磷脂酰丝氨酸合成酶基因的克隆及在枯草芽孢杆菌中的表达

应用PCR技术从Escherichia coli K12 Sgal-(ExPASy P23830)中扩增到大小为1350bp编码磷脂酰丝氨酸合成酶的DNA片段,将其插入枯草芽孢杆菌诱导型表达载体pBES,获得重组质粒pBES-pss后转化Bacillus subtilis DB104。经蔗糖诱导后,该磷脂酰丝氨酸合成酶在Bacillus subtilis DB104(pBES-pss)中获得胞外分泌表达,SDS-PAGE分析发现目的蛋白分子量约为52kDa,酶联比色法检测酶活力为1.50U/ml,提高了磷脂酰丝氨酸合成酶的表达产量,为工业化发酵生产磷脂酰丝氨酸合成酶奠定了良好的基础。

磷脂酰丝氨酸合成酶基因pss的克隆与表达

磷脂酰丝氨酸合成酶能催化转酯反应,是定向合成特定磷脂类物质特别是磷脂酰丝氨酸的工具酶,但出发菌株产量低,很大程度上限制了酶法合成磷脂酰丝氨酸的工业化应用。利用表达载体pET-22b,实现了大肠杆菌磷脂酰丝氨酸合成酶基因在大肠杆菌BL21(DE3)中的同源高效表达。利用镍亲和柱对表达产物进行纯化,并用HPLC法对纯化后的重组酶的活力进行检测。结果表明,目的蛋白可在短时间内进行大量表达,蛋白含量是出发菌株的100倍,同时经6h的转酯反应转化率达到33%,重组磷脂酰丝氨酸合成酶活力达到69U/mg蛋白。

表达磷脂酰丝氨酸合成酶基因工程菌发酵条件的研究

研究表达磷脂酰丝氨酸合成酶基因工程菌的发酵条件。利用250mL三角瓶发酵,对携带磷脂酰丝氨酸合成酶基因重组质粒的工程菌进行诱导表达,研究培养基的pH值、装液量、转速、诱导时菌体浓度、诱导剂浓度、诱导时间和温度对磷脂酰丝氨酸合成酶酶活的影响。确定工程菌的最佳发酵条件为:培养基pH值为7.5,装液量为40mL,转速为200r/min,诱导时菌体浓度为A600≈0.4,诱导剂蔗糖的终浓度为60mmol/L,诱导时间为27h,诱导温度为37℃。在最佳发酵条件下,酶活可达2.56U/mL,是优化前的1.72倍,为中试放大提供了理论依据。

重组磷脂酰丝氨酸合成酶的分离纯化及酶学性质研究

利对重组枯草芽孢杆菌（pBES-pss）表达的磷脂酰丝氨酸合成酶进行分离纯化及酶学性质研究。pBES-pss发酵后的粗酶液经硫酸铵盐析、中空纤维膜除盐浓缩、SP—SepharoseHP离子交换层析和Sephadex G-75凝胶层析。基本获得电泳纯的重组磷脂酰丝氨酸合成酶，比活力可达13．62U／mg，分子量约为53kD。酶学性质研究表明，该酶催化卵磷脂水解反应的最适pH8．0，最适温度为35℃。稳定性研究表明：该酶在pH6．5～9．5区间和低于45℃温度下稳定。表面活性剂及金属离子对该酶水解活性的影响结果表明，SDS、Tween20、Tween80对该酶有抑制作用，Triton X-100对该酶有增强作用；Mg^2＋、Zn^2＋、K^＋对该酶有抑制作用，Ca^2＋、Mn^2＋和EDTA对该酶有增强作用。

磷脂酰丝氨酸合成酶发酵及反应条件的研究

研究重组磷脂酰丝氨酸合成酶表达条件及其用于酶法合成磷脂酰丝氨酸的反应条件。结果表明,在50 mL培养基中,菌体浓度为OD600=0.6时,用0.5 mmol/L的IPTG,在温度为20℃,转速为120 r/min的条件下,诱导12 h后,重组磷脂酰丝氨酸合成酶活力可达1.33 U/mL,是优化前的1.66倍。酶法转化磷脂酰丝氨酸的最适温度为38℃,最适pH为8.0,最适离子是12 mmol/L Mn2+,最适表面活性剂是1.0%Trition X-100。在最适条件下,磷脂酰丝氨酸转化率可达33.15%。

