替米沙坦通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路抑制硬化性胃癌细胞增殖

目的研究替米沙坦对硬化性胃癌(SGC)细胞增殖的影响,并探讨其作用机制。方法常规培养胃癌细胞MKN1和SGC细胞HSC45。采用细胞计数盒8实验检测替米沙坦对MKN1和HSC45增殖能力的影响;流式细胞仪检测替米沙坦对HSC45凋亡和细胞周期的影响;蛋白质印迹法检测激活替米沙坦对HSC45自噬和磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路相关蛋白表达的影响;采用PI3K/AKT/mTOR信号通路激活剂SC79和替米沙坦共同处理HSC45,分别检测激活PI3K/AKT/mTOR信号通路后,替米沙坦对HSC45增殖、凋亡、自噬和细胞周期的影响。结果替米沙坦呈浓度和时间依赖性抑制MKN1和HSC45细胞增殖(均P<0.001),且对HSC45细胞增殖抑制效果更为显著(P<0.05)。替米沙坦组HSC45早期凋亡率、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达量、G_(0)/G_(1)期细胞周期比例均高于对照组[(26.2±2.6)%比(1.3±0.4)%、(1.02±0.09)比(0.29±0.04)、(53.4±3.4)%比(38.1±2.9)%],磷酸化PI3K、磷酸化AKT和磷酸化mTOR蛋白表达均低于对照组(均P<0.05)。替米沙坦组和替米沙坦+SC79组HSC45细胞增殖抑制率、细胞凋亡率、LC3Ⅱ/Ⅰ蛋白表达及G_(0)/G_(1)期细胞比例均高于对照组,但替米沙坦+SC79组均低于替米沙坦组(均P<0.05)。结论替米沙坦下调PI3K/AKT/mTOR信号通路,促进SGC细胞凋亡、自噬和周期阻滞,进而抑制SGC细胞增殖能力。

基于磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶信号通路,浅谈中医药治疗慢传输型便秘的研究进展

慢传输型便秘(Slow Transit Constipation,STC)是一种慢性功能性肠病,其主要特征为结肠传导动力不足,结肠传输速度缓慢,致肠内容物排出时间延长,淤积于肠道,不能顺畅排出体外。STC的病因及发病的机制复杂,目前尚无统一定论,大多数观点认为STC的病因及发病机制与Cajal间质细胞功能异常、水通道蛋白异常表达、肠神经功能病变、胃肠神经递质的异常分泌、肠道微生态紊乱及精神心理障碍等有关。近年来,细胞信号转导通路的异常改变,导致细胞信号转导通路下游的相关分子及蛋白的异常表达导致STC的发病,逐渐引起广大临床学者的关注。基于细胞信号转导通路,探讨STC的研究逐渐增多。大量研究表明,中医药治疗STC具有层次多、靶点丰富且通路广泛的优势,并且临床疗效显著。其中的机制也引起广大临床研究者的好奇。磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/内皮型一氧化氮合酶(Endothelial Nitric Oxide Synthase,eNOS)细胞信号转导通路是近年来中医药治疗STC研究的热点通路之一。故文章基于PI3K/Akt/eNOS细胞信号转导通路,探讨中医药治疗STC的研究进展,以期为厘清STC的病因及发病机制提供些许理论支撑,为中医药治疗STC提供现代理论支持,为后期开展更深层次的STC的研究作铺垫。

磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B和丝裂原活化蛋白激酶/细胞信号调节激酶1/2信号通路抑制剂对乳腺癌细胞缺氧诱导因子-2α表达的影响

