酸性鞘磷脂水解酶和MAPK信号通路在UVA诱导细胞凋亡中的作用

为了探讨酸性鞘磷脂水解酶 (ASM)和MAPK信号通路在UVA诱导的细胞凋亡中的作用 ,用DNA梯形条带 (DNAladder)和荧光显微镜鉴定细胞凋亡 ,Western印迹分析MAPK信号通路的激活情况 .结果显示 :①经UVA照射 ,正常的淋巴母细胞JY出现严重的细胞凋亡 ,而ASM遗传性缺陷的淋巴母细胞MS1 4 1 8出现轻微凋亡 ;给予ASM特异性抑制剂NB6 ,UVA诱导的JY细胞凋亡明显减轻 ,表明UVA诱导的细胞凋亡依赖于ASM .②UVA照射后 ,磷酸化ERK含量在MS1 4 1 8细胞中明显升高 ,在JY细胞中受到抑制 ;UVA照射前给予NB6 ,JY细胞中磷酸化ERK含量上升 ,表明ASM能抑制ERK的激活 .③UVA照射后 ,磷酸化JNK含量在MS1 4 1 8细胞中几乎没有变化 ,而在JY细胞中含量升高 ;UVA照射前给予NB6 ,JY细胞中磷酸化JNK含量没有明显升高 ,表明ASM激活JNK通路 .④NB6对UVA激活的p38MAPK信号通路没有影响 ,表明p38的激活与ASM关系不大 .研究表明 ,UVA诱导的细胞凋亡是通过激活ASM。

鸭肉肌内磷脂水解酶的提取及相关酶系的酶活测定

为了优化肌内磷脂水解酶的提取过程,建立各种鸭肉肌内磷脂水解酶活的测定方法。采用pH 7.5、8.0、8.5的0.1 mol.L-1的Tris-HCl缓冲液提取鸭肉肌内磷脂水解酶,用饱和度范围为0～90%的硫酸铵进行盐析,研究新鲜鸭肉及板鸭中酸性脂肪酶、中性脂肪酶、总磷脂酶、磷脂酶A2(PLA2)、磷脂酶C(PLC)和磷脂酶D(PLD)的活力。结果表明,肌内磷脂水解酶的最佳pH为8.0,最佳盐析条件为70%饱和度的硫酸铵溶液。透析过后的粗酶液中酸性脂肪酶活略大于中性脂肪酶,磷脂酶活次之。

紫苏磷脂酸磷酸水解酶基因(PfPAH1)的鉴定及功能分析

本文基于紫苏基因组数据筛选获得两条PfPAH1基因序列,分别命名为PfPAH1-1和PfPAH1-2。应用生物信息学工具分析PfPAH1s蛋白理化性质、功能结构域及系统进化。定量PCR(qRT-PCR)检测PfPAH1s在紫苏根、茎、叶、花及不同发育时期种子的表达谱。进一步克隆到高表达的PfPAH1-1基因的编码序列并进行烟草瞬时转化以鉴定其功能。结果表明,PfPAH1-1和PfPAH1-2基因的开放阅读框(ORF)长度均为2715 bp,编码904个氨基酸残基,含有Lipin_N、Lipin_mid和属于HAD_like超家族的LNS2三个保守结构域。系统进化分析显示紫苏PfPAH1-1蛋白与唇形科植物一串红的SsPAH1亲缘关系最近,其次是葡萄和芥菜。PfPAH1-2蛋白则与唇形科的芝麻SiPAH1亲缘关系最近,其次为油橄榄,紫苏和芝麻均为油料作物,推测PfPAH1-2和SiPAH1可能具有相似功能。qRT-PCR分析表明PfPAH1-1和PfPAH1-2基因均在开花后40 d种子中表达量最高,预示着其可能参与油脂合成积累。烟草瞬时转化揭示过表达PfPAH1-1基因烟草叶片总脂肪酸及中性脂含量均高于野生型烟草,然而磷脂含量降低。

