全反式维甲酸联合小剂量阿糖胞苷对急性髓系白血病细胞磷脂酰肌醇3激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶信号通路的作用机制研究

目的:探讨全反式维甲酸(ATRA)联合小剂量阿糖胞苷(Ara-C)对急性髓系白血病细胞磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(AKT)信号通路的作用机制。方法:选取人急性髓系白血病细胞HL-60,分为空白对照组(未经任何处理的HL-60细胞)、Ara-C组(加入0.5μmol/LAra-C)、ATRA组(加入2μmol/LATRA)、ATRA+Ara-C组(加入2μmol/LATRA和0.5μmol/LAra-C),继续培养24、48、72h,采用CCK8检测HL-60细胞活力,AnnexinV双染法检测HL-60细胞凋亡,qRT-PCR检测PI3K、AKT-mRNA表达,Westernblot检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达,并进行细胞形态学观察。结果:空白对照组HL-60细胞活力高于Ara-C+ATRA组、Ara-C组、ATRA组,Ara-C组、ATRA组HL-60细胞活力高于Ara-C+ATRA组(均P<0.05)。Ara-C+ATRA组HL-60细胞凋亡率高于Ara-C组、ATRA组,Ara-C组、ATRA组HL-60细胞凋亡率高于空白对照组(均P<0.05)。HL-60细胞胞体多呈圆形,可见瘤状突起,胞核多为类圆形,Ara-C组、ATRA组染色质凝聚,颜色变深,部分胞核变小,Ara-C+ATRA组染色质凝聚,颜色变深,可见核固缩、核碎裂。空白对照组HL-60细胞PI3K、AKTmRNA表达高于Ara-C组、ATRA组,Ara-C组、ATRA组HL-60细胞PI3K、AKTmRNA表达高于Ara-C+ATRA组(均P<0.05)。空白对照组HL-60细胞P-PI3K、P-AKT蛋白表达高于Ara-C组、ATRA组,Ara-C组、ATRA组HL-60细胞P-PI3K、P-AKT蛋白表达高于Ara-C+ATRA组(均P<0.05)。结论:Ara-C+ATRA能通过抑制PI3K/AKT信号通路激活,促进HL-60细胞凋亡。

磷脂酰肌醇3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶信号途径及其在肌肉生长发育中的调控机制

磷脂酰肌醇3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K/Akt)是一类特异性催化磷脂酰肌醇(PI)的激酶,其信号途径是细胞内重要的信号转导通路之一,广泛参与动物机体的新陈代谢过程。本文就PI3K/Akt信号途径的结构、活化机制及其在细胞凋亡和肌肉生长发育中的调控机制进行综述。

红芪多糖调控磷脂酰肌醇3-激酶／丝氨酸苏氨酸激酶信号通路抑制结肠癌细胞增殖及促进凋亡的柳制

目的探讨红芪多糖调控磷脂酰肌醇3-激酶／丝氨酸苏氨酸激酶（P13K／Akt）信号通路抑制结肠癌细胞增殖及促进凋亡的机制。方法25、50、100、200、400mg／L的红芪多糖干预人结肠癌SW480细胞24、48、72h，细胞计数试剂盒（CCK-8）实验检测细胞增殖，计算半数抑制浓度（IC50）值；190mg／L的红芪多糖干预SW480细胞48h，不加药物的作为对照组，流式细胞仪检测细胞周期及细胞凋亡率；Western blot检测细胞核增殖抗原（Ki-67）、增殖细胞核抗原（PCNA）、β-连环蛋白（β-catenin）、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶．3（Cleaved Caspase-3）、P13K、Akt、磷酸化的丝氨酸苏氨酸激酶（p-Akt）蛋白表达。结果不同浓度的红芪多糖处理HepG2细胞24、48、72h后细胞抑制率均受到不同程度的抑制，且对细胞的抑制作用随着时间的延长逐渐增强，与对照组[48h（1．18±0．42）％]比较差异均有统计学意义（48h：t25mg/L=6．002，P2，mg／L=0．007；tmg/L=7．452，P50mg/L=0．005；t100mg／L=8．236，P100mg／L=0．003；t200mg/L=9．113，P200mg／L=0．002；t400mg／L=10．221，P400mg／L=0．001）。结论红芪多糖可抑制结肠癌细胞增殖及促进细胞凋亡，其机制与P13K／Akt信号通路的调控有关。

