免疫磁珠捕获联合PCR-ELISA定量检测结核分枝杆菌的方法学研究

目的采用免疫磁珠捕获（IMC）联合双内标PCR-ELISA（IMC-PCR-ELISA）技术,建立定量检测结核分枝杆菌的方法。方法制备能够特异性捕获结核分枝杆菌的免疫磁珠（Dynabeads）。并根据结核分枝杆菌Mtp40基因序列以及结核分枝杆菌复合体群IS6110序列,设计2对特异性引物（上游引物的5′端用生物素修饰）,以及2条与PCR扩增片段等长的内参照片段（其与扩增模板在引物区的序列相同）和3套捕获探针（3′端用地高辛标记）。先通过免疫磁珠特异性捕获结核分枝杆菌,再联合双内标PCR-ELISA技术检测结核杆菌。结果采用IMC-PCR-ELISA技术定量检测结核分枝杆菌,全过程约4h,检测限为5×10^3 copies/mL,当低内标模板浓度在30-70copies/mL,高内标模板浓度在8 000-12 000copies/mL时,计算出的浓度与实际加入的目的模板浓度之间有良好的线性关系（r^2=0.998）,未发现非特异性反应。结论成功建立了IMC-PCR-ELISA定量检测结核分枝杆菌的方法,此方法具有快速、灵敏、特异、可定量的特点。

磁珠捕获技术在定量液相杂交中的应用

目的 :在建立新的微生物DNA液相定量杂交法的基础上 ,检测了 10株临床分离菌间染色体DNA的杂交率并与固相板法进行比较 ,为该法的推广应用奠定了基础。方法 :根据SYBRGreen1能够特异性结合双股DNA的特性 ,借助链霉亲和素包被磁珠的分离技术和偏振荧光探测方法的敏感性 ,分别捕获和检测游离于杂交液中两种DNA形成的杂交体 ,计算两者间的同源性。结果 :本法测得的 5株肠杆菌科标准菌株和临床分离株种间或科 /属间的杂交率与发表值一致。提示该法可用于各种细菌间的同源性测定 ,且结果稳定、可靠。结论 :偏振荧光法定量测定细菌染色体的同源性 ,具有简便、快速、敏感、特异等优点 ,可以避免微孔板定量杂交法中因DNA脱板所造成的误差 ,便于临床推广应用。

微流控芯片中磁珠捕获的数值仿真

在微流控芯片中,利用磁场力操控技术实现磁珠的有效捕获在生物检测和生化分离等方面应用广泛,其在微尺度下的运动特性与磁场力和黏滞阻力的关系显得尤为重要。根据磁珠在微通道中的受力和运动方程,建立磁场和流场共同作用下磁珠的二维动力学数值模型,对三种磁场分布下磁珠的运动特性以及不同入口速度和磁场强度对磁珠捕获率的影响进行数值仿真。研究表明:磁体高宽比(h/w)越大,磁体内部的磁通密度越大且分布越均匀。当磁体高宽比从0.5增至6时,极性相同磁体的捕获率范围为26.7%~100%;极性相反和单磁体的磁珠捕获率最大值分别为63.3%和53.3%。双磁体的磁化方向对捕获率的影响为:h/w<2时,极性相反的磁珠捕获率较大;反之则小于极性相同的捕获率。通过仿真计算,入口流速介于1mm/s^2cm/s时,磁珠捕获率随流速的增加而减小。结果可用于实验指导流体流速进而优化磁珠使用量;并对微流控芯片的设计具有理论指导意义。

磁珠捕获法在去除残留消毒剂中的应用

目的研究磁珠捕获法在化学消毒剂杀菌效果试验中去除残留消毒剂的应用。方法通过中和剂鉴定试验程序,采用活菌计数法,评价磁珠捕获法去除残留消毒剂的效果。结果裸磁珠Ⅱ的吸附性能最佳,吸附率>99.25%。0.03 mol/L PBS溶液较大得削弱了裸磁珠的吸附性能,其余溶液几乎无影响。磁珠捕获法与中和剂法结合后,能进一步去除残留消毒剂。结论磁珠捕获和中和剂结合法能有效降低中和剂筛选的难度和复杂度,是一种较实用有效的评价化学消毒剂杀菌效果的方法 。