目的探讨磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)和丝裂原活化蛋白激酶/细胞信号调节激酶1/2(MEK/ERK1/2)信号通路抑制剂对缺氧诱导的乳腺癌MCF-7细胞中缺氧诱导因子-2α(HIF-2α)表达的影响。方法乳腺癌MCF-7细胞常规培养24 h后,分为常氧组、缺氧组、缺氧+低剂量LY294002组、缺氧+高剂量LY294002组,缺氧+低剂量U0126组和缺氧+高剂量U0126组。常氧组细胞使用含生理盐水的RPMI 1640培养基,缺氧组细胞使用含100μmol·L-1氯化钴的RPMI 1640培养基,缺氧+低剂量LY294002组细胞使用含100μmol·L-1氯化钴和4μmol·L-1 LY294002的RPMI 1640培养基,缺氧+高剂量LY294002组细胞使用含100μmol·L-1氯化钴和40μmol·L-1 LY294002的RPMI 1640培养基,缺氧+低剂量U0126组细胞使用含100μmol·L-1氯化钴和2μmol·L-1 U0126的RPMI 1640培养基,缺氧+高剂量U0126组细胞应用含8μmol·L-1 U0126的RPMI 1640培养基,继续培养3 h。采用实时荧光定量聚合酶链式反应检测各组细胞HIF-2αmRNA的表达;采用Western blot法检测各组细胞HIF-2α蛋白、磷酸化Akt(p-Akt)和磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白的表达。结果缺氧组细胞中HIF-2αmRNA相对表达量及HIF-2α蛋白、p-Akt蛋白和p-ERK1/2蛋白相对表达量高于常氧组(P<0.05);缺氧+低剂量LY294002组、缺氧+高剂量LY294002组、缺氧+低剂量U0126组、缺氧+高剂量U0126组细胞中HIF-2αmRNA相对表达量及HIF-2α蛋白、p-Akt蛋白和p-ERK1/2蛋白相对表达量低于缺氧组(P<0.05)。缺氧+高剂量LY294002组细胞中HIF-2αmRNA相对表达量及HIF-2α蛋白、p-Akt蛋白和p-ERK1/2蛋白相对表达量低于缺氧+低剂量LY294002组(P<0.05);缺氧+高剂量U0126组细胞中HIF-2αmRNA相对表达量及HIF-2α蛋白、p-Akt蛋白和p-ERK1/2蛋白相对表达量低于缺氧+低剂量U0126组(P<0.05)。结论PI3K/Akt和MEK/ERK1/2信号通路可能是缺氧诱导HIF-2α表达的上游信号通路,在缺氧条件下对HIF-2α具有正向调节作用,在乳腺癌的发生、发展中发挥重要作用。

解毒祛瘀方通过抑制磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路逆转乳腺癌细胞他莫昔芬耐药的机制研究

目的探讨解毒祛瘀方通过抑制磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路对乳腺癌细胞他莫昔芬耐药的逆转作用及机制。方法采用低浓度逐步加量诱导法建立乳腺癌他莫昔芬耐药细胞株MCF-7C,并分为空白对照组、解毒祛瘀方(2.5 g/L)组、他莫昔芬(10μmol/L)组、他莫昔芬(10μmol/L)+解毒祛瘀方(2.5 g/L)组、胰岛素样生长因子1(IGF-1)(10μg/L)+他莫昔芬(10μmol/L)+解毒祛瘀方(2.5 g/L)组。采用噻唑蓝法验证MCF-7C细胞的耐药性、解毒祛瘀方的细胞毒性以及对MCF-7C细胞他莫昔芬耐药性的影响。利用流式细胞术检测细胞凋亡率。利用蛋白质印迹法检测各组MCF-7C细胞中PI3K/Akt/雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号通路相关蛋白的表达。结果 MCF-7C细胞对他莫昔芬的耐药指数为7.20;而经解毒祛瘀方(2.5 g/L)协同作用后,MCF-7C细胞对他莫昔芬的耐药指数为2.02。他莫昔芬+解毒祛瘀方组MCF-7C细胞凋亡率明显高于他莫昔芬组[(56.72±7.25)%比(13.24±0.76)%],同时p-PI3K[(0.37±0.06)比(0.68±0.07)]、p-Akt[(0.17±0.02)比(0.51±0.05)]、p-mTOR[(0.10±0.02)比(0.39±0.02)]蛋白表达量也明显低于他莫昔芬组(均P <0.05)。而加入PI2K/Akt通路激活剂IGF-1后,IGF-1+他莫昔芬+解毒祛瘀方组MCF-7C细胞增殖抑制率和凋亡率较他莫昔芬+解毒祛瘀方组均明显降低(均P <0.05)。结论解毒祛瘀方可逆转乳腺癌细胞他莫昔芬的耐药性,其作用机制可能与抑制PI3K/Akt/m TOR信号通路活化有关。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路与白血病干细胞耐药的研究进展

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinases,PI3Ks）信号参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。近年发现PI3Ks和其下游分子蛋白激酶B（protein kinase B,PKB或Akt）所组成的信号通路与肿瘤的发生、发展密切相关,调节肿瘤细胞的增殖、存活和凋亡。