阿伐他汀通过磷脂酰肌醇3-激酶／丝氨酸苏氨酸蛋白激酶／哺乳动物雷帕霉素靶蛋白途径调节HL-60白血病细胞凋亡的作用

目的观察阿伐他汀对白血病细胞HL-60增殖和凋亡的影响，探讨磷脂酰肌醇3-激酶／丝氨酸苏氨酸蛋白激酶／哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K／AKT／mTOR）信号途径在此过程中的作用。方法取对数生长期细胞，分为阴性对照组和实验组（阿伐他汀干预水平分别为1、5、10μmol/L），培养12、24、48h，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测白血病细胞的增殖能力；培养48h后，流式细胞术检测白血病细胞凋亡变化，反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和Western blot方法检测PI3K、AKT和mTOR基因表达的变化。结果阿伐他汀对白血病细胞HL-60有明显抑制增殖和促凋亡作用。10μmoL／L阿伐他汀对HL—60细胞干预48h后对细胞增殖的抑制作用最强，抑制率达到（39．77±3．01）％，与阴性对照组相比，差异有统计学意义（t=4．016，P〈0．01），同时对细胞凋亡的诱导作用最强，凋亡率达到（43．29±3．91）％，与阴性对照组相比，差异有统计学意义（t=3．625，P〈0．05）。此外，PI3K、AKT和mTOR在白血病细胞HL-60均有基础表达，10μmol/L阿伐他汀对HL-600细胞干预48h后，PI3K、AKT和mTOR基因mRNA表达水平下调最为明显，分别下降了（37．05±4．11）％、（53．79±3．27）％、（40．63±2．42）％，与阴性对照组比较差异均有统计学意义（t=4．805、3．799、4．312，P均〈0．05），同时对PI3K、AKT和mTOR蛋白表达水平下调最为明显，分别下降了（41．09±3．17）％、（45．67±2．92）％和（63．41±3．59）％，与阴性对照组比较差异均有统计学意义（t=3．576、4．727、4．902，P均〈0．05）。结论阿伐他汀可能通过PI3K／AKT／mTOR信号通路抑制白血病细胞增殖并诱导细胞凋亡。

微RNA-181靶向磷酸酶张力蛋白基因调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶信号通路在高尿酸血症大鼠肾损伤中的作用

目的探讨微RNA(miRNA)-181靶向磷酸酶张力蛋白基因(PTEN)调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K/Akt)信号通路在高尿酸血症大鼠肾损伤中的作用。方法选择雄性Wistar大鼠40只,随机分为对照组10只、模型组10只、阴性对照组10只和miRNA-181抑制组10只,检测大鼠血清尿酸、肌酐、尿素氮;采用苏木精-伊红(HE)染色,光镜下观察各组大鼠肾脏组织病理形态学改变;实时荧光定量(qRT)-PCR检测各组大鼠肾组织miRNA-181和PTEN、PI3K、Akt mRNA表达水平;蛋白质印迹法检测各组大鼠肾组织PTEN、PI3K、Akt、磷酸化(p)-Akt蛋白表达水平;双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-181与PTEN的靶向关系。多组间比较采用单因素方差分析,方差齐,进一步组间两两比较采用LSD-t检验;若方差不齐,进一步组间两两比较采用Tamhane′s T2检验;2组间比较采用独立样本t检验。结果与对照组尿酸(135±21)mmol/L、肌酐(27.8±2.1)μmol/L、尿素氮(6.8±0.5)μmol/L相比,模型组和阴性对照组大鼠尿酸[(213±28)mmol/L,(214±23)mmol/L;肌酐(49.2±2.3)μmol/L,(48.6±2.2)μmol/L;尿素氮(11.5±2.7)μmol/L,(11.7±2.5)μmol/L]含量显著升高(F尿酸=26.739,F肌酐=259.055,F尿素氮=12.921,均P<0.05);与阴性对照组相比,miRNA-181抑制组大鼠尿酸(169±21)mmol/L、肌酐(33.7±1.8)μmol/L、尿素氮(9.1±1.7)μmol/L含量降低(LSD-t尿酸=4.356,LSD-t肌酐=15.773,LSD-t尿素氮=2.858,均P<0.05)。模型组和阴性对照组大鼠肾组织miRNA-181表达水平(1.88±0.16、1.84±0.18)显著高于对照组(0.53±0.08)(F=193.554,P<0.05),而PTEN蛋白(0.18±0.02、0.16±0.02)和mRNA表达水平(0.48±0.08、0.44±0.07)均低于对照组(1.27±0.06、1.27±0.16)(F蛋白表达水平=515.116,FmRNA表达水平=141.470,均P<0.05);抑制miRNA-181后,大鼠肾组织肾组织miRNA-181表达水平(1.35±0.58)显著降低(LSD-t=10.341,P<0.05),PTEN蛋白(0.84±0.05)和mRNA表达水平(0.90±0.08)均升高(LSD-t蛋白表达水平=20.471,Tamhane′s T2 mRNA表达水平=13.881,均P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验分析结果显示,PTEN是miRNA-181的靶基因。与对照组(0.18±0.02、0.09±0.01、0.05±0.02、1.06±0.07、0.96±0.06)相比,模型组和阴性对照组大鼠肾组织PI3K(1.01±0.06、1.00±0.06)、Akt(0.90±0.05、0.95±0.04)、p-Akt蛋白表达水平(0.99±0.07、0.97±0.05)和PI3K(3.63±0.18、3.68±0.22)、Akt mRNA表达水平(2.38±0.05、2.34±0.12)均显著升高(FPI3K蛋白表达水平=169.979,FAkt蛋白表达水平=393.411,Fp-Akt蛋白表达水平=164.201,FPI3K mRNA表达水平=563.944,FAkt mRNA表达水平=141.470,均P<0.05);抑制miRNA-181表达后,大鼠肾组织PI3K(0.69±0.06)、Akt(0.42±0.03)、p-Akt蛋白表达水平(0.50±0.05)和PI3K(2.40±0.09)、Akt mRNA表达水平(1.40±0.12)均降低(LSD-tPI3K蛋白表达水平=7.432,LSD-tAkt蛋白表达水平=18.291,LSD-tp-Akt蛋白表达水平=9.595,Tamhane′s T2PI3K mRNA表达水平=17.070,Tamhane′s T2Akt mRNA表达水平=17.357,均P<0.05)。结论抑制miRNA-181表达,可靶向PTEN抑制PI3K/Akt信号通路保护高尿酸血症大鼠肾损伤。

