青黄散治疗骨髓增生异常综合征DNA磷硫酰化探析

目的:研究硫化砷制剂青黄散对骨髓增生异常综合征(Myelodysplastic Syndromes,MDS)患者DNA双链结构的影响,硫元素是否可加入DNA骨架,是否有DNA结构的硫酰化修饰。方法:以持续服用青黄散6个月以上并有血液学改善的MDS患者骨髓DNA样本10例,以琼脂糖包埋,应用脉冲场凝胶电泳(PFGE)检测骨髓细胞DNA降解表型。利用BIO-RAD CHEF-DRⅢSystem脉冲电泳进行分析。结果:经过硫修饰后DNA构象发生变化,这种硫修饰结构对电泳过程阳极积累的Tris过酸衍生物敏感而遭到位点特异性攻击,引发DNA的双链切割反应出现DNA降解现象。电泳后标本DNA结构完好,在Tris缓冲液下未出现DNA降解现象。结论:青黄散治疗有效的患者骨髓细胞DNA骨架中没有磷硫酰化修饰现象,说明青黄散疗效机制不通过硫修饰系统。

DNA骨架磷硫酰化修饰的研究进展

DNA骨架磷硫酰化修饰是指在天然DNA骨架上发现的P—O键被P—S键替换的化学修饰,属于首例生理修饰,具有磷硫修饰的DNA在Tris缓冲体系中电泳时具有DNA降解表型.研究发现DNA骨架磷硫修饰属于复制后修饰,具有如下三个特征:Rp型立体修饰,序列专一性、分布广泛性.这种修饰由五个基因组成的dnd基因簇(dndA-E)编码的蛋白控制,但这些蛋白具体的作用机制目前还不清楚.为了将来更好地研究DNA磷硫修饰机制,本文综述了DNA磷硫酰化修饰的发现历程,特点,参与DNA磷硫修饰的蛋白结构研究进展,以及磷硫修饰的DNA作为抗氧化剂研究进展.同时,对DNA磷硫修饰机制、生理功能等研究目前所面临的困难,如硫原子如何渗入DNA骨架,参与DNA磷硫修饰的五个蛋白是如何协调作用完成DNA磷硫修饰的机理等难题进行了简单概括,以为相关研究提出一些可能的方向.

假单胞菌Pseudomonas fluorescens Pf0-1中转录调控因子SpfB负调控DNA磷硫酰化修饰（英文）

【目的】DNA磷硫酰化修饰是DNA骨架上非桥接的氧原子以序列选择性和R-构型被硫取代的一种新型DNA修饰。目前,磷硫酰化修饰在多种细菌、古生菌以及人类致病菌中多有发现,但其分子调控机制尚不清楚。为了全面解析磷硫酰化修饰的调控机制,本文选择荧光假单胞菌Pf0-1为研究对象,开展了其DNA磷硫酰化修饰的调控机制研究。【方法】首先,构建了spfB基因缺失和回补菌株,使用碘能特异性断裂磷硫酰化修饰DNA的方法,研究了该基因缺失对修饰表型的影响。利用cDNA在相邻同方向的基因间隔区进行PCR,确定了磷硫酰化修饰基因簇spf BCDE内的共转录单元。通过荧光定量RT-PCR,分析了spfB基因缺失突变株中磷硫酰化修饰基因的转录量。利用异源表达并纯化得到的重组蛋白SpfB进行了体外功能研究。通过EMSA实验,验证了SpfB蛋白具有与spfB启动子序列结合活性。通过DNase I footprinting实验,精确定位了Spf B蛋白与DNA结合序列。【结果】spf B基因的缺失加剧了磷硫酰化修饰DNA断裂所致电泳条带弥散的表型,spf B基因的回补能够恢复该表型,证明spf B基因负调控磷硫酰化修饰。鉴定了spf基因簇中只含有1个共转录单元,且该共转录单元在?spfB突变株中转录水平明显上升。通过EMSA和DNase I footprint实验,检测了SpfB蛋白与磷硫酰化修饰基因spf BCDE的启动子区域5′-TGTTTGT-3′相结合。【结论】SpfB作为转录调控因子负调控磷硫酰化修饰基因spf BCDE的表达,为解析磷硫酰化修饰的调控机制和全面理解基因组上的部分修饰特征奠定了基础。

