来开发SSR引物的序列有406条,最终成功设计出231对半夏SSR引物,随机挑选62对SSR引物。通过多态性分析,筛选到7对可进行四种表型鉴定的SSR分子标记。结果极大地丰富了半夏基因组信息,获得的SSR序列的重复次数平均值大于20,具有较好的多态性信息显示潜力,为下一步构建半夏指纹图谱和遗传多样性分析等研究奠定了基础。

用SSR分子标记分析无融合生殖龙须草的遗传多样性

采用磁珠富集法构建龙须草微卫星文库,并开发出27对具有多态性的SSR引物,利用其中具有扩增差异的8对稳定的SSR引物,对龙须草11个居群和71个单株进行聚类分析。结果表明：居群间共检测到123个等位基因,每对引物可以稳定检测到6~34个多态性片段。居群间的遗传相似系数为0.70~0.97,聚类分析将11个居群划分为4个类群,表明龙须草大多数居群之间的分化程度较低,与无融合生殖的特性相吻合。采用UPGMA法将分散在龙须草11个居群的71个单株分为3个群,与以居群为单位的研究结果相近;但是,星子居群内的3个单株、洋县居群的1个单株分别与本居群亲缘关系较远并与其他居群亲缘关系较近,显示在这2个居群内不同单株间存在较大的遗传差异,这种差异可能是居群内单株间无融合生殖程度不同所致。因此,在这2个居群内可能存在有性生殖频度较高的单株。

SSR引物开发方法概述

SSR标记因其丰富的多态性和共显性等优点,得以广泛应用。而应用该技术的前提是要有相应的SSR引物。文章概述了引物的来源,并对其中的开发引物进行了重点叙述。在引物开发中对各种方法作了分析和比较,并提倡在开发大量引物时使用磁珠富集法。

波纹唇鱼微卫星分子标记的筛选及适用性分析

采用磁珠富集法及利用生物素标记的（CA）15寡核苷酸探针从波纹唇鱼（Cheilinusundulatus）基因组DNABspl43I酶切位点的400～1000bp片段中筛选CA／GT微卫星位点。洗脱的杂交片段克隆到PMD18．T载体上构建富集微卫星基因组丈库后，通过PCR筛选出阳性克隆进行测序。在120条序列中有88条序列包含有重复次数不少于5次的微卫星位点，阳性序列比例达到73．33％。其中完美型（perfect）类型微卫星最多的重复次数为26次。在88条非冗长序列中，共有28条r31．82％）微卫星重复序列两端有侧翼序列能够进行引物设计。用波纹唇鱼3个个体的混合基因进行引物筛选，其中的24对具有清晰的扩增条带。将筛选的24对引物对波纹唇鱼1个群体的39个个体进行遗传多样性分析，其中4对引物扩增产物为单态，20对扩增产物呈多态性；20对扩增多态的引物在39个个体中扩增出等位基因数为2～12，平均有效等位基因数为3．5。该波纹唇鱼群体的P／C、Ho，He的平均值分别为0．0782、0．8513、0．5667。这20个微卫星位点适于波纹唇鱼群体遗传结构的研究分析。

云斑尖塘鳢微卫星分子标记的筛选与检测

用磁珠富集法分离云斑尖塘鳢的微卫星序列,由所获得的1032个克隆中筛选出146个阳性克隆,经测序81个含有微卫星序列,52个为完美型,27个为非完美型,2个为复合型,其中43个微卫星序列重复次数在10以上。所获得的云斑尖塘鳢微卫星序列中除探针中使用的CA重复单元和GA重复单元外,还有TAC等其他类型的重复单元。设计合成38对微卫星引物,其中29对引物可稳定扩增出条带,使用这些引物对云斑尖塘鳢48个个体进行检测显示:观测杂合度平均值为0.63,期望杂合度平均值为0.43。29对引物中1对引物表现为单态,7对表现为高度多态,14对表现为中度多态,7对表现为低度多态,多态性较为丰富,说明本研究开发的绝大部分微卫星分子标记较为理想。

蛇鳄龟微卫星标记的开发及一个养殖群体的遗传多样性分析

利用磁珠富集法,以生物素标记的(CA)15为探针,构建了蛇鳄龟(Chelydra serpentina L.)微卫星富集文库。通过PCR法从富集文库中共筛选出70条微卫星序列,一共设计了48对微卫星引物,采用PCR扩增的方法从中筛选出36对引物,对一个蛇鳄龟养殖群体进行遗传多样性分析。通过分析,36个位点获得的等位基因数从2—9不等,平均为4.361,有效等位基因为1.461—7.767,平均为3.498。等位基因片段大小为56—342 bp,观测杂合度为0.067—1.000,平均为0.725;期望杂合度为0.316—0.850,平均0.600;多态信息含量为0.2655—0.8359,平均为0.5573;结果表明此蛇鳄龟养殖群体存在较高的遗传多样性水平。群体内固定系数0.688—0.856,平均为0.214,说明蛇鳄龟群体中杂合子过剩。

