GPC3抗原表位肽致敏树突状细胞对T淋巴细胞活化的影响

目的探讨磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)抗原表位肽致敏的树突状细胞(DC)对T淋巴细胞活化的影响。方法选用基因型人类白细胞抗原A2阳性的剖宫产妇的胎盘端脐带血50 m L,分离培养DC及T细胞,用人工合成的GPC3抗原表位肽(GPC3_(144-152)、GPC3_(298-306))、冻融Hep G2细胞抗原致敏DC (DC-GPC3_(144-152)组、DCGPC3_(298-306)组、DC-HepG2组、DC组),经致敏DC处理的T细胞随机分为DC-GPC3_(144-152)-T组、DC-GPC3_(298-306)-T组、DC-HepG2-T组、DC-T组,以未经活化的T细胞作对照(T细胞组)。用流式细胞术检测DC表型、T细胞分类及表面趋化因子的表达。结果 GPC3_(144-152)、GPC3_(298-306)抗原表位肽和冻融Hep G2细胞抗原三种致敏方式均能诱导DC呈典型成熟DC的形态,表面均高表达CD83、CD80和CD86抗原,且不同致敏方式之间CD8^+T、CD4^+T淋巴细胞比例差异无统计学意义(P均> 0. 05);与T细胞组比较,GPC3_(144-152)-T组和DC-GPC3_(298-306)-T组CD4+T细胞中Th1细胞比例高(P均<0. 05);与DC-T组比较,DC-GPC3_(144-152)-T组、DC-GPC3_(298-306)-T组、DC-HepG2-T组CCR6表达高(P均<0. 05)。结论 GPC3_(144-152)和GPC3_(298-306)表位抗原肽均能够有效致敏DC,并促进与DC共培养的T淋巴细胞活化。

GPC3特异性HLA-A11限制的T淋巴细胞表位肽免疫活性检测

目的设计合成人类白细胞抗原(HLA)-A11限制性T细胞识别的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)多肽,并检测其免疫原性和反应性。方法利用BIMAS和SYFPEITHI评分系统评价GPC3多肽与HLA-A11分子的结合能力,预测出相应的抗原谱,合成HLA-A1101限制性GPC3多肽库;流式细胞仪检测HCC患者HLA-A11分子的表达;多肽刺激外周血淋巴细胞,酶联免疫斑点试验(ELISPOT)检测T细胞对GPC3多肽的反应性。结果流式细胞仪检测32例HCC患者,7例HLA-A11分子表达阳性(21.9%);ELISPOT检测发现17例(53.1%)HCC患者的T细胞应答阳性,7例(21.9%)HLA-A11表型检测阳性的HCC患者,T细胞应答结果成强阳性。HLA-A11限制性GPC3多肽应答率符合人群中相应基因位点的自然表达率。结论 GPC3多肽设计合理,具有良好的免疫原性和反应性。

抗GPC3 C端抗体辅助杀伤肝癌细胞HepG2的活性检测及抗原表位鉴定

目的：检测制备的7株抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（GPC3）蛋白C端单克隆抗体是否具有辅助杀伤肝癌细胞的活性，并研究其识别的抗原表位。方法：用细胞增殖法检测制备的抗体是否具有抗体依赖细胞介导的细胞毒性（ADCC）活性；用生物信息软件分析GPC3蛋白C端（359～580残基）的结构及抗原特征，并据此将其分为4个截短片段，将克隆的各基因片段分别连接到原核表达载体pGEX-4T-1中，进行蛋白表达和纯化，用间接ELISA和Western印迹分析GPC3C端单克隆抗体的表位识别情况。结果与结论：制备的7株单克隆抗体对肝癌细胞HepG2均具有不同程度的辅助杀伤作用，其中5号单克隆抗体的辅助杀伤效果最好；表达并纯化了GPC3C端4个截短片段的重组蛋白；间接ELISA和Western印迹检测结果表明，7株抗体均特异性结合GPC3蛋白的473～525残基区段。

原发性肝癌高表达抗原GPC-3的HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞表位预测

目的预测原发性肝癌高表达抗原GPC-3的HLA-A2限制性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)表位。方法通过国家生物技术信息中心(NCBI)数据库获取GPC-3蛋白的氨基酸序列,利用超基序、量化基序法和NetCTL数据库预测分析GPC-3的HLA-A2限制性CTL表位。结果初步筛选出GPC-3肿瘤抗原的HLA-A2限制性CTL优势表位,分别为GPC-3 102～110,155～163,169～177,229～237,281～289,319～327,326～334,367～375,522～530,564～572。结论预测出GPC-3的HLA-A2限制性CTL表位为GPC-3阳性原发性肝癌免疫靶向治疗奠定了基础。

