磷脂爬行酶1(英文)

磷脂爬行酶1(phospholipidscramblase1,PLSCR1)属于Ca2+结合的棕榈酰化II型膜蛋白,而非棕榈酰化的PLSCR1蛋白可定位于细胞核内,并与基因组DNA序列结合。最初的研究显示,PLSCR1参与细胞膜磷脂跨膜活动。随后的研究发现多种细胞因子如干扰素、表皮生长因子等和白血病细胞分化诱导剂如全反式维甲酸(all-transretinoicacid,ATRA)、佛波酯(phorbol12-myristate13-acetate,PMA)等也能够调节PLSCR1的表达。尤其重要的是,PLSCR1蛋白可与多种蛋白如c-Abl、EGFR、c-Src、PKCδ和onzin等相互作用,提示PLSCR1在细胞信号传递中的作用。越来越多的证据表明PLSCR1的确参与细胞生长、分化、凋亡过程,并可能与肿瘤尤其与白血病发病学存在关系。

重组人磷脂爬行酶1的原核表达及纯化

目的:建立重组人磷脂爬行酶1(hPLSCR1)原核表达及纯化工艺。方法:PCR扩增hPLSCR1编码基因并连接到原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达,Western印迹鉴定所表达蛋白;优化表达条件后,Ni2+柱亲和层析纯化重组蛋白。结果:构建了pET-28a-PLSCR1重组质粒,诱导表达后,经SDS-PAGE分析目的蛋白的表达量达32%,Ni2+金属螯合法纯化目的蛋白后纯度达到95%以上,Western印迹验证了融合蛋白的特异性。结论:建立了高效稳定的His-PLSCR1表达体系,获得大规模生产His-PLSCR1的分离纯化工艺,为进一步研究其蛋白功能奠定了基础。

干扰磷脂爬行酶1基因表达对结直肠癌细胞增殖和粘附的影响

目的探讨PLSCR1在结直肠癌细胞增殖和粘附过程中的作用。方法常规培养3株结直肠癌细胞,采用免疫细胞染色和免疫印迹法筛选PLSCR1高表达的细胞株。设计三条RNA干扰片段及一条阴性对照片段,稳定转染高表达PLSCR1的结直肠癌细胞株,采用实时荧光定量PCR和免疫印迹法验证干扰结果,筛选出对PLSCR1蛋白抑制率最高的干扰片段,通过MTT方法来评估转染后结直肠癌细胞增殖能力的变化,采用细胞粘附实验来评估转染后结直肠癌细胞粘附能力的变化。结果免疫细胞染色提示LoVo细胞株高表达PLSCR1,与免疫印迹法结果相一致;转染siRNA-390后,LoVo细胞株PLSCR1的mRNA抑制效果最为明显,抑制率为88.4%,免疫印迹法检测进一步验证siRNA-390片段抑制PLSCR1蛋白表达最为显著。MTT法、纤连蛋白,粘附和层连蛋白检测显示,siRNA-390干扰下调PLSCR1的表达后,细胞生长变缓,粘附能力下降。结论干扰PLSCR1能显著抑制肿瘤的增殖和粘附能力,提示PLSCR1可能在结直肠癌浸润和转移中具有一定作用。

磷脂爬行酶1对干扰素抑制乙型肝炎病毒(HBV)作用的影响

研究磷脂爬行酶1(Phospholipid scramblase 1,PLSCR1)对干扰素抑制HBV作用的影响。设计合成PLSCR1特异性小干扰RNA(siRNA),以完全随机序列的阴性小干扰(NCsiRNA)作为对照,转染HepG2细胞,于转染48h后分别检测PLSCR1mRNA和蛋白水平表达量的变化,筛选出对PLSCR1具有沉默作用的siRNA;将HepG2细胞分为正常对照组和干扰素处理组,将1.3倍乙型肝炎病毒(HBV)全基因真核细胞表达载体HBV1.3质粒分别与PLSCR1siRNA或NCsiRNA共同转染HepG2细胞或干扰素处理的HepG2细胞,转染48h后检测各组细胞中PLSCR1mRNA表达量及培养液上清中HBsAg表达水平。PLSCR1特异性小干扰RNA siRNA911转染后能够显著抑制HepG2细胞中PLSCR1基因在mRNA和蛋白水平的表达;与HepG2细胞对照组比较,干扰素处理组细胞转染HBV1.3质粒、NCsiRNA+HBV1.3质粒后,细胞培养液中HBsAg表达水平均显著降低(P<0.05);而PLSCR1siRNA与HBV1.3共转染IFN处理的HepG2细胞组与共转染HepG2细胞组相比较,细胞培养液中HBsAg的表达水平没有显著差异。提示抑制PLSCR1的siRNA可抑制干扰素的抗HBV活性,提示PLSCR1在干扰素抑制HBV复制中具有重要作用。