食用菌SSR序列开发策略研究进展

SSR序列开发策略主要有3大类:传统的基因文库筛选法、GenBank筛选法和富集文库筛选法。文中在对传统的基因文库筛选法、GenBank筛选法的优缺点及在食用菌SSR分子标记的开发应用进行综述的基础上,重点综述了富集文库筛选法,即基于RAPD技术的SSR开发策略、SSR兼并引物法、序列标签法构建SSR富集文库、vectorette PCR染色体步移法分离SSR位点、Suppression PCR染色体步移法分离SSR位点、引物延伸法构建SSR富集文库以及SSR杂交捕获法构建SSR富集文库的具体设计原理和步骤,并提出食用菌中SSR分子标识的开发现状和展望。

三带喙库蚊微卫星标记的筛选及遗传多样性分析

为了便于对我国三带喙库蚊种群的遗传结构和多样性进行动态检测,本研究利用磁珠富集法进行三带喙库蚊微卫星标记的开发和筛选,共获得40个微卫星位点,且位点的多态性验证结果表明:有24个位点在不同三带喙库蚊地理株间呈现多态性。微卫星位点的遗传多样性分析结果表明:各位点的平均多态信息含量(PIC)和香农指数(SI)均较高,其中位点P17最高(PIC=0.853,SI=2.281),最低的为位点P40(PIC=0.503,SI=1.195),都属于高度多态性位点,适用于后续三带喙库蚊种群遗传多样性及遗传结构的研究。

三叶木通微卫星分子标记开发及评价

为了获得适于三叶木通遗传多样性和遗传结构研究的微卫星分子标记,该研究采用磁珠富集法构建了三叶木通微卫星富集文库。结果表明:在150个阳性克隆中发现了70个微卫星位点,富集效率为46.67%,其中含双碱基重复单元的序列占比为79.37%,三碱基和四碱基重复含有量较少。共设计引物63对,其中筛选出16对高多态引物,对1个三叶木通自然居群48个个体进行了遗传分析,结果显示位点的等位基因数为10~22个,观察杂合度和期望杂合度分别为0.370~0.792和0.724~0.936,多态性信息指数为0.725~0.919,表明以上引物均为高多态性引物。其中,12个位点偏离哈迪-温伯格平衡,呈现出纯合子过剩状态,这可能与哑等位基因和其它因素有关。综上结果表明,该研究所开发的16对引物能够用于三叶木通遗传多样性和遗传结构评价工作。

磁珠富集法分离半夏微卫星序列

目的:利用磁珠富集法分离半夏微卫星序列,以开发半夏微卫星引物。方法:根据链亲和素磁珠和生物素特异结合的特性,将微卫星探针5′端生物素化后与链亲和素磁珠特异结合,用磁珠和探针的结合物与两端连接已知序列人工接头的半夏基因组DNA酶切片段杂交,洗脱未杂交DNA片断后,建立微卫星文库。以此为模板用人工接头序列为引物进行PCR扩增,产物直接克隆,经菌液PCR筛选后测序分析。结果:得到15条半夏微卫星序列,开发效率为93.75%。结论:结果显示这是一种快速而有效的微卫星开发方法。

伊犁鲈微卫星位点的筛选及近缘物种通用性

为开发伊犁鲈(Perca schrenkii)分子标记用于鲈属鱼类种质资源保护,以伊犁鲈为材料,应用磁珠富集法进行了微卫星标记的筛选。从伊犁鲈尾鳍提取总DNA,进行酶切、接头连接、PCR扩增,再采用生物素标记(CA)15探针及生物素标记(TG)15探针对扩增产物进行杂交富集,经再次PCR扩增及T-A克隆,成功构建了伊犁鲈基因组微卫星富集文库。采用重复序列引物筛选获得阳性克隆,随机选取48个阳性克隆进行测序,测得序列46个,其中38个克隆含有微卫星序列,41个位点的微卫星重复数在8次以上。根据测得序列设计17对微卫星引物,均能在伊犁鲈群体中扩增获得目的条带。采用该17对引物对河鲈(P.fluviatilis)及黄金鲈(P.flavescens)群体样本进行扩增,10对引物具有通用性,其中6对在河鲈中具有高度多态性(PIC>0.5),5对在黄金鲈中具有高度多态性。

长江中下游黄鳝遗传多样性的微卫星分析

为了解我国长江中下游地区野生黄鳝(Monopterus albus)的种质资源现状,利用黄鳝微卫星分子标记分析我国长江中下游4个黄鳝野生群体(湖北群体、安徽群体、江苏群体和浙江群体)的遗传多样性水平。通过磁珠富集法获得50个黄鳝微卫星序列,设计并合成了30对微卫星引物,经筛选得到8对多态性稳定的引物,均为高度多态位点。每对引物扩增得到等位基因数12-26,平均等位基因数17。4个群体的平均多态信息含量分别为0.804、0.864、0.824和0.736,平均等位基因数分别为9.13、11.00、9.00和7.25,平均期望杂合度分别为0.865、0.918、0.882和0.813,表明4个黄鳝群体遗传多样性丰富,其中安徽群体遗传多样性水平最高,浙江群体相对较低。4个群体间遗传分化指数(FST)为0.031 2-0.096 5,6.28%的遗传变异存在于群体间,表明4个群体间存在一定的遗传分化。聚类分析显示,浙江群体与安徽群体先聚在一起,再与江苏群体聚为一支,湖北群体单独聚为一支。