基因工程手段提高磷脂酰丝氨酸合成酶活性的研究

为了提高目的蛋白磷脂酰丝氨酸合成酶(PSS)的表达,使用rTaq酶从E coli K12总DNA中PCR扩增获得磷脂酰丝氨酸合成酶基因片段,将其重组于高效表达载体pET28b质粒,转入相应表达菌株进行表达,收集菌体超声破碎获得含PSS的粗酶液,使用两相反应体系进行生物转化,HPLC-ELSD手段进行酶活检测。结果显示,重组菌株中PSS的酶活力比对照有所提高,同时获得酶活力提高的突变基因pssE210G。将突变基因重组于更高效的表达载体pBAD-MCS,转入相应宿主菌株表达。结果显示E.coli TOP10(pBAD-MCS-pss)表达的酶活性明显优于E.coli BL21(pET28b-pss)中表达的酶活性。以上实验结果表明,将目的基因重组于高效表达质粒有助于提高酶活力;组合到不同的表达质粒,酶活提高程度不同;磷脂酰丝氨酸合成酶基因第73位氨基酸发生突变,对其酶结构和酶活力有直接的影响。

阿维链霉菌来源的磷脂酰丝氨酸合成酶基因的克隆及其在毕氏酵母中的异源表达

本文旨在构建阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)来源的磷脂酰丝氨酸合成酶基因(pss)的重组质粒,研究其在毕氏酵母中的异源分泌型表达。利用PCR技术克隆阿维链霉菌来源的pss基因,再通过电转化方法将重组质粒pOG-01转入毕氏酵母KM71中,构建重组工程菌KP1。实验结果表明,阿维链霉菌来源的磷酯酰丝氨酸合成酶基因在毕氏酵母KM71中成功表达,2 mL菌体上清催化50 mmol/L卵磷脂,转酯反应的转化率为58%,酶活为4.83 U/mL。

磷脂酰丝氨酸制备的研究进展

磷脂酰丝氨酸具有改善记忆和认知能力、防治老年痴呆症、抑郁症及缓解精神压力等作用,目前在国外被用作营养补充剂广泛应用于保健食品中。着重从提取法和酶转化法2个方面综述了磷脂酰丝氨酸的制备方法,同时通过对国内外磷脂酰丝氨酸消费现状的调查,对其在食品、药品、保健品方面的应用前景进行了展望。

PSS定点突变及酶活研究

磷脂酰丝氨酸可在磷脂酰丝氨酸合成酶(PSS)催化下由磷脂酰胆碱和L-丝氨酸生成。通过生物信息学手段对磷脂酰丝氨酸合成酶蛋白质结构进行解析和研究分析,获得2个可突变位点F139和P272,通过Overlap PCR法进行定点突变,测定突变序列,并进行酶活测定。结果显示,PSS位点F139突变为L139、M139,位点P272突变为A272,能提高酶活力,说明蛋白质结构解析结合氨基酸定点突变技术,可以改善重组酶的活力。

两种组成型启动子PermE*和PSau3A在变铅青链霉菌中的启动效果比较

红霉素抗性启动子PermE*和来源于链霉菌核基因组片段的PSau3A启动子均属于链霉菌组成型强启动子,分别将它们插入大肠杆菌-链霉菌穿梭质粒pNW-S1的SD序列和转录起始位点之间,构建成两个稳定的组成型表达质粒:pNW-S3和pNW-S4。以磷脂酰丝氨酸合成酶PSS基因为报道基因,以蛋白表达水平评价这两个启动子在变铅青链霉菌TK24中的表达效果。结果表明,在两株组成型表达重组菌中,PSS均得到了高效表达,具有在链霉菌系统中高效表达外源基因的功能,其中PermE*的启动效率略高于PSau3A。