内皮素1受体拮抗剂通过调控PI3K-Akt-HIF-1α信号通路减轻兔单肺通气时肺损伤的研究

目的 探讨调控磷脂酰肌醇3-激酶-丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶-缺氧诱导因子1α(phosphatidylinositol 3-kinase-serine threonine protein kinase-hypoxia inducible factor 1 alpha,PI3K-Akt-HIF-1α)信号通路对减轻内皮素1受体拮抗剂BQ-123预处理的兔单肺通气(one-lung ventilation,OLV)时肺损伤的作用。方法 20只健康日本大耳白兔,雌雄不限,随机分为对照组、OLV组、OLV+BQ-123组和OLV+BQ-123+LY294002组,每组5只。对照组兔持续双肺通气2.5 h,OLV组、OLV+BQ-123组及OLV+BQ-123+LY294002组先行右侧OLV 2 h,再恢复双肺通气0.5 h。OLV+BQ-123组和OLV+BQ-123+LY294002组兔在OLV前10 min经股静脉注射BQ-123 50μg/kg,OLV+BQ-123+LY294002组在给予BQ-123前静脉输注磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)的特异性抑制剂(LY294002) 0.3 mg/kg,输注时间为5 min。实验结束后留取左侧肺组织,称重计算湿/干比(wet-to-dry,W/D),行病理学切片并评估肺损伤程度;采用Western blot测定PI3K-Akt-HIF-1α信号通路关键因子磷酸化丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(phosphorylated serine-threonine protein kinase,p-Akt)及缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)蛋白表达。结果 与对照组比较,OLV组兔肺水肿状态、W/D、肺损伤病理评分增加,p-Akt和HIF-1α蛋白相对表达量下调(P均<0.05);BQ-123预处理干预后,OLV+BQ-123组兔肺损伤程度、W/D下降、p-Akt和HIF-1α蛋白相对表达量上调(P均<0.05),且较OLV+BQ-123+LY294002组兔肺损伤程度、W/D降低、p-Akt和HIF-1α蛋白相对表达量上调(P均<0.05)。结论 内皮素1受体拮抗剂BQ-123通过调控PI3K-Akt-HIF-1α信号通路可减轻兔OLV时非通气侧的肺损伤。

磷脂酰肌醇3-激酶-丝氨酸苏氨酸蛋白激酶Akt信号通路与脑缺血再灌注损伤

缺血性脑卒中具有发病率、复发率、致残率及病死率高的特点。脑缺血再灌注损伤的防治一直是神经病学领域的重点，有关其相关机制的研究是当今亟待解决的问题，而缺血半暗带的神经细胞凋亡更是研究的热点。脑缺血再灌注后既启动了凋亡信号通路，也激活了抗凋亡信号通路，两者的动态平衡决定了细胞损伤的最终转归。

微小RNA-153靶向磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶通路调控急性淋巴细胞白血病细胞增殖

