鱼肉中氯霉素检测用抗体包被金磁纳米微粒修饰安培免疫传感器

研制了基于氯霉素抗体包被Fe3O4/Au金磁纳米微粒(GMP)和三乙撑四胺铜(Ⅱ)(CuL)共固定修饰平面热解石墨电极的安培免疫传感器(PRG|CuL/anti CAP-GMP),用于测定鱼肉中CAP含量。该免疫传感器是利用外加磁场,将antiCAP-GMP吸引到CuL修饰的PRG电极(PRG|CuL)表面制备而成。CuL对H2O2还原具有良好的电催化能力,当该传感器在含CAP样品液中温育后,CAP与电极表面的anti CAP的免疫结合物导致CuL对H2O2的催化还原电流(I)降低,电流下降值(△I)和CAP浓度成正比,可用于CAP定量测定。在25℃的pH=6.5磷酸盐缓冲液(PBS)中温育30 min,该传感器对CAP的检测线性范围为0.6～110 ng/mL,检出下限为0.092 ng/mL(3σ法)。应用于鱼肉中CAP检测并与传统的液相色谱法(HPLC)比较,结果一致,其添加回收率在97%～104%之间。该免疫传感器集分离、富集为一体,电极表面可更新,检测灵敏快速,对于水产品中痕量氯霉素分析提供了一种新颖的方法。

金磁纳米微粒表面蛋白偶联率的测定

金磁纳米微粒因兼具独特的光学性质及超顺磁性而受到广泛关注.对这种复合材料表面标记蛋白的定量为后续应用提供了必要的前提,也为免疫探针的构建提供了空间分布的基本信息.鉴于此,本研究对金磁纳米微粒表面偶联蛋白进行定量.表面改性的金磁纳米微粒表面含有大量羧基,为后续的蛋白偶联提供了偶联位点,以碳二亚胺(EDC)作为连接因子可将链亲合素(SA)化学键合于金磁纳米微粒表面.为得到准确的蛋白偶联率,以三氯乙酸排除EDC对Lowry法的干扰,结合金磁纳米微粒密度的计算以及SA的相对分子量,可以确定其偶联率为18个SA/金磁微粒.

纳米磁微粒化学发光法临床检测总IgE抗体和过敏原sIgE抗体的方法学比对

目的对纳米磁微粒化学发光法平台(纳博克)检测临床样本中的总IgE抗体和过敏原特异性IgE抗体进行方法学比对。方法参考美国临床和实验室标准协会的相关文件,针对总IgE抗体以及屋尘螨D1/粉尘螨D2/交链孢霉M6/蟑螂I6/猫上皮E1/艾蒿W6/牛奶F2/蛋白F1/小麦F4/虾F24/花生F13共计11项过敏原,对纳博克和ImmunoCAP系统的一致性采用卡方检验和Kappa检验进行比较及评价。结果11项过敏原两种方法学比对的Kappa值均>0.75,表明两种方法学具有较好的一致性。除了交链孢霉和小麦两项外,其余项目的阴性、阳性、总符合率和±1级符合率均在90%以上,表明两种方法学的定性一致性良好;Spearman相关系数(r)均位于95%置信区间(CI)内,表明两种方法学的量值具有显著相关性。结论纳博克纳米磁微粒化学发光法过敏原检测平台与ImmunoCAP系统具有良好的一致性,前者的样本用量更少,是一种建议临床推广使用的全定量过敏原检测方法学。