基因组磷硫酰化修饰的研究进展及展望

DNA磷硫酰化修饰是DNA骨架上的第一例生理修饰。该修饰由dnd ABCDE编码的5个蛋白协同作用,以硫原子取代DNA磷酸二酯键上一个非桥接的氧原子。研究发现,DNA磷硫酰化修饰广泛存在于各种微生物中,在不同细菌中存在序列特异性,且具有R_P空间构象专一性。近年来,对DNA磷硫酰化修饰的研究取得了一系列的成果。为了对DNA磷硫酰化修饰有一个系统全面的了解,本文将就这一特殊生理修饰的发现过程,研究进展,未来所面临的机遇及挑战作一个简要的概述。

灭癌素链霉菌中磷硫酰化修饰DNA结合结构域的功能分析

【目的】DNA磷硫酰化(phosphorothioation,PT)是由硫原子取代DNA骨架磷原子上的非桥联氧原子形成的一种新型DNA修饰。PT修饰除参与组成限制修饰系统外,其更为广泛的生物学功能仍有待揭示。PT修饰现有的检测方法操作复杂、成本高、耗时长,而具有操作简便、成本低、耗时短等特点的酶联免疫检测(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)成为新PT检测方法开发的优选。灭癌素链霉菌(Streptomyces gancidicus)中具有天蓝色链霉菌中PT修饰依赖的IV型限制酶(ScoMcrA)的同源酶,暗示其同样含有特异性结合PT修饰DNA的硫结合结构域(sulfur binding domain,SBD)。本文对灭癌素链霉菌中的SBD(简称为Sg-SBD)与PT修饰DNA的亲和力进行定性检测与定量表征,评估其用于PT修饰ELISA方法开发的潜力。【方法】对ScoMcrA-SBD和Sg-SBD的氨基酸序列进行比对分析,利用ScoMcrA-SBD为模板进行同源建模。在大肠杆菌中异源表达Sg-SBD,利用纯化的Sg-SBD进行凝胶迁移(electrophoresis mobility shift assays,EMSA)检测。利用生物膜层干涉(biolayer interferometry,BLI)技术进行Sg-SBD结合PT修饰DNA的定量表征。【结果】生物信息学分析揭示了Sg-SBD含有结合硫原子的保守的氨基酸残基,同时表明Sg-SBD具有与ScoMcrA-SBD相似的结构。EMSA实验发现Sg-SBD可以结合PT修饰DNA形成明显的迁移带,初步证实Sg-SBD结合PT修饰DNA的活性。BLI数据显示,Sg-SBD具有比ScoMcrA-SBD更强的PT修饰DNA结合能力,其与PT修饰DNA的亲和力常数在nmol/L级别,并且Sg-SBD不结合非PT修饰DNA。【结论】Sg-SBD结合PT修饰DNA活性接近抗原-抗体的反应水平,可用于PT修饰DNAELISA快速检测方法的开发。