目的 探讨微小RNA(miRNA,miR)-153靶向调控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)通路对人急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞Jurkat的影响。方法 miR-153模拟物(miR-153模拟物组)、miR-153抑制物(miR-153抑制物组)转染Jurkat细胞后,观察细胞增殖、周期和凋亡,检测miR-153、PI3K和Akt mRNA及蛋白表达,并验证PI3K是否为miR-153的靶基因。结果 与阴性对照组比较,miR-153模拟物组miR-153表达显著升高约10倍(t=39.596,P<0.01),miR-153抑制物组miR-153表达明显降低(t=14.651,P<0.01)。miR-153模拟物组细胞活性显著下降(t=10.931,P<0.01),miR-153抑制物组细胞活性明显升高(t=7.640,P<0.01)。miR-153模拟物组中PI3K总蛋白、PI3K mRNA及p-Akt表达明显下降(t=7.161,P<0.01;t=6.684,P<0.01;t=10.769,P<0.01),而miR-153抑制物组PI3K总蛋白、PI3K mRNA及p-Akt表达显著升高(t=3.998,P<0.05;t=8.902,P<0.01;t=7.078,P<0.01)。miR-153模拟物组G0/G1期细胞比例明显增多,而S期和G2/M期细胞显著下降(t=3.786,P<0.05;t=3.012,P<0.05;t=4.948,P<0.01);miR-153抑制物组G0/G1期细胞显著下降,S期和G2/M期细胞所占比例明显增加(t=5.356,P<0.01;t=3.055,P<0.05;t=3.893,P<0.05)。miR-153模拟物组细胞凋亡率明显增加(t=4.673,P<0.05),而miR-153抑制物组凋亡率显著下降(t=5.618,P<0.01)。与空载质粒组比较,3’端非编码区(3’UTR)质粒组相对荧光素酶活性显著降低(t=7.925,P<0.01)。结论 miR-153能够直接靶向PI3K/Akt信号通路,调控Jurkat细胞增殖和凋亡。

microRNA—155通过磷脂酰肌醇3激酶/丝—苏氨酸蛋白激酶信号通路调节低氧诱导的缺血性脑卒中的血管生成研究

目的研究微小RNA155(miRNA-155)通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝-苏氨酸蛋白激酶(AKT)信号通路调节低氧诱导的缺血性脑卒中的血管生成作用机制。方法用线栓法建立永久性局灶脑缺血大鼠模型,并在实施造模手术前48 h给予CoCl2构成持续低氧环境。将造模后的大鼠随机分为模型组、对照组、实验A组和实验B组,每组15只;另取15只健康大鼠给予只穿线不结扎处置作为假手术组。模型组和假手术组术后均不给予任何处理;对照组造模手术后5 min给予单侧脑室注射10 mg·kg^(-1)慢病毒载体miRNA-155-siRNA-NC110μL;实验A组造模手术后5 min给予单侧脑室注射10 mg·kg^(-1)慢病毒载体miRNA-155-siRNA 10μL;实验B组造模手术后5 min给予单侧脑室注射10 mg·kg^(-1) LY29400210μL。5组大鼠均每周给药1次,每组均干预28 d。用免疫组化法检测大鼠的脑组织微血管密度(MVD),用蛋白质印迹法检测大鼠脑组织中血管内皮生长因子(VEGF)、磷酸化磷脂酞肌醇3-激酶(p-PI3K)和磷酸化丝-苏氨酸蛋白激酶(p-AKT)蛋白的表达水平。结果假手术组、模型组、对照组、实验A组和实验B组大鼠的MVD分别为(7.53±1.46),(22.00±1.69),(21.73±1.94),(43.60±2.61)和(43.60±3.74)个,VEGF蛋白相对表达水平分别为1.00±0.03,1.35±0.04,1.33±0.03,1.75±0.03和1.80±0.04,p-PI3K蛋白相对表达水平分别为0.99±0.03,5.51±0.06,5.49±0.07,1.99±0.08和2.01±0.06,p-AKT蛋白相对表达水平分别为1.02±0.02,5.31±0.06,5.29±0.07,1.76±0.06和1.74±0.06。模型组、对照组、实验A组和实验B组的上述指标与假手术组相比,实验A组、实验B组的上述指标与模型组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论miRNA-155可调节低氧诱导的缺血性脑卒中的血管生成,其作用机制可能与PI3K/AKT通路有关。

乙酰半胱氨酸对LPS诱导肺泡上皮细胞氧化应激反应迁移和EMT进程的抑制作用机制研究

目的探讨乙酰半胱氨酸(NAC)对脂多糖(LPS)诱导肺泡上皮细胞A549氧化应激、迁移、上皮间充质转化(EMT)及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝苏氨酸蛋白激酶(AKT)信号通路的调控作用。方法体外培养肺泡上皮细胞A549,分为NC组(不进行干预)、LPS组(10μg·mL^(-1)LPS)、NAC组(10μg·mL^(-1)LPS+1 mmol·L^(-1)NAC)、A组(10μg·mL^(-1)LPS+100 ng·mL^(-1)PI3K/AKT通路激活剂胰岛素样生长因子(IGF)-Ⅰ)、NAC+A组(10μg·mL^(-1)LPS+1 mmol·L^(-1)NAC+100 ng·mL^(-1)IGF-Ⅰ)和NAC+Y组(10μg·mL^(-1)LPS+1 mmol·L^(-1)NAC+5μmol·L^(-1)PI3K/AKT通路抑制剂LY294002),LPS和NAC分别作用24 h。用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定细胞活力,丙二醇(MDA)试剂盒检测MDA表达,超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒检测SOD表达,划痕法检测细胞迁移率,蛋白免疫印迹(WB)法测定PI3K、AKT、磷酸化(p)-PI3K、p-AKT、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)以及波形蛋白(vimentin)的表达。结果根据细胞活力情况选择1 mmol·L^(-1)浓度NAC进行后续实验。与NC组相比,LPS组SOD表达、E-cadherin、p-PI3K和p-AKT蛋白水平降低,MDA表达、细胞迁移率、N-cadherin和vimentin蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);与LPS组相比,NAC组和A组扭转了上述指标的变化,差异有统计学意义(P<0.05);与NAC组相比,NAC+A组中的IGF-I增强了NAC对A549细胞的作用,NAC+Y组中的LY294002削弱了NAC对A549细胞的作用(P<0.05)。结论NAC可抑制LPS诱导的肺泡上皮A549细胞的氧化应激反应和迁移能力,并阻碍其EMT进程,其作用机制可能与PI3K/AKT通路的活化有关。