七种猪常见病毒核酸磁-纳米微粒可视化快速检测技术的建立与应用

随着集约化养殖业的发展,规模化养猪场对于病原的早期快速检测需求逐步增高,本研究旨在建立针对猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、猪瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)、猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2,PCV2)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪伪狂犬病病毒(porcine pseudorabies virus,PRV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪细小病病毒(porcine parvovirus,PPV)等7种常见病毒病病原感染的广谱磁纳米微粒可视化(ultrasensitive nanoparticle visualization detection,UNVs)现场检测技术。根据不同病毒的复制酶区域的高度保守区域,设计探针和引物,通过探针的筛选和条件的优化,得到具有特异性强、富集效率和杂交效率高的目的病原基因序列特异性识别探针(富集探针和杂交探针),分别与四氧化三铁磁性微粒和纳米金偶联,制备成针对每种病原的特异性功能化磁珠和功能化纳米金。以功能化磁珠为载体富集核酸信号,功能化纳米金做桥梁放大信号,使用双探针同时检测病原核酸,结合碱性磷酸酶的酶促可视化反应检测信号,建立针对猪PCV2、PRV、PPV、PEDV、TGEV、PRRSV和CSFV等7种病毒的现场可视化UNVS便捷诊断技术。结果显示,筛选设计的核酸探针与猪的其它病原无交叉反应,特异性良好。建立的针对PCV2、PRV、PPV、PEDV、TGEV、PRRSV和CSFV病原的UNVs可视化检测技术,检测限为103 copies·mL^(-1)(血清样本)或103 copies·g^(-1)(粪便样本),基本上达到了PCR或RT-PCR的检测敏感度,灵敏度组内与组间最大变异系数均小于5%,显色结果稳定,无较大差异,有良好的重复性,单个样本的检测可在4 h以内完成。应用该技术和PCR检测对来自陕西省的499份临床样品(疑患有PCV2、PRV、PPV、PEDV、TGEV、PRRSV和CSFV的猪的血清、粪便样品)进行同步检测和复检,结果显示,建立的针对7种病原的UNVs可视化检测方法不仅具有与普通PCR相同的敏感度,甚至与普通PCR相比有更高的检出率。本研究成功建立了针对PCV2、PRV、PPV、PEDV、TGEV、PRRSV和CSFV病原的UNVs可视化检测技术,具有灵敏度较高、检测范围广以及特异性和可靠性良好的优点,为猪的多种病原提供了一种快速、准确、灵敏的诊断技术。

纳米磁微粒的激光散斑位移测量系统

为了实现对磁流体的运动形态及磁微粒聚集离散位移量的测量,设计了一种纳米磁微粒的激光散斑位移测量系统。采用激光器、CCD器件、差分放大器、高速A/D转换器及FPGA芯片等器件,完成了散斑信号高速采集系统,单通道信号采集速度达到3 Msps,8通道并行处理,实现了毫秒级图像采集要求;实现了USB2.0高速通信接口,使数据传输速率达到30 MB/s,完成了激光散斑信号的高速实时数据传输;设计了本系统硬件设备的驱动程序以及数据实时处理的Win32应用程序,完成了散斑信号的数据处理,测量分辨力达到纳米尺度。所实现的纳米磁微粒的激光散斑位移测量系统达到了纳米磁流体表征检测对分辨力和系统响应时间的要求。

超顺磁氧化铁纳米微粒在HER-2阳性乳腺癌模型MRI和荧光成像中的应用

目的分析超顺磁氧化铁纳米微粒(SPIONs)在人表皮生长因子受体2(HER-2)阳性乳腺癌模型磁共振成像(MRI)和荧光成像中的应用。方法建立纳米探针,对其表征进行检测。制备乳腺癌小鼠模型,采用纳米探针于小鼠尾静脉注射,采用荧光成像和MRI判断纳米颗粒能否聚集于乳腺癌病灶部位。分别设置对照组、A组(应用四氧化三铁-免疫球蛋白G-吲哚菁绿)、B组(应用曲妥珠单抗+四氧化三铁-曲妥珠单抗-吲哚菁绿)、C组(应用四氧化三铁-曲妥珠单抗-吲哚菁绿)。检测纳米颗粒表征,给予小鼠活体MRI和活体荧光成像检查。结果本实验通过建立SPIONs,纳米颗粒平均粒径为(25.89±3.63)nm。偶联后的纳米颗粒于828处存在明显吸收峰,与荧光染料吲哚菁绿的荧光发射波长相同。纳米颗粒弛豫率较高,达107.67 nM^-1·s^-1。纳米颗粒溶液在近红外激光持续照射后的温度最高达57.85℃。采用纳米探针于小鼠尾静脉注射1 d后,活体MRI癌灶部位T 2信号最低。C组小鼠癌灶部位△T 2值为(30.68±5.14)ms,较对照组(3.13±0.98)ms、A组(4.52±1.15)ms、B组(12.14±2.25)ms显著升高(P<0.05);B组小鼠癌灶部位△T2值较对照组和A组显著升高(P<0.05)。活体荧光成像可见纳米颗粒于小鼠癌灶组织和腹腔脏器出现一过性浓聚,且经膀胱进行排泄,1d后于癌灶部位出现明显聚集。结论构建四氧化三铁-曲妥珠单抗-吲哚菁绿的SPIONs纳米探针可能是HER-2阳性乳腺癌MRI和荧光成像的一种潜在显像剂。