人磷脂磷酸水解酶3基因真核表达载体的构建及其对卵巢癌细胞生长的抑制作用

目的:构建人磷脂磷酸水解酶3(hLPP3)基因的真核表达载体pLenExpress-hLPP3并转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞,初步观察重组表达载体对卵巢癌细胞的转染效率、目的基因表达情况及对卵巢癌细胞生长的影响。方法:采用RT-PCR法从正常胎盘组织中提取hLPP3基因,先克隆入克隆载体pGEM-T easy质粒得到pGEM-T-hLPP3,再用BamHⅠ和XhoⅠ进行双酶切,切下的hLPP3基因亚克隆入真核表达载体pLenExpress,得到pLenEx-press-hLPP3重组质粒,采用脂质体转染法转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞。实验分为3组:A组为实验组(转染表达hLPP3基因重组质粒)、B组为空质粒对照(转染空表达质粒)、C组为无转染对照。荧光显微镜观察细胞转染效率,实时荧光定量PCR法检测hLPP3 mRNA的表达,化学法测定转染前后细胞上清液中溶血磷脂酸(LPA)含量的变化,流式细胞仪检测细胞周期及凋亡情况。结果:重组表达质粒经限制性酶切鉴定得到与hLPP3基因长度一致(936bp)的酶切产物,测序分析证实,目的基因序列与GenBank上登录的hLPP3基因(BC009196)序列完全一致。荧光显微镜下见A、B2组SKOV3细胞内有大量绿色荧光信号,转染率分别为67%和69%,C组细胞中无荧光信号。实时荧光定量PCR测定显示A组细胞中hLPP3 mRNA的相对表达量较B、C组明显增加(A、B、C组分别为0.5109±0.0584、0.1499±0.0255、0.1433±0.0181,P<0.05)。A组卵巢癌细胞上清液中的LPA含量较B、C组明显下降[A、B、C组分别为(2.37±0.76)μmol/L、(6.71±2.03)μmol/L、(6.84±1.49)μmol/L,P<0.05];流式细胞仪检测显示A组卵巢癌细胞凋亡率明显增加[A、B、C组分别为(30.50±2.12)%、(1.26±0.43)%、(0.10±0.03)%,P<0.05],细胞周期无明显变化。结论:成功构建了表达目的基因hLPP3的重组真核表达载体pLenEx-press-hLPP3,并能高效转染卵巢癌细胞系SKOV3细胞,使细胞中hLPP3基因表达水平明显升高。增强hLPP3基因表达可以降低细胞外LPA水平,诱导细胞凋亡,抑制卵巢癌细胞的生长。

磷脂磷酸水解酶家族与卵巢癌

溶血磷脂酸(LPA)与卵巢肿瘤的发生、发展、浸润、转移等密切相关。磷脂磷酸水解酶(LPP)可以通过多种途径限制溶血磷脂酸信号系统,终止受体介导的溶血磷脂酸及相关复合物所引起的传递功能。磷脂磷酸水解酶通过影响溶血磷脂酸的代谢,或干扰溶血磷脂酸信号传导系统,显示出高度的降低胞外溶血磷脂酸的倾向性,有望成为治疗卵巢癌的新靶点。