MiR-21对食管癌细胞增殖、凋亡及PI3K/Akt信号通路的影响

目的探讨miR-21对食管癌细胞增殖和凋亡的影响及其分子机制。方法将食管癌细胞分为5组,命名为对照组、miR-21-NC组、miR-21组、LY294002组、LY294002+miR-21组,采用流式细胞仪检测转染效率,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测Eca-109细胞中miR-21表达情况,分别采用MTT实验和流式细胞仪检测Eca-109细胞增殖和凋亡情况,蛋白免疫印迹(Western blot)检测Eca-109细胞中PI3K、Akt和p-Akt表达情况。结果 miR-21-NC组、miR-21组、和LY294002+miR-21组转染效率均达到85%左右;转染后miR-21组细胞增殖率显著高于对照组、miR-21-NC组(P<0.05);LY294002组Eca-109细胞增殖率显著低于对照组(P<0.05),LY294002+miR-21组Eca-109细胞增殖率显著高于LY294002组(P<0.05);LY294002组Eca-109细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05),LY294002+miR-21组Eca-109细胞凋亡率显著低于LY294002组(P<0.05);LY294002组细胞中PI3K和p-Akt表达水平显著低于对照组(P<0.05),LY294002+miR-21组细胞中PI3K和p-Akt表达水平显著高于LY294002组(P<0.05)。结论 miR-21通过调节PI3K/Akt信号通路促进食管癌细胞增殖、并抑制细胞凋亡,为食管癌的靶向治疗提供一定的理论依据。

PP2C蛋白磷酸酶调控的细胞信号通路研究进展

2C类蛋白磷酸酶是蛋白磷酸酶家族的重要成员,可以对丝/苏氨酸残基特异性脱磷酸。近来研究表明,2C类蛋白磷酸酶控制着大量关键的细胞功能,如增殖、细胞周期阻滞、衰老和细胞程序性死亡、凋亡和自噬等,因而在介导机体免疫反应、衰老、神经发育及肿瘤发生发展中发挥重要的生物学作用。总结PP2C基因各亚型参与介导的重要细胞信号通路,如丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)、转化生长因子-β(TGF-β)/Smads、核转录因子-κB(NF-κB)及DNA损伤应答通路,以期为阐明上述生理病理过程的分子基础和调控机制提供新的思路。

LY294002对套细胞淋巴瘤增殖、凋亡及Notch1信号通路的影响

目的观察磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K/Akt)特异性抑制剂LY294002对人套细胞淋巴瘤Jeko-1细胞株细胞增殖、凋亡及Notch1信号通路的影响。方法四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞增殖抑制率;流式细胞仪检测细胞凋亡变化;Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3、Caspase-9及信号通路相关蛋白pAkt、Notch1、HES1的变化。结果 LY294002能明显抑制Jeko-1细胞的增殖;经0、5、10和20μmol/L的LY294002作用24h后,Jeko-1细胞的凋亡率分别为(3.25±1.27)%、(11.34±2.35)%、(22.81±2.74)%、(43.61±3.48)%,差异有统计学意义(P<0.01);Western blot检测发现凋亡相关蛋白Bcl-2表达下降,Bax、Caspase-3、Caspase-8、Caspase-9表达上升,PI3K/Akt信号通路相关蛋白p-Akt磷酸化水平下降,Notch1信号通路相关蛋白Notch1、HES1表达下降。结论LY294002可以特异性抑制PI3K/Akt信号通路,也可下调Notch1信号通路的活性,抑制Jeko-1细胞增殖,促进细胞凋亡。