磁导向纳米磁微粒栓塞脑动静脉畸形的实验研究

目的探讨磁导向纳米磁微粒定向栓塞脑动静脉畸形(CAVM)的有效性和可靠性。方法将建立了CAVM模型的15头小猪随机分为3组:磁导向组(聚焦磁场导向,n=6),非磁导向组(无聚焦磁场导向,n=6)和对照组(不做任何处理n=3),前两组均采用纳米磁微粒栓塞CAVM。分别在栓塞后1周进行DSA和B超声检查,观察栓塞效果。结果磁导向组在栓塞1周后DSA显示,CAVM和引流静脉几乎全部消失。术后1周B超示引流静脉无血流,右侧颈静脉血栓形成;平均流速为0,与非磁导向组的(70.22±2.26)cm/s和对照组的(75.53±2.24)cm/s相比,差异显著(P<0.01)。结论实验证实在磁场作用下,纳米磁微粒可以有效地、可靠地靶向栓塞小猪的CAVM。这可能为临床治疗CAVM提供了新的途径和栓塞材料。

基于纳米磁微粒化学发光技术的S100B蛋白新型检测试剂和仪器的研究

目的:研发一种S100B蛋白新型检测试剂及仪器,为颅脑创伤疾病的诊疗提供参考。方法:将S100B蛋白单克隆抗体与生物素(Biotin)、S100B蛋白抗体与辣根过氧化物酶(HRP)、链霉亲和素与羧基磁珠分别按照一定比例进行交联并稀释,制备R1、R2、R0试剂,再用校准品稀释液稀释S100B蛋白抗原制备校准品。S100B蛋白新型检测仪器由试剂模块、反应模块、清洗模块、检测模块4个部分组成,具体由试剂盘、样本盘、磁微粒盘、装载台、反应盘、清洗盘和检测盘构成。结果:成功制备了用于颅脑创伤患者S100B蛋白检测的新型试剂,研发了配套的化学发光免疫分析仪器,实现了加样、反应、清洗、检测的模块化和自动化。经过临床测试,该试剂和仪器可以准确获得S100B蛋白的浓度。结论:S100B蛋白新型检测试剂和仪器可以提供S100B蛋白的快速批量检测,将为颅脑创伤病情的判断提供重要保证。

纳米磁微粒化学发光法定量检测抗核抗体谱的临床应用

目的研究全自动、定量纳米磁微粒化学发光法(NM-CLIA)检测抗核抗体谱中10种自身抗体的临床应用价值,为抗核抗体谱检测方法的选择提供参考。方法收集2016年10月至2018年2月南方医科大学第三附属医院自身免疫性疾病患者血清1 037例,健康体检者血清200例,用NM-CLIA检测血清抗干燥综合征抗原A60(SSA/Ro60)抗体、抗干燥综合征抗原A 52(SSA/Ro52)抗体、抗干燥综合征抗原B(SSB/La)抗体、抗双链DNA(ds-DNA)抗体、抗核糖核蛋白(RNP)抗体、抗史密斯(Sm)抗体、抗着丝点蛋白B(CENP-B)抗体、抗核糖体P蛋白(Rib-P)抗体、抗核糖体(Nuc)抗体、抗组蛋白(His)抗体,同时应用线性免疫印迹法(LIA)平行检测以上抗核抗体谱,对检测结果进行统计学分析。结果 NM-CLIA在检测血清中10个常见自身抗体时具有较高特异性,均达95%以上;NM-CLIA与LIA对10个自身抗体具有相当的检出率,与文献报道的疾病抗体发生率一致;两种方法在检测抗SSA60抗体、抗SSA52抗体、抗SSB抗体、抗RNP抗体、抗CENPB抗体、抗Nuc抗体和抗His抗体时,表现出良好的一致性(Kappa>0.75,P<0.05),而在检测抗ds-DNA抗体、抗Sm抗体、抗Rib-p抗体时一致性一般(0.4<Kappa<0.75,P<0.05);抗ds-DNA抗体、抗Sm抗体、抗Rib-p抗体在两种方法检测中结果不一致的样本经第三方试剂验证结果显示,NM-CLIA与第三方试剂在检测抗ds-DNA抗体、抗Sm抗体、抗Rib-p抗体时,差异无统计学意义(P>0.05);LIA与第三方试剂检测结果比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 NM-CLIA检测特定抗核抗体谱时具有良好的特异性及检出率,两种方法在检测抗SSA60抗体、抗SSA52抗体、抗SSB抗体、抗RNP抗体、抗CENPB抗体、抗Nuc抗体和抗His抗体时具有良好的一致性,而在检测抗ds-DNA抗体、抗Sm抗体、抗Rib-p抗体时一致性一般,NM-CLIA与第三方试剂的检测结果更吻合。由于NM-CLIA具有全自动、简单、快速、定量、特异性好以及随机组合检测项目等优点,更值得临床推广应用。

