磁珠分离纯化技术在实时荧光定量PCR检测HBVDNA中的应用

目的评价磁珠分离纯化技术（简称磁珠法）提取核酸的重复性、提取效率一致性、线性范围、灵敏度及抗干扰性，初步探讨其在实时荧光定量PCR检测HBVDNA中的应用价值。方法采用磁珠法提取HBVDNAlog值分别为4。16，5．23和7．04的质控血清进行重复性试验，HBVDNA阳性血清10倍梯度稀释的系列标本评价其提取效率一致性，HBVDNA强阳性血清作10倍系列稀释后检测其线性范围，HBVDNA标准血清与舍干扰成分（溶血、黄痘和脂血）的HBVDNA阴性血清，按4：0，3：1，2：2，1：3和0：4比例分别混合成5个不同浓度标本用于千扰试验。以提取方法为沉淀煮沸法的PCR荧光诊断试剂作对照，应用磁珠法及配套扩增试剂检测288份乙型肝炎患者血清HBVDNA含量，并比较测定结果。结果磁珠法批内和批间平均变异系数分别为3．66％和4．75％；HBVDNA含量不同的血清提取效率均在98％以上；在1．28×10^2 IU／L～1．28×10^9IU／L之阍有良好的线性关系；最低检出限为60．5IU／L；不同浓度的黄疸和脂血对扩增曲线和实验结果无明显影响；血清中血红蛋白浓度至50g／L时，HBVDNA结果相差约0．5～1．0个数量级。磁珠法和沉淀煮沸法的阳性率分别为88．19％和82．64％。当沉淀煮沸法检测结果log值处在2．699～4．000之间时，两法检测相应标本结果差异有统计学意义。结论磁珠法高效、快速和易于自动化，应用于HBVDNA检测对乙型肝炎患者的临床诊断和疗效监测将有十分重要的意义。

KingFisher磁珠纯化仪在提取脱落细胞检材DNA上的应用

目的验证利用KingFisher磁珠纯化仪提取脱落细胞DNA的效率。方法使用磁珠法及KingFisher磁珠纯化仪的富集浓缩程序和纯化程序提取脱落细胞DNA,并进行STR检验和结果统计。结果对45例脱落细胞生物检材进行DNA提取检验,获得完整STR分型的29例,成功率达到64%。结论 KingFisher磁珠纯化仪提取脱落细胞检材DNA,方法简单快速,成功率高,可以用于案件DNA检验应用。

大鼠肺微血管内皮细胞的体外分离培养与纯化

旨在建立一种简单易行、获得细胞纯度较高的体外分离、培养大鼠肺微血管内皮细胞的方法。取5~7日龄SD大鼠分离外周肺组织,组织植块法获得原代大鼠肺微血管内皮细胞,37℃、5%CO_2培养箱中传代培养,采用免疫磁珠法对其进行分离纯化,并对分离纯化后的细胞进行免疫荧光及流式细胞鉴定,通过MTT比色分析法准确、安全、可靠地检测纯化后传代肺微血管内皮细胞的增殖情况。结果显示：倒置显微镜下观察单个细胞呈短梭形或多角形,汇合后呈铺路石样,单层贴壁生长,细胞分离纯化后经免疫荧光检测CD31呈阳性,流式细胞仪检测淋巴管内皮细胞表面特有标记VEGFR-3呈阴性（P=0.1,且P〈0.5）,且复苏后经MTT测得传代细胞的增殖情况良好。成功建立了一种分离高纯度大鼠肺微血管内皮细胞的体外培养方法。

小鼠核糖核酸酶抑制剂异源高效可溶性表达、纯化及活性研究

为获得高效可溶性表达的小鼠核糖核酸酶抑制剂(MRNI),本文通过构建含SUMO、IF2、GST、NusA、MsyB、Trx和MBP融合标签的重组表达载体,以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌进行自诱导(auto-induction,AI)表达,利用MagNi磁珠检测及电泳分析MRNI的表达状况,并对其培养温度及时间进行优化,同时,与其他公司核糖核酸酶抑制剂(RI)活性进行对比。结果表明,重组菌BL21(DE3)(pNBEII-MRNI)诱导表达的可溶性融合蛋白IF2-MRNI的产量最高,最适诱导条件为37℃,诱导培养6 h,20℃培养24 h。磁珠纯化后获得的融合蛋白IF2-MRNI浓度为3621.3 mg/L,检测其酶活性约为40 U/μL。该酶具有抑制RNase A活性,防止RNA被降解的作用,为RI的生产及应用提供理论基础。