KCNE2对胃癌细胞上皮间质转化和PI3K/AKT信号通路的影响

目的探讨钾离子通道蛋白家族成员2(KCNE2)在胃癌细胞增殖、迁移侵袭和上皮间质转化(EMT)中的作用及其对磷脂酰肌醇-3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)信号通路的影响。方法采用GEPIA和UALCAN分析KCNE2在胃癌组织中的表达。收集胃癌肿瘤组织和胃癌细胞系(MKN-1、MKN-28、SGC-7901、MKN-45和MGC-803)用于检测KCNE2表达;采用Kaplan-Meier法和Log-rank检验进行生存分析。将MKN-45和MGC-803细胞分为pcDNA3.1组(阴性对照)和pcDNA3.1-KCNE2组(KCNE2过表达),CCK-8、伤口愈合实验和Transwell小室实验评估细胞的增殖、迁移和侵袭情况,qPCR和Western blot检测波形蛋白、N-钙黏蛋白、E-钙黏蛋白、磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(p-PI3K)和磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶(p-AKT)的表达。结果KCNE2在胃癌组织中表达下调,与胃癌分期、分级和淋巴结转移有关(P<0.05)。与GES-1细胞相比,KCNE2在胃癌细胞中低表达(P<0.05)。与pcDNA3.1组相比,pcDNA3.1-KCNE2组MKN-45和MGC-803细胞的增殖、伤口愈合率、侵袭细胞数和EMT过程均受到抑制(P<0.05)。另外,pcDNA3.1-KCNE2组MKN-45和MGC-803细胞中p-PI3K和p-AKT表达较pcDNA3.1组降低(P<0.05)。结论KCNE2可作为肿瘤抑制因子,下调PI3K/AKT信号通路活性,抑制胃癌EMT过程以及细胞增殖和转移。

API-2靶向抑制PI3K/Akt信号通路干预胃癌细胞生长的研究

目的研究蛋白激酶B抑制剂-2(API-2)靶向抑制PI3K/Akt信号通路中Akt位点,从而对胃癌细胞生长的影响。方法使用API-2处理人胃癌细胞株SGC7901。MTT法检测0,2,4,6,8μmol/LAPI-2作用不同时间对细胞增殖的影响;荧光染料AO/EB染色观察不同浓度API-2作用24h后细胞凋亡情况;流式细胞仪检测细胞周期变化;Western blot法检测p-AKT蛋白以及下游蛋白NF-κB表达情况。结果API-2可抑制SGC7901细胞的增殖,并呈浓度和时间依赖性;不同浓度API-2作用24h后,对细胞的部分周期有明显的影响,也可直接导致肿瘤细胞凋亡、坏死,并且p-AKT蛋白及下游蛋白NF-κB表达均减少。结论API-2有效地抑制PI3K/Akt信号通路中Akt位点,影响SGC7901细胞的周期,减少NF-κB的表达,具有增殖抑制及诱导凋亡作用。

PI3K/Akt信号通路在小鼠胚胎神经发育中的作用及机制

目的探究磷脂酰肌醇-3-激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(phosphatidylinositol-3-kinase/serine-threonine kinase,PI3K/Akt)信号通路对小鼠胚胎神经发育的影响及作用机制,进一步阐明PI3K/Akt信号通路相关胚胎神经发育异常的分子机制。方法实验动物为C57BL/6J小鼠,胚胎第7.5天(embryonic day,E7.5)孕鼠随机分为6组,实验组分别腹腔注射12.5、25、50、75、100 mg/kg的LY294002(PI3K/Akt信号通路抑制剂),对照组注射生理盐水。E13.5解剖,观察小鼠胚胎畸形情况。确定最佳造模剂量后,取该组小鼠胚胎神经及脊柱样本,采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测细胞凋亡及音猬因子(sonic hedgehog,Shh)信号通路关键基因的mRNA表达水平,采用免疫印迹法检测蛋白质表达水平。实验细胞选用小鼠神经干细胞NE-4C细胞系,采用噻唑兰法(methylthiazolyldiphenyl tetrazolium bromide,MTT)检测不同浓度LY294002处理后细胞存活情况;采用原位末端标记(TdT-mediated dUTP nick-end labeling,TUNEL)实验检测细胞凋亡;采用流式细胞术检测细胞周期。统计学方法采用单因素方差分析和Dunnett’s t检验。结果动物实验结果显示,LY294002给药组出现神经管畸形(neural tube defect,NTD)表型;50 mg/kg组的NTD发生率80.7%(46/57),均为脊髓脊膜膨出和脊柱裂,选为最佳造模剂量。RT-qPCR结果显示,与对照组相比,给药无畸形组、脊髓脊膜膨出组及脊柱裂组的细胞凋亡标志物肿瘤抑制基因(tumor suppressor gene P53,P53)和半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3(cysteinyl aspartate-specific proteinase 3,Caspase3)的相对mRNA表达均上升(P<0.01),磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸-3-激酶催化亚基α基因(phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate-3-kinase catalytic subunit alpha,PIK3CA)及Shh信号通路关键基因[平滑蛋白(smoothened,Smo)、神经胶质瘤相关癌基因同源物(glioma-associated oncogene homolog,Gli)1及Gli2]的相对mRNA表达均显著降低(P<0.01)。免疫印迹结果显示,与对照组相比,给药无畸形组、脊髓脊膜膨出组和脊柱裂组的PI3K、Gli2相对蛋白表达均降低(P<0.01);脊髓脊膜膨出组和脊柱裂组的Smo、Gli1相对蛋白表达均降低(P<0.01),但给药无畸形组与对照组比较差异无统计学意义。细胞实验结果显示,LY294002抑制细胞增殖,细胞周期阻滞在G1期,诱导NE-4C细胞凋亡。MTT检测结果显示,随着LY294002浓度的增大,对细胞存活的抑制作用越强。TUNEL染色结果显示,20μmol/L与25μmol/L处理组中阳性细胞数与总细胞数的比例均高于对照组(4.22±0.16、8.56±0.24、1.00±0.14,t值分别为6.225和15.089,P值均<0.001)。流式细胞术检测结果显示,随着LY294002浓度增加(0、20、25μmol/L),G1期细胞占总细胞的百分比显著升高[(53.1±3.1)%、(66.4±2.1)%、(76.3±1.6)%,F=31.627,P<0.001],S期与G2期细胞比例逐渐减少。结论在小鼠胚胎神经发育过程中,抑制PI3K/Akt信号通路导致Shh信号通路传导受到抑制,促进细胞凋亡,影响小鼠胚胎神经管闭合,导致NTD的发生。