野艾蒿中4种黄酮类化合物对HepG2细胞AMPK和LPIN1表达的影响

目的:研究野艾蒿(Artemisia lavandulaefolia DC.)中木犀草素、柚皮素、槲皮素、芹菜素4种黄酮类单体化合物对HepG2细胞的腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)和磷脂酸磷酸水解酶1(LPIN1)表达的影响,从分子水平探明其降血脂的有效成分。方法:以HepG2细胞为研究对象用细胞毒性实验(MTT法)观察野艾蒿中4种单体黄酮类化合物在不同用药时间和浓度时对HepG2细胞增殖的影响,并从中筛选出合适的用药浓度和作用时间。将实验分为对照组和药物组,根据筛选出的用药时间和浓度对培养细胞进行药物干预,分别抽提对照组和实验组细胞总RNA与总蛋白,实时荧光定量PCR检测LPIN1、AMPKα1和AMPKα2 mRNA表达情况,蛋白质印迹法(Western blot法)检测LPIN1、AMPKα1、AMPKα2和p-AMPK蛋白表达情况。结果:(1)4种黄酮类单体化合物均可不同程度抑制HepG2细胞的增殖,并在用药质量浓度0.01mg·mL^(-1),作用时间24h(药物对细胞的抑制率在15%~25%)为最适合作用条件。(2)实时荧光定量PCR检测结果显示,药物组AMPKα1mRNA表达与对照组比较无显著差异(P>0.05);药物组AMPKα2 mRNA表达与对照组比较,柚皮素、槲皮素有统计学意义(P<0.05),且表达水平升高;LPIN1 mRNA表达中,药物组与对照组比较均有显著性差异(P<0.01),且表达量均显著降低。(3)Western blot结果显示,药物组AMPKα1蛋白表达与对照组比较,均无显著性差异(P>0.05);AMPKα2蛋白表达中,药物组均有显著性差异(P<0.05),且表达量升高;LPIN1蛋白表达中,药物组与对照组比较均有显著性差异(P<0.01),且表达量均降低;p-AMPK蛋白表达均有显著性差异(P<0.01),且表达水平升高,提示野艾蒿乙酸乙酯提取的黄酮类化合物可通过磷酸化使AMPK活化。结论:(1)野艾蒿乙酸乙酯提取的4种黄酮类单体化合物可不同程度抑制HepG2细胞的增殖。(2)4种黄酮类单体化合物对HepG2细胞AMPKα1基因和蛋白表达均无明显作用;柚皮素和槲皮素可提高HepG2细胞内AMPKα2基因表达水平;4种黄酮类单体化合物均使AMPKα2蛋白表达量升高。同时均可显著降低HepG2细胞内LPIN1基因和蛋白表达水平;4种黄酮类单体化合物均可增加p-AMPK蛋白表达,提示均可激活AMPK磷酸化,使其活化。

肝豆汤改良方对TX小鼠脑组织ASM、Cer及p38 MAPK mRNA和蛋白表达的影响

目的:探讨肝豆汤改良方(MGDD)对TX小鼠脑组织酸性鞘磷脂水解酶(ASM)、神经酰胺(Cer)及p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)m RNA和蛋白表达的影响。方法:将140只TX小鼠随机分成1、3、5月龄模型组,3、5月龄MGDD组及3、5月龄丁苯酞组,每组20只,同时选用相同月龄60只DL小鼠分别为1、3、5月龄正常对照组,每组20只,饲养环境及喂食食物相同,均从入组时开始给药,MGDD治疗组按24.5g·kg^(-1)·d^(-1)灌胃,丁苯酞组给以丁苯酞混悬液0.156g·kg^(-1)·d^(-1)灌胃,正常对照组及模型组灌胃100m L·kg^(-1)·d^(-1) 0.9%氯化钠溶液,1次/d,收集处理标本,采用RT-PCR、免疫组织化学法及Western blot技术检测脑组织内ASM、Cer及p38 MAPK m RNA及蛋白表达水平。结果:模型组小鼠脑组织ASM、Cer及p38 MAPK mRNA及蛋白表达程度伴随着月龄的增加,表达有增多趋势,MGDD治疗组较模型组可显著降低小鼠脑内ASM、Cer及p38 MAPK mRNA及蛋白表达水平(P<0.05,P<0.01),且随着疗程的延长,抑制更加显著。结论:MGDD可能通过下调小鼠脑组织神经酰胺信号通路中ASM、Cer、p38 MAPK mRNA及蛋白的表达水平,改善铜负荷引起的神经元损伤。