牛奶过敏原β-乳球蛋白的重组制备及磁微粒化学发光检测法的建立

运用原核系统表达牛奶β-乳球蛋白(Bos d5)蛋白,建立一种纳米磁微粒化学发光方法用于检测牛奶组分过敏原β-乳球蛋白特异性Ig E抗体的含量。通过优化合成牛奶β-乳球蛋白基因,与质粒重组导入Rosetta原核表达菌株中表达目标蛋白,纯化的重组蛋白采用生物素标记后,在化学发光平台上进行过敏原项目检测。获得纯度﹥85%的22.5 kD重组牛β-乳球蛋白,将生物素化的重组蛋白用于牛奶β-乳球蛋白纳米磁微粒检测试剂盒,检测临床110例血清样本,和Phadia进行方法学比对阳性符合率为88.9%,阴性符合率97.3%,总符合率94.5%,P<0.001,χ^2=84.238,Kappa=0.874,其与Phadia参照试剂盒同样具有良好的检测能力。原核表达系统中获得的重组牛奶过敏组分β-乳球蛋白具有较好的免疫活性,开发的免疫诊断试剂盒具备良好的性能,可用于临床辅助诊断。

反应条件对配体交换法制备纳米粒子的影响及其在比色检测中的应用

纳米粒子具有极高的比表面积、过剩的表面自由能,极易相互靠近产生团聚,对纳米粒子进行表面修饰及生物功能化是其在生物医药领域应用的前提条件.利用Au-S间的强亲合性,可在CTAB-Fe3O4/Au纳米粒子表面发生配体交换反应,制备MUA-Fe3O4/Au纳米粒子,而配体交换反应条件对表面修饰效果可产生直接影响.本文对比了两种不同反应条件制备的MUA-Fe3O4/Au纳米粒子的胶体分散稳定性,并在表面偶联兔IgG,构建得到了两种免疫探针,且在液相体系中检测对应的羊抗兔IgG抗体.结果表明,长时(24h)水浴超声反应可以得到更好的配体交换效果,且在比色检测中具有更高的灵敏度和更快的检测速度.

硅油基钴/Fe_3O_4复合磁流体的研制及磁性能

用化学法制备纳米钴、Fe3O4微粒,用月桂酸、月桂酸钠对其进行表面改性后制成磁胶粒,磁胶粒经中间体包覆后二次分散于硅油中,得到饱和磁化强度值为106.25mT、透光率低于2%的硅油基钴/Fe3O4复合磁流体。利用振动样品磁强计测定磁化强度,用透射电镜测定磁微粒,大部分Co、Fe3O4微粒呈球型晶貌,平均粒径约为12.0nm。通过正交实验确定了制备钴微粒的最佳工艺条件为反应温度65℃、搅拌转速650r/min、反应时间7h;Co胶粒和Fe3O4胶粒质量比1∶3;月桂酸、月桂酸钠、中间体、硅油4者之间的质量配比为1∶0.7∶10.2∶32。研究表明用适量的Co微粒取代Fe3O4磁流体中的一部分Fe3O4微粒,可以使磁流体的饱和磁化强度提高12.18%。