空肠弯曲菌的磁捕获_-荧光PCR检测方法的建立

为提高畜禽类食品中空肠弯曲菌的检出率和灵敏度 ,应用抗血清和磁性微珠首次制备弯曲菌免疫磁珠 ,利用弯曲菌免疫磁珠直接捕获检样中目的菌 ,不需要增菌培养 ;通过荧光PCR检测鞭毛蛋白A(flaA)基因和 或马尿酸酶 (hipO)基因 ,首次建立空肠弯曲菌的磁捕获_荧光聚合酶链反应 (IMC_FPCR)方法。IMC_FPCR法检测空肠弯曲菌方法简便易行 ,可在 2 4h内完成 ,特异性好 ,检测低限达到 10cfu mL ,抗干扰性强。IMC_FPCR方法可望解决非可培养状态的空肠弯曲菌检测难题 ,是一种适用于检验检疫、卫生防疫和农产品安全检验等领域的快速方法。

3种快速检测生肉中单核增生李斯特菌的方法研究

目的应用荧光定量PCR技术（Real-time PCR）和磁免疫分离技术（Immunomagnetic separation，IMS）及显色培养技术优化组合，建立对生肉中单增李斯特菌的快速检测方法。方法应用3种快速检测方法检测模拟样品和423份肉制品中的目标菌，比较不同方法的敏感度和特异度。结果用PCR—IMS法48h可达检出限为10～20CFU／10g，实际检测效果显著优于其他两种方法。结论PCR-IMS是检测单增李斯特菌可靠、灵敏、快速的确证方法。

红麻微卫星DNA的分离

分别采用RAPD、锚定PCR和磁珠捕获等3种方法富集含微卫星序列的红麻基因组DNA片段,并连接到pMD18-T载体,构建基因组文库.然后以通用引物M13F,M13R和根据微卫星核心序列所设计的引物[VRV(CT)12或VRV(TG)12],用PCR方法直接对文库筛选,并将获得的阳性克隆进行测序.分别从RAPD,锚定PCR和磁珠捕获3种富集方法构建的基因组文库中获得6,23,19个微卫星位点.

用免疫胶体金快速诊断卡初筛粪便中的O157∶H7大肠杆菌

我们用O15 7∶H7大肠杆菌免疫胶体金快速诊断卡 ,对腹泻患者粪便标本中的E .coliO15 7∶H7进行初筛 ,然后再用免疫磁珠捕获集菌及病原菌的分离和鉴定。结果发现 ,该诊断卡可检测到每卡 70个菌细胞。诊断卡强阳性的粪便标本 ,91 18%可以分离到O15 7∶H7大肠杆菌 (31/34 ) ;诊断卡弱阳性的粪便标本 ,5 47% (7/12 8)可以分离到O15 7∶H7大肠杆菌 ;诊断卡阴性的粪便标本 ,没有分离到病原菌。O15 7∶H7大肠杆菌免疫胶体金快速诊断卡是一种快速、灵敏、简便的技术 ,可用于对疑似病例的早期诊断和对粪便标本进行初筛 ,减少了工作量 ,值得推广。

循环肿瘤DNA在恶性肿瘤早期诊断和预后的研究进展

癌症是威胁人类健康的主要疾病之一。肿瘤的早发现和精准治疗是人类面临的世界性医学难题,基于痕量、无创、实时快速检测技术,检测患者循环肿瘤DNA(ctDNA),分析患者表观遗传学特点,在分子水平为临床医生提供精细的分类及诊断,可实现对患者提供个性化精准治疗的解决方案。近年来,日益发展的各种基于血浆ctDNA的分子诊断技术可为恶性肿瘤的早期诊断、预后评估和用药指导提供有重要价值的生物标志,为恶性肿瘤的临床精准治疗提供新的途径。

香石竹环斑病毒多种PCR检测方法的建立与评价

以香石竹环斑病毒(Carnation ringspot virus,CRSV)的5个分离物为研究对象,分别建立了快速检测香石竹环斑病毒的多种PCR方法。结果表明,这些方法的灵敏度都比DAS-ELISA的灵敏度高,其中SYBR Green RT-PCR的灵敏度最高,可检测CRSV RNA的最低量是6.4pg。免疫磁珠RT-PCR(IMS-RT-PCR)和普通RT-PCR最低可从400ng的带毒叶片中检出CRSV,而免疫捕获RT-PCR(IC-RT-PCR)最低灵敏度可从40ng的带毒叶片中检出CRSV,是普通RT-PCR的10倍。