独特的硫化修饰DNA抗逆优势的发掘和应用研究进展报告

在细菌的DNA上进行磷硫酰化修饰(硫修饰),而硫修饰DNA在电泳过程中发生降解表型(DNA degradation,Dnd)。负责这种磷硫酰化修饰功能的蛋白由5个连锁并存在于一个基因组岛上的5个基因dnd A-E编码,其中4个基因dnd A和dnd C-E是磷硫酰化修饰所必需的基因。而对于生理学意义直到最近,才在天蓝色链霉菌中发现了特异地限制磷硫酰化DNA的基因,在沙门氏菌中发现了磷硫酰化修饰限制系统。到目前为止磷硫酰化修饰DNA电泳过程中降解机制不明,且其生理学意义知之甚少。用化学合成的模拟底物磷硫酰化修饰的二核苷d GSA和PAA-TAE激活液反应,作为研究磷硫酰化DNA电泳过程中降解机制的模拟反应,鉴定到6个产物。最终提出磷硫酰化DNA在电泳过程中发生的化学反应即降解机制,磷硫酰化DNA的最终命运有两种可能性,一种是磷硫酰化DNA可以在PAA等氧化剂的作用直接氧化到正常的DNA,或者先被氧化到氢膦酸酯然后再被氧化到正常的DNA而不会引起磷硫酰化DNA断裂降解;另一种是磷硫酰化DNA被PAA氧化到氢膦酸酯的DNA,然后被水解而表现为磷硫酰化DNA电泳过程中的降解。自然界的沙门氏菌含有磷硫酰化修饰DNA,能够作为抗氧化剂抵抗一定的氧化压力。当将编码沙门氏菌的整个dpt基因簇质粒转化到大肠杆菌DH10B中,赋予新宿主菌以磷硫酰化修饰DNA的特性,增加了宿主菌对抗过氧化氢的能力。证明磷硫酰化DNA可以给细菌带来抗氧化压力的能力,也可以解释为什么编码磷硫酰化修饰DNA的基因处于一个基因组岛上,使其能够在微生物间进行水平转移然后赋予新宿主以抵抗氧化压力的能力。综上所述,磷硫酰化DNA在电泳过程中降解主要是因为被过氧化物氧化生成氢膦酸酯化DNA,然后发生水解而断裂;磷硫酰化DNA能够作为抗氧化剂保护DNA免受氧化损伤,并消除一部分的氧化压力,从而提高宿主菌在氧化压力下的生存能力。该研究的实施为阐述磷硫酰DNA的生物学意义和应用价值提供坚实的理论数据。具有推动磷硫酰DNA的一系列研究处于国际前沿。

阿维链霉菌BAC文库的构建及分析

为进一步阐明阿维菌素的生物合成路径和调控途径,提高阿维菌素的产量,采用BamHⅠ限制性内切酶酶解阿维链霉菌基因组DNA的方法,构建了阿维链霉菌的细菌人工染色体(BAC)文库。该文库共包含2 304个克隆,平均插入片段为101kb,空载率约9%,覆盖了该菌基因组的25.9倍。该文库的成功构建可以为其他微生物尤其是基因组具有磷硫酰化修饰的微生物的文库构建提供参考。

细菌先天免疫—DNA限制系统的研究进展

为抵御入侵的外源DNA,细菌进化出先天免疫机制和适应性免疫机制,前者主要由DNA限制修饰系统介导,后者由CRISPR系统介导。通常,细菌DNA限制修饰系统(Ⅰ~Ⅲ型)识别和降解未经修饰的DNA,同时通过甲基化修饰的方式保护其自身DNA免受降解。细菌中还存在一类Ⅳ型限制修饰系统,它仅由限制性核酸酶组成,可识别和降解外源经甲基化修饰的DNA。近年来,人们在细菌中发现一种新的DNA修饰模式——磷硫酰化,并表明Ⅳ型限制修饰系统可识别和降解经磷硫酰化修饰的DNA。在简要介绍细菌限制修饰系统的基础上,本文将重点阐述Ⅳ型限制修饰系统的特点和作用机制,结合笔者自身的研究提出开展Ⅳ型限制修饰系统研究的建议,为今后探索细菌先天免疫机制提供参考。