前列腺癌EpCAM特异性分子探针的构建及其在体MR成像研究

目的:利用金磁纳米微粒偶联核酸适配体构建前列腺癌EpCAM特异性分子探针Ep1-GoldMag,探讨其对EpCAM阳性前列腺癌的亲和性及其在体MR成像能力。方法:将金磁纳米微粒偶联前列腺癌EpCAM核酸适配体制备分子探针Ep1-GoldMag。采用免疫荧光实验检测Ep1-GoldMag靶向EpCAM阳性前列腺癌组织细胞的能力;构建前列腺癌EpCAM荷瘤裸鼠模型,采用免疫组化检测裸鼠肿瘤及其重要脏器组织的EpCAM表达情况。将Ep1-GoldMag注入裸鼠体内,在注射后不同时间点行MRI扫描,比较注射前后各时间点的肿瘤T_(2)WI信号强度,探讨分子探针在体MR成像的可行性。结果:成功制备Ep1-GoldMag,并证实其能特异性识别EpCAM阳性前列腺癌组织细胞。对裸鼠注射Ep1-GoldMag前后行MRI扫描,结果显示注入1 h后,肿瘤T_(2)WI信号明显减低,6 h后T_(2)WI信号持续减低,12 h后T_(2)WI信号略升高,但与注射前相比仍呈低信号,而对照组注射前后T_(2)WI信号强度未见减低,实验组与对照组组间以及实验组内部注射前后各时间点的信号差异均有统计学意义(P<0.05)。结论:本研究制备的分子探针Ep1-GoldMag具有良好的EpCAM前列腺癌组织细胞特异性,并能在MR上特异性成像。

基于复合纳米微粒修饰电极的氯霉素快速检测用磁场可控一次性安培免疫传感器研究

在丝网印刷碳电极(SPCE)表面涂敷一层碳纳米管(CNT)/二茂铁(Fc)/Nafion膜,进而通过外磁场作用将包被了氯霉素-牛血清蛋白(CAP-BSA)的纳米金磁微粒[Fe3O4(核)/Au(壳),简称GMP]吸附到其表面,构建了可用于CAP检测的磁场可控一次性安培免疫传感器.采用扫描电镜(SEM)、X射线荧光光谱(XRFS)表征了免疫传感器的制备过程,采用循环伏安法(CV)和示差脉冲伏安法(DPV)研究了免疫传感器的电化学性质,结合竞争性免疫分析法测定了CAP浓度.免疫传感器在含有100ng·mL-1anti-CAP的25μLpH=6.0磷酸盐缓冲溶液(PBS)中加入不同浓度的CAP,并在25℃下温育6min,DPV还原峰电流上升百分比(CI%)与CAP浓度在0.2～80.0ng·mL―1范围内呈线性关系,检测限为0.11ng·mL―1.用于牛奶样品中CAP检测并和标准HPLC方法对照,结果一致,回收率在88%～104%之间.该免疫传感器灵敏快速、外磁场可控、样品用量小、可抛弃,有望用于食品中痕量CAP快速检测.