正常人类角膜基质中的骨髓来源细胞

目的：探讨正常人类角膜基质中骨髓来源细胞是否存在。 方法：使用56～71岁的34名捐赠者角膜，其基质经过免疫组化荧光显微成像技术进行检测。运用磁珠捕获技术，在胶原酶消化处理后的基质中分离CD45＋和CD45-细胞并分析TOLL样受体4的表达。

一种检测活的非可培养状态空肠弯曲菌的新方法

为提高活的非可培养状态空肠弯曲菌的检出率,建立了一种免疫磁珠捕获-荧光聚合酶链式反应法。该法包括应用免疫磁珠技术制备弯曲菌免疫磁珠,以直接捕获受检样品中的空肠弯曲菌,并设计了检测空肠弯曲菌马尿酸酶(hipO)基因的引物与荧光标记探针。结果表明:磁捕获-荧光聚合酶链式反应法可直接检测空肠弯曲菌,无需增菌培养,具有灵敏度高、选择性好、简便、快速等特点,可在24h内完成样品中活的非可培养状态空肠弯曲菌的检测。

应用磁免疫技术快速检测三种新发病原菌

目的应用磁免疫分离技术（IMS）建立对3种新发病原菌（O139群霍乱弧菌、EHEC O157∶H7、单增李斯特菌）的快速检测方法。方法将IMS分别与显色培养（chromogenic media,Ch）和荧光定量PCR技术结合,建立了IMS-Ch、IMS-PCR两种新方法,研究不同方法的灵敏性和特异性,并对高危样品的检测效果进行评价。结果 IMS-Ch法24 h能检出目标菌含量≥50 cfu/10 g的样品,IMS-PCR法用于检测EHEC O157∶H7和霍乱弧菌,9 h可达检出限为10~20 cfu/10 g,实际检测效果评价的尤等指数〉95%。结论 IMS-PCR是一种可信的快速筛选方法,IMS-Ch法为较国标法灵敏、快速的确证方法。

四种快速检测大肠杆菌O_(157):H_7的方法研究

目的:将磁免疫分离技术(immunomagnetic separation,IMS)与显色培养(chromogenic media,Ch)和荧光定量(Re-al-time,R-t)PCR技术结合建立快速检测肉制品中EHECO157:H7的方法。方法:应用四种快速检测方法检测模拟样品和423份肉制品中的EHECO157:H7,比较不同方法的灵敏度和特异度。结果:IMS-Ch法特异性最好,24 h对目标菌含量1-5 CFU/10 g的样品检出率为95%。IMS-PCR对实际样品检测效果评价的尤等指数最高。结论:IMS-PCR是一种可信的快速筛选方法,IMS-Ch法为灵敏、快速的确证方法。

23起疑似霍乱疫情的快速诊断和分子流行病学分析

目的应用建立的4种快速检测技术检测霍乱疫情标本,根据霍乱病例诊断结论,优化快速诊断方案来鉴定和识别霍乱疫情。方法应用免疫胶体金(IMG)、免疫磁珠富集(IMS)、实时荧光PCR(Rt-PCR)、显色培养基(Ch)四种快速检测技术优化组合,建立了IMG,IMS-PCR,IMS-Chr,Rt-PCR四种方法,用于腹泻疫情样品中霍乱弧菌(O1、O139)的快速检测。通过对23起疑似霍乱疫情的123份标本,239份霍乱流行期外环境样品的实际检测,评价4种方法的灵敏度,特异度,尤登指数。选择最佳组合方案用于霍乱疫情诊断。结果 IMS-PCR用于检测腹泻粪便和外环境样品中的霍乱弧菌,尤登指数>90%,较一般的快速筛选方法具有更高的准确性,适用于快速确认检测。Realtime-PCR法的灵敏度最高,适于快速筛选。结论通过IMS-PCR和Realtime-PCR法的联合诊断,效果最佳。优化的快速检测方案,能够对霍乱疫情实现有效及时的监控。