长链非编码RNA MIR4435-2HG靶向微小RNA-1-3p调控信号通路磷脂酰肌醇激酶/蛋白激酶B对胰腺癌细胞增殖、侵袭和迁移的机制研究

目的探讨长链非编码RNA MIR4435-2HG(LncRNA MIR4435-2HG)通过调控微小RNA-1-3p(miR-1-3p)的表达对胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的影响及其可能作用机制。方法体外培养正常胰腺细胞系hTERT-HPNE与胰腺癌细胞系PANC-1、SW1990、PaTu8988、BxPC-3,将胰腺癌PaTu8988细胞按照随机数字表法分为si-MIR4435-2HG组(转染MIR4435-2HG siRNA)、si-con组(转染siRNA Control)、miR-1-3p组(转染miR-1-3p mimics)、miR-con组(转染miR-1-3p阴性对照)、si-MIR4435-2HG+an⁃ti-miR-1-3p组(共转染MIR4435-2HG siRNA与miR-1-3p抑制剂)、si-MIR4435-2HG+anti-miR-con组(共转染MIR4435-2HG siR⁃NA与miR-1-3p抑制剂的阴性对照),同时将未经任何处理的细胞作为NC组。采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRTPCR)检测细胞中MIR4435-2HG与miR-1-3p的表达;双荧光素酶报告基因检测MIR4435-2HG与miR-1-3p的相互作用。四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)分析敲低MIR4435-2HG及上调miR-1-3p表达对胰腺癌细胞增殖的影响;Transwell迁移及侵袭实验检测MIR4435-2HG及上调miR-1-3p表达对胰腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。蛋白质印迹法(Western blotting)检测细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、基质金属蛋白酶2(MMP2)、基质金属蛋白酶9(MMP9)及磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路相关蛋白的表达。结果MIR4435-2HG在胰腺癌细胞中的表达水平明显高于正常胰腺细胞;MIR4435-2HG可特异性结合miR-1-3p并调控其表达活性;敲低MIR4435-2HG与上调miR-1-3p表达后,可抑制胰腺癌PaTu8988细胞增殖,明显减弱细胞迁移及侵袭能力[其中NC组、miR-con组、si-MIR4435-2HG组增殖活性分别为48 h:(1.21±0.10)、(1.18±0.12)、(0.86±0.09),细胞迁移数量分别为(90.56±9.16)、(88.56±8.91)、(26.49±2.10),细胞侵袭数量分别为(160.79±16.12)、(155.09±15.49)、(69.23±7.10),均P<0.05],下调PaTu8988细胞中cyclin D1、MMP2、MMP9、p-Akt、PI3Kp110α、PI3Kp110β的表达;抑制miR-1-3p表达可促进胰腺癌PaTu8988细胞增殖、迁移及侵袭。结论敲低LncRNA MIR4435-2HG可通过靶向调控miR-1-3p表达并抑制PI3K/Akt信号通路活化而降低细胞增殖、迁移及侵袭相关蛋白表达,进而减弱胰腺癌细胞增殖、迁移及侵袭能力。

色瑞替尼对肺癌细胞H3122增殖及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路的影响

目的探讨色瑞替尼对肺癌细胞H3122增殖及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路的影响。方法将对数生长期H3122细胞随机分为空白组及低、中、高剂量色瑞替尼组,每组设5个复孔。低、中、高剂量色瑞替尼组分别加入色瑞替尼,使每孔终质量浓度分别为16.67、33.33、66.66 mg·L^-1,空白组加入等量的磷酸盐缓冲液。采用甲基噻唑基四唑法检测干预24、48、72 h后各组细胞增殖抑制率,流式细胞术检测干预72 h后各组细胞凋亡率,实时荧光定量聚合酶链式反应检测干预72 h后各组细胞中PI3K、Akt、Caspase-3 mRNA相对表达量,蛋白质免疫印迹法检测干预72 h后各组细胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Caspase-3蛋白表达。结果培养24、48、72 h后,低、中、高剂量色瑞替尼组细胞增殖抑制率均高于空白组(P<0.05),中、高剂量色瑞替尼组细胞增殖抑制率高于低剂量组(P<0.05),高剂量色瑞替尼组细胞增殖抑制率高于中剂量组(P<0.05);低、中、高剂量色瑞替尼组细胞增殖抑制率随时间延长均呈显著上升趋势(P<0.05)。培养72 h时,低、中、高剂量色瑞替尼组细胞凋亡率均高于空白组(P<0.05),中、高剂量色瑞替尼组细胞凋亡率高于低剂量组(P<0.05),高剂量色瑞替尼组细胞凋亡率高于中剂量组(P<0.05)。4组细胞中Caspase-3 mRNA相对表达量随色瑞替尼剂量的增加呈上升趋势,组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05);4组细胞中PI3K、Akt mRNA相对表达量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。4组细胞中Caspase-3蛋白相对表达量随色瑞替尼剂量增加呈上升趋势,p-PI3K/PI3K、pAkt/Akt随色瑞替尼剂量的增加呈下降趋势,组间两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论色瑞替尼可抑制肺癌细胞增殖,促使其凋亡,且呈一定的剂量依赖性,其作用机制可能与调控PI3K、Akt及其下游Caspase-3基因和蛋白表达有关。