兔VX_2肝癌模型纳米磁微粒栓塞热疗初步研究

目的：观察磁性微粒栓塞热疗对 VX2兔肝癌的疗效。方法40只大白兔制成 VX2模型后等分成四组：对照组（A组）、碘油栓塞组（B组）、碘油＋磁性微粒组（C组）、磁热疗组（D组）。制备肿瘤模型后14 d，B、C、D组经股动脉逆行插管行肝动脉造影及栓塞。栓塞后第2天，B组3只和D组全部动物于振荡磁场（alternating magnetic field，AMF）下接受磁热疗，实时测定动物肿瘤中心、肿瘤边缘及正常肝组织3个部位温度变化。治疗前后查血常规、肝肾功能。治疗后14 d处死全部动物，开腹观察肿瘤情况并行病理检查。结果治疗前四组肿瘤体积分别为（1.6±1.5）、（2.5±2.5）、（2.7±1.6）、（3.5±2.6）cm3，各组肿瘤大小差异无统计学意义（F＝1.247，P＝0.308）。AMF下，B组3个部位平均温度与磁热疗前相应部位温度比较差异无统计学意义（F 瘤心＝0.01， P 瘤心＝0.981；F 瘤缘＝0.618，P 瘤缘＝0.476；F 正常肝＝0.217，P 正常肝＝0.665）；D组3个部位热疗前温度分别为（35.4±1.7）、（35.9±1.8）、（36.1±1.4）℃，差异无统计学意义（F＝1.038，P＝0.413）；热疗开始后7～26 min D组肿瘤中心及边缘温度与B组相应部位及D组正常肝组织的温度差异有统计学意义（FB-D 瘤心＝5.431，PB-D 瘤心＝0.041；FB-D 瘤缘＝9.744，PB-D 瘤缘＝0.011；FD 组3个部位＝8.379， PD组3个部位＝0.002）；D组肿瘤边缘温度最高可达46℃。术后14 d，四组肿瘤体积分别为（31.4±20.6）、（26.7±18.2）、（28.7±9.1）、（25.8±13.9）cm3，各组之间差异无统计学意义（F＝0.218，P＝0.883），但D组肿瘤体积最小。血常规、肝肾功能于治疗后7d恢复正常水平。结论经肝动脉磁性微粒栓塞后磁热疗治疗VX2兔肝脏肿瘤是安全可行的，可进一步深入研究。

基于纳米磁微粒化学发光分析法的腐食酪螨过敏原特异性IgE抗体检测方法的建立

目的建立用于腐食酪螨过敏原特异性IgE抗体检测的纳米磁微粒化学发光法。方法依据化学发光常规操作步骤,设置条件建立腐食酪螨过敏原特异性IgE检测的化学发光反应体系和合适的免疫反应条件,并以美国Phadia方法为标准,评估所建立化学发光方法的检验性能。应用SPSS21.0软件对两种方法的阳性率x2进行检验,以Pha出a为标准,评价化学发光方法的检测性能。结果化学发光反应体系中,发光底物A液中鲁米诺浓度为0.4mg/ml、发光底物B液中过氧化氢脲浓度为0.2mg/ml,此发光反应体系对辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)的敏感性很髙,可检测到H RP的最小量为0.01mg/m l,在免疫反应中,加人底物A液和B液后室温避光反应5min检测,在5〜30 min内检测数值均有效,37 t:为最佳发光反应温度;选择0.35~H X H U/m l范围作为标准曲线;以Phadia方法为标准,本研究建立的化学发光法敏感度为80.95%、特异度为100%、漏诊率为19%,用于检査腐食酪螨有显著意义。结论本研究成功建立纳米磁微粒化学发光法检测腐食酪蜗过敏原特异性IgE抗体。

纳米磁微粒化学发光法在检测SLE相关自身抗体中的应用价值

目的探讨纳米磁微粒化学发光法(NM-CLIA)在检测系统性红斑狼疮(SLE)相关自身抗体中的应用价值。方法采用NM-CLIA和线性免疫印迹法(LIA)检测108例SLE患者自身抗体,比较两种方法在检测自身抗体的一致性。采用Spearman相关性分析抗体NM-CLIA定量结果与SLE疾病活动性指数(SLEDAI)评分的相关性。结果 NM-CLIA和LIA在检测抗nRNP抗体、抗核糖体蛋白P0抗体、抗Ro-52抗体、抗Ro-60抗体和抗SSB抗体结果一致性较好(Kappa≥0.75),抗Sm抗体和抗双链DNA抗体结果一致性一般(0.40≤Kappa<0.75),抗核小体抗体和抗组蛋白抗体结果一致性较差(Kappa<0.40)。抗双链DNA抗体、抗核小体抗体、抗组蛋白抗体、抗Sm抗体与SLEDAI评分呈正相关(r=0.334、0.362、0.323、0.201,P<0.05)。结论 NM-CLIA可用于检测SLE相关自身抗体,定量结果能够反映SLE疾病活动度。

ATP生物发光技术在微生物检测中的应用

ATP(三磷酸腺苷)生物发光法作为一种不断完善成熟的微生物快速检测方法,具有简便、快速、高灵敏度等优点。对该方法的历史发展、检测原理、目标物提取方法、应用领域和最新研究成果等做重点介绍,并对ATP生物发光法的应用现状和发展方向进行总结和展望。