沙门氏菌硫修饰基因dptC的克隆表达与分离纯化

【目的】细菌DNA磷硫酰化修饰是指DNA骨架非磷氧桥上的一个氧被硫取代,该修饰增加了机体的抗氧化作用,其发生受被称为dnd的基因簇控制。沙门氏菌(Salmonella entericaserovar Cerro 87)是具有磷硫酰化修饰现象的细菌之一,其dnd基因簇被命名为dptBCDE。本研究旨在克隆其中的dptC基因,优化dptC表达条件,为进一步研究DptC在DNA磷硫酰化修饰过程中的酶学功能奠定基础。【方法】以沙门氏菌总DNA为模板,设计特异引物、PCR扩增获得dptC基因片段,连接于表达载体pGEX-6P-1的SmaI和XhoI位点之间,构建融合表达载体pJTU3622;将pJTU3622转化大肠杆菌(Escherichia coliDH10B),经氨苄霉素抗性初选及序列测定,获得阳性克隆;提取阳性中pJTU3622再转化大肠杆菌表达宿主[E.coli BL21(DE3)pLysS],获得工程菌株Anxh103;优化表达条件,诱导表达dptC基因;采用GST-Trap柱和kata FPLC纯化系统分离纯化DptC蛋白。【结果】获得沙门氏菌dptC基因表达载体pJTU3622和工程菌株Anxh103;确定dptC最佳诱导表达条件为:诱导温度18℃,诱导时间8-18 h,IPTG诱导浓度0.6 mmol/L,LB培养基中添加50μmol/L Fe2+。【结论】成功克隆了沙门氏菌dptC基因,实现了沙门氏菌dptC基因的高通量表达;表达载体中引入TEV酶切位点,使得很容易切除GST标签,为进一步研究DptC的酶学功能奠定了基础;沙门氏菌DptC发酵体系中添加50μmol/L Fe2+可以提高DptC产量,纯化的DptC显示浅棕色,推测与变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)中的同源蛋白蛋白DndC一样,也是一种含4Fe-4S的铁硫蛋白。

Ⅳ型限制酶ScoMcrA中SRA结构域介导的二聚体化对硫结合结构域功能的影响机制

【背景】部分细菌的DNA骨架会发生磷硫酰化修饰,硫结合结构域(Sulfur Binding Domain,SBD)可以特异性识别这种生理修饰。与绝大多数SBD-HNH双结构域核酸酶不同,ScoMcrA的SBD和HNH结构域中间插入了一个特异性识别5-甲基胞嘧啶(5m C)修饰DNA的SET and RING-Associated(SRA)结构域。晶体结构显示,单独的SBD是单体,而SBD-SRA是双体。【目的】探究ScoMcrA中SRA结构域的存在对SBD识别硫修饰DNA的影响及影响方式。【方法】凝胶迁移实验(Electrophoresis Mobility Shift Assay,EMSA)比较SBD、SBD-SRA对硫修饰DNA结合力的差异;对参与SBD-SRA二聚体化的关键氨基酸残基突变,并检测点突变对SBD-SRA蛋白二聚体化及结合硫修饰DNA的影响。【结果】相较于SBD结构域,SBD-SRA双结构域对磷硫酰化修饰DNA的结合能力明显增强。对SBD-SRA双体互作界面进行单点突变基本不影响其对硫修饰DNA的结合,当二聚体化界面连续的L_(261)LGET_(265)突变成A_(261)AAAA_(265)时,突变体对硫修饰DNA的结合力下降到与SBD相似的水平。【结论】根据EMSA实验结果可以初步判断,SRA结构域介导的SBD-SRA双体化能增强SBD对硫修饰DNA的结合力;L_(261)LGET_(265)是SRA结构域上影响SBD对硫修饰DNA结合力的关键氨基酸位点。

沙门氏菌中dnd基因簇的缺失与异源表达

沙门氏菌Salmonella enterica serovar Cerro87是一株从鸡场分离到的菌株,其DNA骨架上的磷硫酰化导致了在高压脉冲电泳过程中DNA降解(DNA degradation,Dnd表型)。本研究采用SacB所介导的负筛选系统,在该菌株中成功缺失了dnd基因簇,构建了突变株XTG103,该突变株不再具有Dnd表型。通过异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导启动子PlacZ的转录可以调控DNA磷硫酰化修饰的dnd基因簇的异源表达。