磷脂酰肌醇3-激酶蛋白激酶B信号通路在胃癌及癌旁组织中的表达及与其病理特征的关系

目的分析磷脂酰肌醇3-激酶蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路在胃癌及癌旁组织中的表达及与其病理特征的关系。方法选取2018年2月至2019年4月商丘市第一人民医院收治的54例胃癌患者,检测磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(p-PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)表达水平,对比p-PI3K、p-Akt在胃癌及癌旁组织中的表达情况和不同病理特征胃癌组织中的阳性表达率。结果p-PI3K胃癌组织阳性表达率[81.48%(44/54)]高于癌旁组织[22.22%(12/54)](P<0.05)。p-Akt胃癌组织阳性表达率[75.93%(41/54)]高于癌旁组织[20.37%(11/54)](P<0.05)。低分化、有淋巴结转移的胃癌组织p-PI3K阳性表达率高于中高分化、无淋巴结转移的胃癌组织(均P<0.05);低分化、有淋巴结转移、TNM分期为Ⅲ~Ⅳ期的胃癌组织p-PI3K阳性表达率高于中高分化、无淋巴结转移、TNM分期为Ⅰ~Ⅱ期的胃癌组织(均P<0.05)。结论p-PI3K、p-Akt胃癌组织阳性表达率高,p-PI3K、p-Akt表达情况与分化程度、疾病分期、淋巴结转移密切相关,PI3K/Akt信号通路可能为临床药物治疗提供新靶点。

替罗非班通过磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路对氧糖剥夺心肌细胞的干预作用

目的探讨替罗非班对氧糖剥夺(oxygen-glucose deprivation,OGD)心肌细胞的干预作用,并探索其相关机制。方法H9C2细胞被分为正常组、模型组、替罗非班组、抑制剂组、替罗非班+抑制剂组。建立OGD细胞模型,以MTT曲线确定最终的实验浓度和作用时间为替罗非班100 nmol/L,作用时间为24 h。以流式细胞仪检测细胞活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平;以酶联免疫吸附试验法检测丙二醛(malondialdehyde,MDA)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素(interleukin,IL)-6、心房利钠肽(atrial natriuretic peptide,ANP)和脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)浓度;以Western Blot法检测磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)、磷酸化PI3K(phosphorylation PI3K,p-PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)和磷酸化AKT(phosphorylation AKT,p-AKT)的表达。结果和模型组比较,替罗非班组、抑制剂组、替罗非班+抑制剂组的ROS和TNF-α、IL-6、ANP、BNP浓度显著降低,p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的表达水平显著升高,差异均有统计学意义(P<0.05)。和抑制剂组比较,替罗非班+抑制剂组p-PI3K/PI3K和p-AKT/AKT的表达水平显著降低,ROS和TNF-α、IL-6、ANP、BNP浓度显著降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论替罗非班可调控PI3K/AKT信号通路,对OGD心肌细胞起到保护作用。

血管外膜脂肪组织源性脂联素通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路促进血管内膜损伤后内皮细胞增生的研究

目的 研究血管外膜脂肪组织分泌的脂联素对血管内膜损伤后内皮细胞增生的影响及可能的分子机制.方法 将C57BL/6J野生型小鼠72只完全随机分为A组（仅剪开颈部皮肤后再缝合）、B组（给予颈动脉套管结扎）、C组（剪开颈部皮肤后于颈动脉周围移植脂联素基因敲除小鼠脂肪组织）及D组（颈动脉套管结扎同时于颈动脉周围移植脂联素基因敲除小鼠脂肪组织）,每组18只.手术8周后处死小鼠,取各组小鼠左颈总动脉切片,采用苏木精-伊红染色,观察各组小鼠颈动脉内膜增生情况并测定内膜增厚程度,以内膜面积与中膜面积的比值表示.应用酶联免疫吸附试验检测各组小鼠颈动脉组织内脂联素水平.采用蛋白质印迹法检测各组小鼠颈动脉组织内磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）、蛋白激酶B（AKT）及其磷酸化产物的水平.体外实验将小鼠内皮细胞以5＆#215;104个/ml接种于内皮细胞生长培养基中,将细胞分为对照组、脂联素组（在对照组基础上加入重组脂联素100 mg/L）及PI3K抑制组（在对照组基础上加入重组脂联素100 mg/L和PI3K抑制剂LY29400 250 μg/L）,利用标记5-溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）的微小RNA（miR-21）模拟物转染小鼠内皮细胞,使其在细胞中呈过表达状态,通过荧光显微镜观察各组内皮细胞的增生情况,比较BrdU阳性细胞百分率.结果 B组小鼠颈动脉内膜增厚程度明显大于A组、C组和D组,差异均有统计学意义[（1.37±0.09）比（0.82±0.18）、（0.71±0.05）、（1.03±0.06）,P值分别为0.023、0.001、0.010].B组小鼠脂联素的表达水平明显高于A组、C组和D组,差异有统计学意义[（95±6） ng/L比（77±5）ng/L、（55±5）ng/L、（70±7）ng/L,P=0.049、0.021、0.027].C组与D组小鼠颈动脉组织内AKT及PI3K磷酸化产物水平较A组与B组降低.体外实验脂联素组内皮细胞的BrdU阳性细胞率较对照组明显增加,差异有统计学意义[（30.0±1.7）％比（10.5±1.4）％,P＜0.01];PI3K抑制组内皮细胞的BrdU阳性细胞率较脂联素组明显降低,差异具有统计学意义[（13.9±1.8）％比（30.0±1.7）％,P＜0.01].结论 血管外膜脂肪组织源性脂联素可能通过PI3K/AKT信号通路在血管内膜损伤后促进内皮细胞增生.