磷脂爬行酶1在肝细胞癌中的表达及临床意义

目的探讨磷脂爬行酶1(PLSCR1)在肝细胞癌中的表达及临床意义。方法采用免疫组化检测44例肝细胞癌组织、癌旁组织及10例正常肝组织中PLSCR1的表达,分析其与肝细胞癌临床病理特征的关系。结果肝细胞癌组织中PLSCR1阳性表达高于癌旁组织和正常肝组织(P<0.01),癌旁组织与正常肝组织比较差异无统计学意义(P>0.05)。PLSCR1的表达与肝细胞癌患者HBsAg和TNM分期密切相关(P<0.05),与患者性别、年龄、肿瘤大小、甲胎蛋白、分化程度及淋巴结转移无明显相关(P>0.05)。结论 PLSCR1在肝细胞癌组织中高表达,可能与肝细胞癌的发生、发展有关。

PLSCR1真核表达载体的构建及细胞内定位分析

分别构建带有myc标签和GFP荧光蛋白的磷脂爬行酶1(PLSCR1)真核表达载体,获得两个融合表达载体,并转入HEK293细胞观察表达情况及细胞内定位,为研究PLSCR1的定位与功能的关系奠定基础。以本实验室保存的Hela c DNA文库为模板,采用PCR技术扩增PLSCR1编码序列,将其分别插入p CMV-Myc-N和p EGFP-C1载体,Western blotting检测其在HEK293中的表达,采用激光共聚焦观察p EGFP-C1融合表达载体在HEK293细胞中定位。通过DNA序列分析,证实了成功构建了PLSCR1真核表达载体,并能在HEK293细胞中实现基因的过表达。成功构建PLSCR1真核表达载体,为进一步研究其功能奠定了基础。

PLSCR1在苦参碱逆转APL细胞维甲酸耐药中的意义

目的观察磷脂爬行酶1(phospholipid scramblase 1,PLSCR1)在苦参碱(matrine,MAT)诱导维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)耐药急性早幼粒细胞白血病(acute promyelocytic leukemia,APL)细胞分化的表达,并探讨其与环磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)/蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)途径的相关性。方法以ATRA敏感的APL细胞系NB4以及ATRA耐药株NB4-R1为研究对象。通过NBT还原实验以及流式细胞仪(CD11 b)检测0.1 mmol/L MAT联合1μmol/L ATRA对两细胞株分化标记的影响;采用Western blot、实时荧光定量PCR技术测定细胞PML/RARα、PLSCR1蛋白及基因表达;同时应用PKA拮抗剂H89联合作用,观察细胞分化抗原及上述蛋白/基因表达的变化。结果 MAT联用ATRA能明显提高NB4-R1细胞NBT及CD1 1 b阳性率,并显著下调PML/RARα融合蛋白/基因的表达(P<0.05,P<0.01)。单用ATRA能使NB4细胞PLSCR1在蛋白及mRNA水平表达均得到明显增强(P<0.01),而在NB4-R1细胞内同样表达上调,但仅蛋白水平差异有统计学意义(P<0.01)。在联用MAT后,两细胞株PLSCR1蛋白表达进一步上升(P<0.01),并且NB4-R1细胞mRNA表达水平差异有有统计学意义(P<0.05)。上述作用均能被10μmol/L H89逆转(P<0.05,P<0.01)。结论 MAT联合ATRA能显著诱导NB4-R1细胞获得再分化,同时抑制PML/RARα融合基因/蛋白的表达,这可能与其上调PLSCR1表达有关。