GPC-3 CTL表位表达载体构建

将重组的乙肝表面抗原(pcHBsAg)中多个CTL表位,用外源性的磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白(GPC3)CTL表位序列替换,构建单拷贝和多拷贝DNA疫苗,获得不同位点的单拷贝或可同时表达多个CTL表位肽的真核表达质粒。以pcHBsAg质粒为模板,应用重叠延伸PCR扩增出含三个不同位点磷酸酰肌醇蛋白聚糖-3蛋白(GPC3)CTL表位EYILSLEEL(EYI)的HBsAg基因片段EYI1,及替换pcHBsAg中不同CTL表位的HBsAg基因片段EYI2、EYI3;分别将EYI1、EYI2、EYI3基因片段插入pBSSK+载体中,构建出含3拷贝EYI的pBSSK/EYI1、pBSSK/EYI2、pBSSK/EYI3载体。在此基础上,利用DNA重组技术将其分别定向插入真核表达载体pcDNA3.1+,构建表达EYI表位肽的DNA疫苗。真核表达载体经PCR、酶切和测序鉴定,结果显示:成功构建了pcDNA-EYI1/HBsAg、pcDNA-EYI2/HBsAg、pcDNA-EYI3/HBsAg真核表达质粒,为进一步测定以GPC3基因为基础的HBsAg多肽候选疫苗提供理论、实验依据。

肝细胞癌标志物GPC3表位肽抗体制备及其特性测定

目的研制针对肝细胞癌标志物磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)的高特异抗体。方法用Biosun软件预测和分析GPC3的抗原表位肽,人工合成选定的表位肽,与载体蛋白KLH偶联后免疫新西兰大白兔制备抗血清。以抗原亲和层析法制取高纯抗GPC3抗体,对肝癌细胞株HepG2和胎盘组织进行Western blot印迹及对肝癌组织切片进行免疫组化染色,并用夹心ELISA对肝癌患者的血清进行了检测。结果选定并合成两条抗原表位肽(命名为GPC3-P1和GPC3-P2),取得高效价抗血清(分别为1:204 800和1:409 600)。两种抗GPC3抗体纯度均达到95%以上,在Western blot印迹能特异性地检测到GPC3;在免疫组化染色中均与肿瘤组织GPC3特异性结合,在正常组织中没有染色;夹心ELISA可以检测到肝癌患者血清中的GPC3。结论该两种抗GPC3不同表位的高特异抗体可用于研制相关肿瘤检测试剂盒。

血清Pep5、GP73及GPC-3检测在原发性肝细胞癌诊断中的价值

目的探讨血清多肽抗原(Pep5)、高尔基体蛋白73(GP73)和磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC-3)检测在原发性肝细胞癌(PHC)诊断中的价值。方法选取PHC患者30例(PHC组),另选择同期住院的良性肝病患者40例(良性肝病组)和查体健康者30例(正常对照组)。采用ELISA法检测三组血清Pep5、GP73和GPC-3水平。结果PHC组血清Pep5、GP73、GPC-3水平均高于正常对照组(P均<0.05),血清GP73和GPC-3水平高于良性肝病组(P<0.01)。PHC组三项血清标志物的阳性检出率均显著高于正常对照组和良性肝病组(P均<0.01);良性肝病组GP73和GPC-3阳性检出率显著高于正常对照组(P均<0.05)。三项指标的诊断灵敏度以GPC-3最高,排序为GPC-3>Pep5>GP73;而诊断特异度在三项指标中Pep5排在首位,排序为Pep5>GP73>GPC-3;准确性以Pep5最佳,其排序为Pep5>GP73>GPC-3。结论血清Pep5、GP73、GPC-3检测各有优缺点,三项标志物联合检测有助于PHC的早期诊断。

GPC-3蛋白N端可溶性片段多克隆抗体的制备及鉴定

目的:通过原核表达并纯化GPC3-N端蛋白及根据分析GPC3-N端蛋白可能的抗原表位合成多肽,免疫家兔获得抗-GPC3多克隆抗体,为深入研究GPC3基因的功能及其临床应用奠定基础。方法:将GPC3-N端基因片段亚克隆至pQE30原核表达载体,表达带有6-His的GPC3的融合蛋白质,纯化蛋白后免疫家兔;同时应用Goldkey软件预测分析GPC3蛋白N端可能的抗原表位,根据分析结果合成多肽命名为lw1,免疫家兔,获得抗-GPC3多克隆抗体,并鉴定其特性。结果:成功表达出GPC3-N端蛋白,用纯化后的蛋白及合成的肽免疫家兔,获得特异性兔抗多克隆抗体,通过间接ELISA,Western blot和免疫荧光技术证实该多抗能识别原核表达的外源性及HepG2细胞内源性GPC3蛋白。结论:通过两种方法获得的蛋白免疫家兔都能获得能特异识别GPC3蛋白的多克隆抗体,将为GPC3基因的功能研究提供研究工具,并为临床原发性肝癌的血清学早期诊断提供新的标记物。