食管鳞状细胞癌组织中miR-504和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B通路相关分子表达及其与患者临床病理学特征的关系

目的探讨食管鳞状细胞癌组织中miR-504和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)通路相关分子的表达及其与患者临床病理学特征的关系。方法选择2016年1月至2018年12月于邯郸市中心医院就诊并进行手术治疗的食管鳞状细胞癌患者67例为研究对象,取术中切除的新鲜食管鳞状细胞癌组织和距离癌组织5 cm以上正常食管鳞状上皮组织(癌旁组织),采用反转录-聚合酶链反应检测食管鳞状细胞癌组织和癌旁组织中miR-504表达,免疫组织化学法检测食管鳞状细胞癌组织及癌旁组织中PI3K、磷酸化Akt(p-Akt)表达;分析食管鳞状细胞癌组织中miR-504、PI3K、p-Akt表达与患者临床病理学特征的关系及miR-504与PI3K、p-Akt表达的相关性。结果miR-504在癌组织中的表达量显著低于癌旁组织(P<0.05),miR-504在不同分化程度癌组织中的表达量两两比较差异均有统计学意义(P<0.05),miR-504在Ⅰ期患者癌组织中表达量显著高于Ⅱ、Ⅲ期患者(P<0.05)。PI3K、p-Akt在癌组织中表达评分显著高于癌旁组织(P<0.05)。PI3K、p-Akt在不同分化程度癌组织中的表达量两两比较差异均有统计学意义(P<0.05)。PI3K、p-Akt在Ⅱ、Ⅲ期患者癌组织中表达量显著高于Ⅰ期患者(P<0.05)。食管鳞状细胞癌组织中miR-504、PI3K、p-Akt的表达与患者年龄、性别无关(P>0.05),与癌组织的分化程度、TNM分期和淋巴结转移相关(P<0.05)。食管鳞状细胞癌组织中miR-504表达与PI3K、p-Akt表达呈明显负相关(r=-0.354、-0.519,P<0.05)。结论miR-504在食管鳞状细胞癌组织中的表达与肿瘤的分化程度、TNM分期和淋巴结转移有关,其在食管鳞状细胞癌中可能作为抑癌基因发挥作用,且这种抑制作用可能与抑制肿瘤细胞内PI3K/Akt信号通路的活性有关。

丙泊酚对过氧化氢诱导的大鼠肝Kupffer细胞氧化应激损伤及磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B信号通路的影响

目的探讨丙泊酚对过氧化氢诱导的大鼠肝Kupffer细胞氧化应激损伤及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路的影响。方法从SD大鼠肝组织中分离出Kupffer细胞。用100μmol/L过氧化氢诱导Kupffer细胞建立氧化应激损伤细胞模型,并随机分为模型组、丙泊酚低浓度组、丙泊酚中浓度组、丙泊酚高浓度组和阳性对照组,另取正常Kupffer细胞作为对照组。对照组和模型组均以不含丙泊酚的细胞培养液培养,丙泊酚低、中、高浓度组分别以含5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L丙泊酚的细胞培养液培养,阳性对照组以含0.1μmol/L盐酸右美托咪定的细胞培养液培养。培养12 h后,检测细胞活性、细胞凋亡率,细胞中乳酸脱氢酶(LDH)释放量、活性氧簇含量、过氧化氢酶(CAT)活性、PI3K和Akt磷酸化水平。结果与对照组相比,模型组Kupffer细胞活性、CAT活性、PI3K和Akt的磷酸化水平均降低,凋亡率、LDH释放量、活性氧簇含量均升高(均P<0.05);与模型组相比,阳性对照组、丙泊酚低、中浓度组Kupffer细胞活性、CAT活性、PI3K和Akt的磷酸化水平均升高,凋亡率、LDH释放量、活性氧簇含量均降低(均P<0.05),而丙泊酚高浓度组Kupffer细胞CAT活性、PI3K和Akt的磷酸化水平均降低,凋亡率、LDH释放量、活性氧簇含量均升高(均P<0.05)。结论低、中浓度(5μmol/L、25μmol/L)的丙泊酚能够减轻过氧化氢诱导的Kupffer细胞氧化应激损伤,提高细胞活性,抑制细胞凋亡,其机制可能与激活PI3K/Akt通路有关。

磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/FoxO1信号通路和白细胞介素17在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎中的表达变化