大鼠肺微血管内皮细胞原代细胞制备及纯化的方法改进

为获得纯度较高的大鼠肺微血管内皮细胞,试验采用以下试验方法.（1）改进组织贴块法制备原代细胞：原代细胞制备分装组织块时,可用血清将过多的组织块吹下继续贴壁,可提高原代细胞的制作效率;与传统方法60h弃组织块相比,50h弃组织块细胞状态更好,主要杂细胞成纤维细胞较少.（2）改进免疫磁珠纯化法纯化细胞：在免疫磁珠纯化的过程中,抗体使用说明书和大量文献表明,抗体在4T：效价较髙,因此在孵育抗体时由标准操作方法中的室温孵育改为4t孵育;摇床摇晃EP管时发现有大量泡沫产生,影响了细胞、抗体、磁珠的充分接触,因此改为3～5min手动摇晃一次;在纯化后的培养基中加入内皮细胞生长支持物（ECGS）易导致细胞形态的变化,影响细胞活性,因此采取在纯化后就加入完全培养基代替纯化后2h加入含有ECGS的完全培养基等手段.结果表明,改进后试验方法较标准法所得细胞数量多,状态佳,因此提髙了细胞纯化的效率和纯化后的细胞质量.

原代SD大鼠CD4^+T细胞的分离纯化及鉴定

目的:建立一种获得高质量、数量多的原代CD4^+T细胞的有效可靠的方法。方法:依次采用密度梯度离心(procell density Centrifugation)和免疫磁珠分选法从SD大鼠新鲜脾脏中分选出CD4^+T细胞,CD4^+T细胞生长状况及特点采用倒置相差显微镜观察、提取细胞的纯度以流式细胞术鉴定。结果:流式细胞术鉴别CD4^+T细胞纯度为96%,其中(CD4^+T+CD62 L双标)初始CD4^+T细胞纯度为60. 7%,与密度梯度离心收集的单核细胞(CD4^+T细胞纯度为0. 2%)比较,差异均有统计学意义(P <0. 01)。通过形态学观察从原代SD大鼠脾脏中分离的CD4^+T细胞,表现为透明圆颗粒状悬浮生长,48h内活性最高。结论:采用密度梯度离心分离,免疫磁珠分选纯化原代大鼠初始CD4^+T细胞具有数量多、活性好、纯度高、生物学特性稳定的优点,可用于相关研究。

Treg细胞中关键转录因子Foxp3相互作用蛋白的鉴定与分析

目的鉴定Treg细胞中Foxp3相互作用蛋白。方法构建包含SBP和Protein G结合肽的Tags的Foxp3 knock-in转基因小鼠,分选Treg细胞,用亲和磁珠法纯化Foxp3相互作用蛋白复合体,质谱测序鉴定复合体蛋白组分并进行蛋白质组学分析和蛋白相互作用的验证。结果流式细胞分选的Treg纯度超过90%;经过亲和磁珠法纯化和质谱分析显示Foxp3有100个以上候选相互作用蛋白伙伴;免疫共沉淀方法初步鉴定部分伙伴蛋白间可相互结合。结论本研究在小鼠体内Treg细胞中初步获得Foxp3候选相互作用蛋白并证实部分蛋白间可相互作用,为这些蛋白对Treg细胞的功能鉴定提供基础。

基于双富集微流控技术的食品中蜡样芽孢杆菌快速检测

为实现食源性致病菌多场景即时检验,替换常规检验及快检技术中耗时的增菌培养过程,以缩短检验时间和降低实验环境及设备要求。研究以蜡样芽孢杆菌为研究对象,采用双层膜富集样品中菌体,磁珠提取纯化微量DNA的方式,取代增菌培养过程,同时将环介导等温扩增反应与微流控芯片相结合,有效避免扩增中气溶胶污染问题。实验结果显示:使用双富集微流控技术检测食品中蜡样芽孢杆菌,可将现行国标的检验时间由5~7 d缩短至1 h内,方法特异性良好,检出限为10 CFU/g(mL)等同于现行国标,Ct值变异系数<5%,显示重复性好。研究建立的双富集微流控技术快速检测食品中蜡样芽孢杆菌方法可实现食源性致病菌即时快速检验,为食源性致病菌引起的食品安全事件和舆情风险防控快速反应提供技术支撑。

融合蛋白NusA-hRI的高效异源表达、纯化及活性分析

人核糖核酸酶抑制因子(human ribonuclease inhibitor,hRI)是一种能够调节核糖核酸酶活性的酸性包浆蛋白。通过构建含SUMO、IF2、GST、NusA、MsyB、Trx和MBP融合标签的重组表达载体,以大肠杆菌BL21(DE3)作为宿主菌进行自诱导(auto-induction,AI)表达,从而使hRI的表达量得以提升。利用MagNi磁珠纯化及电泳分析hRI的表达状况,通过RNase/Sepharose亲和层析获得纯度较高的蛋白。纯化后获得的融合蛋白浓度为2 960. 513mg/L,与其它公司的hRI活性进行比较,检测其酶活性约为50U/μl,并使其成功用于RNA的保护,为Nus A-hRI的应用提供理论依据。