异甘草素通过PI3K/Akt通路诱导人胃癌SGC7901细胞凋亡

目的:初步研究异甘草素(isoliquiritigenin ISL)对人胃癌SGC7901细胞凋亡诱导作用的影响,并探讨信号通路中蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(protein kinase B,Akt)、磷酸化Akt(PAkt)及下游凋亡蛋白Bax表达水平的变化.方法:取对数生长期人胃癌SGC7901细胞分为对照组、ISL实验组,培养24、48、72 h后采用MTT实验检测ISL对细胞生长的抑制情况,摸索后续实验药物浓度和作用时间;应用流式细胞仪检测各组细胞凋亡情况;应用Western blot法检测凋亡调节蛋白Bax、Ak和P-Akt的表达.结果:10mmol/L ISL不能抑制胃癌细胞株SGC7901的生长,而25、50、100mm o l/LISL可明显抑制其生长,且呈时间和浓度依赖性.与对照组凋亡率3.23%±0.45%相比,25mmol/L组(6.13%±0.61%)、50mmol/L组(11.70%±0.75%)、100mmol/L组(26.60%±1.51%)凋亡率逐渐增高(P<0.05)随ISL浓度的增加,P-Akt蛋白表达水平逐渐降低,凋亡蛋白Bax表达水平逐渐增加(均P<0.05),各组间A k t蛋白水平差异无统计学意义.结论:ISL能够诱导SGC7901细胞凋亡,其机制可能与下调PI3K/AKT信号转导通路蛋白的表达以及上调其下游的凋亡蛋白Bax有关.

血府逐瘀合剂对PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移及PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路的影响

目的:探究血府逐瘀合剂对血小板衍生生长因子(PDGF)-BB诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移及磷脂酰肌醇3-激酶/丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶/糖元合成酶激酶3β/β-连环蛋白(PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin)信号通路的影响。方法:利用重组鼠PDGF-BB体外刺激大鼠胸大动脉平滑肌细胞A7R5诱导增殖、迁移模型,分为6组:对照组、PDGF-BB组、低剂量血府逐瘀合剂+PDGF-BB组、高剂量血府逐瘀合剂+PDGF-BB组、PI3K激活剂+PDGF-BB组、PI3K激活剂+高剂量血府逐瘀合剂+PDGF-BB组,CCK-8法检测A7R5细胞增殖活力;流式细胞术检测A7R5细胞周期;细胞划痕实验检测A7R5细胞迁移情况;免疫印迹检测A7R5细胞增殖、迁移相关蛋白及PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路相关蛋白。结果:与对照组比较,PDGF-BB组A7R5细胞增殖率、迁移面积、S期比例,PCNA、cyclin D1、MMP9蛋白及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β、胞核β-catenin/总β-catenin蛋白比值显著增加,G0/G1期比例、E-cadherin蛋白显著减少(P<0.05);与PDGF-BB组比较,低、高剂量血府逐瘀合剂+PDGF-BB组A7R5细胞增殖率、迁移面积、S期比例,PCNA、cyclin D1、MMP9蛋白及p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β、胞核β-catenin/总β-catenin蛋白比值显著减少,G0/G1期比例、E-cadherin蛋白显著增加,且高剂量血府逐瘀合剂+PDGF-BB组优于低剂量血府逐瘀合剂+PDGF-BB组(P<0.05);与高剂量血府逐瘀合剂+PDGF-BB组比较,PI3K激活剂+高剂量血府逐瘀合剂+PDGF-BB组A7R5细胞增殖率、迁移面积、S期比例,PCNA、cyclin D1、MMP9蛋白,p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-GSK-3β/GSK-3β、胞核β-catenin/总β-catenin蛋白比值显著增加,G0/G1期比例、E-cadherin蛋白显著减少(P<0.05)。结论:血府逐瘀合剂可抑制PDGF-BB诱导的血管平滑肌细胞增殖、迁移,可能通过抑制PI3K/AKT/GSK-3β/β-catenin信号通路而实现。