目的探讨磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/FoxO1和白细胞介素17(IL-17)与自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发病的相关机制。方法将C57BL/6小鼠60只随机分为对照组和模型组(EAE),每组30只。采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35~55)联合完全弗氏佐剂诱导建立EAE模型。观察各组小鼠的行为学评分,并于评分4分时取各组小鼠的脊髓、脾脏和外周血。HE染色及Luxol fast blue染色观察脊髓炎性细胞浸润及髓鞘脱失情况;脾细胞在体外用a-CD3和MOG35~55分别刺激7 d,收集其上清液,ELISA检测小鼠脾细胞上清液和血清中细胞因子白细胞介素17(IL-17)和干扰素γ(IFN-γ)的含量;流式细胞术检测小鼠脾脏中CD4+IL-17+细胞的百分比;Western blotting检测IL-17及PI3K/Akt/FoxO1在小鼠脊髓中表达。结果与对照组相比,EAE组小鼠行为学评分明显高于对照组(P<0.05);HE染色及Luxol fast blue染色结果显示,EAE组脊髓病理组织表现出炎性浸润和髓鞘脱失显著增多(P<0.05)。ELISA结果显示,EAE组血清中及体外培养脾细胞的上清中IL-17和IFN-γ的含量明显升高。流式结果表明,EAE组小鼠脾细胞中CD4+IL-17+T细胞的百分比明显增加(P<0.05)。Western blotting结果显示,EAE组小鼠脊髓IL-17、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白水平明显升高,但磷酸化FoxO1(p-FoxO1)蛋白水平显著降低(P<0.05)。结论 EAE组小鼠脊髓中促炎因子IL-17分泌增加,可能与PI3K/Akt/FoxO1信号通路活化进而激活T细胞功能有关。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白信号通路与糖尿病视网膜病变的关系研究进展

磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Proten Kinase B,Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(m TOR)信号通路是人体细胞内重要的信号转导通路,参与了细胞生长、增殖、分化、蛋白质合成、葡萄糖转运及血管生成等大量细胞生命活动。糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy,DR)发生发展的不同阶段都有该通路的参与。本文对PI3K/Akt/m TOR信号通路与DR发展的关系以及该通路在DR进展中的作用机制研究进行综述,以期为DR的靶向治疗提供一定的新思路。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路对生长激素介导的心肌成纤维细胞增殖的影响

目的探讨生长激素(GH)对心肌成纤维细胞(CFs)增殖的影响及其作用机制。方法以不同浓度的重组人生长激素(rhGH)(100、200、500、1 000 ng/ml)和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)抑制剂LY294002(10μmol/L)单独或同时作用CFs 48 h后,采用MTT法检测细胞增殖,Wertern Blot检测PI3K/Akt信号途径中Akt和磷酸化Akt(p-Akt)的蛋白水平的变化。结果 rhGH呈浓度依赖性的促进CFs的增殖;rhGH增加p-Akt的蛋白水平;LY294002可阻断rhGH诱导的CFs的增殖。结论生长激素可通过激活PI3K/Akt信号通路促进心肌成纤维细胞的增殖。

磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路与高血压

综述磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路的构成、转导途径及其在高血压及相关靶器官损害中的作用机制,并阐述基于PI3K/Akt信号通路高血压的中医药治疗进展,旨在为高血压的临床诊疗提供新的思路和治疗靶点。

和血柔肝方通过PI3K/Akt/NF-κB信号通路调控自噬相关蛋白改善大鼠肝纤维化机制研究

目的:探讨和血柔肝方通过调控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/核因子-κB(NF-κB)信号通路调控自噬相关蛋白改善大鼠肝纤维化的作用机制。方法:将40只SPF级SD雄性大鼠随机分为空白对照组、模型组、秋水仙碱组与和血柔肝方最佳剂量组,每组各10只。除空白对照组外,其余各组均以四氯化碳(CCl_(4))构建肝纤维化大鼠模型。造模8周后,空白对照组、模型组采用0.9%氯化钠溶液灌胃;秋水仙碱组采用秋水仙碱灌胃;和血柔肝方最佳剂量组以和血柔肝方灌胃。灌胃结束后,取各组大鼠血清及肝脏组织。生化检测各组大鼠血清天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平;HE及Masson染色评估大鼠肝纤维化情况。RT-qPCR法检测大鼠肝组织PI3K、Akt、NF-κB以及NF-κB下游自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链3Ⅱ(LC3-Ⅱ)、Beclin-1的mRNA的表达水平;蛋白免疫印迹(Western blot)检测大鼠肝组织中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、NF-κB P65、p-NF-κB P65、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达水平。结果:与模型组比较,和血柔肝方最佳剂量组血清ALT、AST水平明显降低(P<0.05)。与模型组比较,和血柔肝方最佳剂量组大鼠肝脏病理受损可见明显缓解。与模型组比较,和血柔肝方最佳剂量组大鼠肝组织PI3K、Akt、NF-κB、LC3-Ⅱ、Beclin-1基因表达水平明显降低(P<0.05)。与模型组比较,和血柔肝方最佳剂量组的PI3K、Akt、p-Akt、NF-κB P65、p-NF-κB P65、LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表达Western blot结果均显著降低(P<0.05)。结论:和血柔肝方可通过抑制肝纤维化大鼠肝组织PI3K/Akt/NF-κB信号通路的表达以降低自噬相关蛋白活化,从而改善大鼠肝脏炎症,减缓肝脏病理损害,改善肝纤维化。