山楂有机酸通过PI3K/AKT和MAPK信号通路保护心肌缺血再灌注损伤的缺血后适应作用

目的:探讨山楂有机酸通过缺血后适应保护心肌缺血再灌注(I/R)损伤的作用机制。方法:采用Langendorff离体心脏灌流装置对SD大鼠心脏进行缺血再灌注并记录心脏动力学改变,从再灌注期开始全程在灌流液中给予不同浓度的山楂有机酸。采用三苯四唑氯(TTC)染色评估心肌梗死面积。采用CellTiter 96■溶液细胞增殖法测定心肌细胞存活率;流式细胞仪检测H_(2)O_(2)(过氧化氢)诱导的心肌细胞凋亡;采用试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)释放、细胞内丙二醛(MDA)生成、抗氧化酶[超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)]活力;以试剂盒检测半胱氨酸天冬氨酸酶-3(Caspase-3)和Caspase-9活力;Western blot法检测线粒体凋亡调控蛋白(BAX和BCL-2)、磷酸化丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(p-AKT)、磷酸化细胞外信号调节激酶(p-ERK)、磷酸化c-Jun氨基末端激酶(p-JNK)和磷酸化丝裂原活化蛋白激酶(p-P38)的表达变化。结果:与空白对照组相比,模型对照组的左心室舒张压显著降低,心肌梗死面积显著增加,细胞活力显著下降(P<0.01),LDH释放和细胞内MDA生成显著增加(P<0.01),SOD和GSH-Px的活力显著降低(P<0.01),Caspase-3和Caspase-9的活力显著增加(P<0.01),BAX的表达上调,BCL-2的表达显著下调(P<0.01),AKT和ERK的磷酸化被抑制、P38和JNK的磷酸化被激活(P<0.05或P<0.01);与模型对照组比较,山楂有机酸25、100μg/mL组显著改善了小鼠离体心脏左心室舒张压(P<0.01),降低了心肌I/R损伤引起的梗死面积(P<0.01),明显提高了心肌细胞存活率,降低了过氧化氢致心肌细胞损伤的LDH泄漏和MDA生成、提高了SOD和GSH-Px活力(P<0.05或P<0.01),明显降低过氧化氢诱导的心肌细胞凋亡以及Caspase-3和Caspase-9活力,下调BAX、BCL-2蛋白表达(P<0.05或P<0.01),上调p-AKT和p-ERK蛋白表达(P<0.05),下调p-JNK和p-P38的蛋白表达(P<0.01),PI3K特异性抑制剂LY294002、JNK和P38特异性激动剂Anisomycin以及ERK特异性抑制剂PD98059降低山楂有机酸100μg/mL对过氧化氢引起的细胞存活率升高和Caspase-3活力的降低(P<0.05或P<0.01)。结论:PI3K/AKT和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路可能介导了山楂有机酸通过缺血后适应提高抗氧化酶活力、抑制心肌细胞凋亡,保护心肌I/R损伤的作用。

甘草次酸对甲状腺癌细胞SW579凋亡的影响及其机制

目的:研究甘草次酸对甲状腺癌细胞SW579凋亡的影响及其可能的机制。方法:甲状腺癌细胞SW579分成4组,每组设置5个复孔,对照组为含10%胎牛血清的DMEM培养基;低浓度甘草次酸组为含浓度50μmol/L+10%胎牛血清的DMEM培养基;中浓度甘草次酸组为含浓度100μmol/L+10%胎牛血清的DMEM培养基;高浓度甘草次酸组为含浓度200μmol/L+10%胎牛血清的DMEM培养基;各组在5%的二氧化碳培养箱中孵育24 h和48 h后,通过Annexin V/PI双标记流式细胞术检测甲状腺癌细胞SW579的凋亡比例,蛋白质印迹法检测检PI3K、AKT1、p-AKT蛋白的表达。结果:与对照组比较,孵育24 h及48 h后,50μmol/L甘草次酸组凋亡细胞比例有所升高,AKT1、p-AKT、PI3K蛋白的相对表达量变化不明显,均无显著性差异(P>0.05);100μmol/L和200μmol/L甘草次酸组的凋亡细胞比例均显著升高,AKT1、p-AKT蛋白的相对表达量均明显降低(P<0.05)。结论:100μmol/L和200μmol/L的甘草次酸可通过抑制AKT蛋白的表达促进甲状腺癌细胞SW579凋亡。