二甲双胍对胰岛素抵抗小鼠肝组织中胎球蛋白A表达及磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路的影响

目的探讨二甲双胍对胰岛素抵抗(IR)小鼠肝组织中胎球蛋白A(FA)表达及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路的影响。方法将30只无特定病原体级健康雄性小鼠适应性喂养1周后,随机选择10只小鼠为正常组,给予普通饲料喂养8周;另外20只小鼠给予高脂饲料喂养8周,制备IR模型。将造模成功的16只小鼠随机分为模型组(n=8)和二甲双胍组(n=8),二甲双胍组小鼠给予二甲双胍灌胃,102.75 mg·kg^(-1),每日1次,连续给药4周;正常组和模型组小鼠给予同等剂量的生理盐水灌胃。造模8周期间和给药4周期间,每周称量小鼠体质量。给药4周后,3组小鼠禁食12 h,采用腹腔注射葡萄糖耐量实验(IPGTT)检测小鼠糖耐量。给药4周后,使用小鼠胰岛素酶联免疫吸附试验法测定小鼠血清空腹胰岛素(FINS)水平,并计算稳态模型评估-胰岛素抵抗指数(HOMA-IR);采用实时荧光定量聚合酶链式反应法检测小鼠肝组织中胎球蛋白A(FA)、PI3K、Akt mRNA相对表达量;采用Western blot法检测小鼠肝组织中FA、PI3K、磷酸化PI3K(p-PI3K)、Akt、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白相对表达量。结果造模8周后,模型组和二甲双胍组小鼠的体质量显著高于正常组(P<0.05);给药1、2、3、4周后,模型组和二甲双胍组小鼠的体质量显著高于正常组(P<0.05);给药3、4周后,二甲双胍组小鼠的体质量显著低于模型组(P<0.05)。给药4周后,模型组和二甲双胍组小鼠的IPGTT曲线下面积显著高于正常组,二甲双胍组小鼠的IPGTT曲线下面积显著低于模型组(P<0.05)。给药4周后,模型组小鼠的FINS水平及HOMA-IR显著高于正常组和二甲双胍组(P<0.05);给药4周后,二甲双胍组与正常组小鼠的FINS水平及HOMA-IR比较差异无统计学意义(P>0.05)。给药4周后,模型组小鼠肝组织中FA、PI3K、Akt mRNA相对表达量及FA蛋白相对表达量显著高于正常组和二甲双胍组,p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt显著低于正常组和二甲双胍组(P<0.05);二甲双胍组与正常组小鼠肝组织中FA、PI3K、Akt mRNA相对表达量、FA蛋白相对表达量及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论二甲双胍可改善IR小鼠的肥胖状态,提高机体对血糖浓度的调节能力,降低FINS水平及HOMA-IR,其机制可能为二甲双胍通过降低肝脏FA表达,激活PI3K/Akt通路,从而缓解IR。

PTEN通过磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信号通路对非小细胞肺癌顺铂敏感性的影响

目的探讨PTEN通过磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B (AKT)信号通路对非小细胞肺癌(NSCLC)顺铂敏感性的影响。方法选择2016年1月至2018年1月于郑州大学附属肿瘤医院手术切除的60例NSCLC患者的癌组织标本及对应的癌旁组织(距肿瘤边缘> 5 cm)标本,采用免疫组织化学染色检测癌组织和癌旁组织中PTEN蛋白表达。培养NSCLC细胞株A549,取对数生长期细胞并随机分为blank组(不作任何处理)、pcDNAPTEN组(转染PTEN过表达质粒)、pcDNA-PTEN对照组(转染PTEN过表达对照质粒)、siRNA-PTEN组(转染siRNAPTEN质粒)、siRNA-PTEN对照组(转染siRNA-PTEN对照质粒)、wortmannin组(转染PI3K/AKT信号通路抑制剂)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)组(转染PI3K/AKT信号通路激动剂)、pcDNA-PTEN+IGF-1组(共转染pcDNA-PTEN过表达质粒和PI3K/AKT信号通路激动剂),采用Lipofectamine 2000介导细胞转染,转染6 h后更换为完全培养基,37℃培养48 h后收集细胞;采用定量反转录聚合酶链反应检测A549细胞中PTEN、PI3K及AKT mRNA表达,Western blot法检测A549细胞中PTEN、PI3K及AKT蛋白表达,Transwell实验检测A549细胞侵袭能力,划痕实验检测A549细胞迁移能力。取各组转染后培养48 h细胞,分别加入0.00、0.75、1.50、3.00、6.00、12.00μmol·L-1顺铂,培养48 h后应用细胞计数试剂盒-8检测A549细胞对顺铂的敏感性。结果 NSCLC患者癌组织中PTEN蛋白阳性表达率显著低于癌旁组织,癌组织中PI3K、AKT蛋白阳性表达率显著高于癌旁组织(P <0.05)。blank组、pcDNA-PTEN对照组和siRNAPTEN对照组A549细胞中PTEN、PI3K、AKT蛋白及mRNA表达比较差异无统计学意义(P> 0.05);与pcDNA-PTEN对照组比较,pcDNA-PTEN组A549细胞中PTEN蛋白及mRNA表达增加,PI3K、AKT蛋白及mRNA表达减少(P <0.05);与siRNA-PTEN对照组比较,siRNA-PTEN组A549细胞中PTEN蛋白及mRNA表达减少,PI3K、AKT蛋白及mRNA表达增加(P <0.05);与pcDNA-PTEN组比较,pcDNA-PTEN+IGF-1组A549细胞中PTEN蛋白及mRNA表达减少,PI3K、AKT蛋白及mRNA表达增加(P <0.05);与blank组比较,wortmannin组A549细胞中PTEN蛋白和mRNA表达增加,PI3K、AKT蛋白及mRNA表达减少(P <0.05);与blank组和wortmannin组比较,IGF-1组A549细胞中PTEN蛋白和mRNA表达减少,PI3K、AKT蛋白及mRNA表达增加(P <0.05)。blank组、pcDNA-PTEN对照组和siRNA-PTEN对照组A549细胞侵袭和迁移能力比较差异无统计学意义(P> 0.05);pcDNA-PTEN组A549细胞侵袭和迁移能力显著低于pcDNA-PTEN对照组(P <0.05),siRNA-PTEN组A549细胞侵袭和迁移能力显著高于siRNA-PTEN对照组(P <0.05),IGF-1组A549细胞侵袭和迁移能力显著高于blank组和wortmannin组(P <0.05),wortmannin组A549细胞侵袭和迁移能力显著低于blank组(P <0.05),pcDNA-PTEN+IGF-1组A549细胞侵袭和迁移能力显著高于pcDNA-PTEN组(P <0.05)。随着顺铂浓度增加,各组A549细胞存活率逐渐降低(P <0.05)。各浓度顺铂干预下,blank组、pcDNA-PTEN对照组和siRNA-PTEN对照组A549细胞存活率比较差异无统计学意义(P> 0.05),pc DNAPTEN组A549细胞存活率显著低于pcDNA-PTEN对照组(P <0.05),siRNA-PTEN组A549细胞存活率显著高于siRNA-PTEN对照组(P <0.05),wortmannin组A549细胞存活率显著低于blank组(P <0.05),IGF-1组A549细胞存活率显著高于wortmannin组和blank组(P <0.05),pcDNA-PTEN+IGF-1组A549细胞存活率显著高于pcDNA-PTEN组(P <0.05)。结论 NSCLC组织中PTEN蛋白表达降低,上调PTEN基因表达可能通过抑制PI3K/AKT信号通路活性而降低细胞侵袭和迁移能力,提高NSCLC细胞对顺铂的敏感性。

磷脂酰肌醇-3-羟激酶/蛋白激酶B信号通路参与龙葵碱抑制PC-3细胞增殖与凋亡过程的机制研究

目的:探讨磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路在龙葵碱体外诱导人前列腺癌PC-3细胞增殖与凋亡机制中的作用。方法:体外培养人前列腺癌PC-3细胞株,应用CCK-8法测定龙葵碱对PC-3细胞增殖抑制情况,应用流式细胞仪检测龙葵碱对PC-3细胞凋亡的影响,应用蛋白质印迹法(WesternBlot)检测PI3K/AKt通路中Akt、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、PI3K、磷酸化磷脂酰肌醇-3-羟激酶(p-PI3K)及凋亡过程中Caspase-3、Bax、Bcl-2、P53等蛋白的表达。结果:龙葵碱可抑制PC-3细胞增殖,PC-3细胞增殖抑制率随龙葵碱浓度提高和作用时间延长而升高(P<0.05);龙葵碱呈浓度依赖性地进行诱导PC-3细胞凋亡,PC-3细胞凋亡百分率随龙葵碱浓度提高而升高(P<0.05);龙葵碱可呈浓度依赖性地下调p-PI3K、Bcl-2、p-Akt蛋白表达(P<0.05),上调Bax、caspase-3、P53蛋白表达(P<0.05)。结论:龙葵碱可通过PI3K/AKt信号通路抑制PC-3细胞增殖,诱导PC-3细胞凋亡。