全反式维甲酸联合小剂量阿糖胞苷对急性髓系白血病细胞磷脂酰肌醇3激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶信号通路的作用机制研究

目的:探讨全反式维甲酸(ATRA)联合小剂量阿糖胞苷(Ara-C)对急性髓系白血病细胞磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(AKT)信号通路的作用机制。方法:选取人急性髓系白血病细胞HL-60,分为空白对照组(未经任何处理的HL-60细胞)、Ara-C组(加入0.5μmol/LAra-C)、ATRA组(加入2μmol/LATRA)、ATRA+Ara-C组(加入2μmol/LATRA和0.5μmol/LAra-C),继续培养24、48、72h,采用CCK8检测HL-60细胞活力,AnnexinV双染法检测HL-60细胞凋亡,qRT-PCR检测PI3K、AKT-mRNA表达,Westernblot检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达,并进行细胞形态学观察。结果:空白对照组HL-60细胞活力高于Ara-C+ATRA组、Ara-C组、ATRA组,Ara-C组、ATRA组HL-60细胞活力高于Ara-C+ATRA组(均P<0.05)。Ara-C+ATRA组HL-60细胞凋亡率高于Ara-C组、ATRA组,Ara-C组、ATRA组HL-60细胞凋亡率高于空白对照组(均P<0.05)。HL-60细胞胞体多呈圆形,可见瘤状突起,胞核多为类圆形,Ara-C组、ATRA组染色质凝聚,颜色变深,部分胞核变小,Ara-C+ATRA组染色质凝聚,颜色变深,可见核固缩、核碎裂。空白对照组HL-60细胞PI3K、AKTmRNA表达高于Ara-C组、ATRA组,Ara-C组、ATRA组HL-60细胞PI3K、AKTmRNA表达高于Ara-C+ATRA组(均P<0.05)。空白对照组HL-60细胞P-PI3K、P-AKT蛋白表达高于Ara-C组、ATRA组,Ara-C组、ATRA组HL-60细胞P-PI3K、P-AKT蛋白表达高于Ara-C+ATRA组(均P<0.05)。结论:Ara-C+ATRA能通过抑制PI3K/AKT信号通路激活,促进HL-60细胞凋亡。

磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白质丝氨酸-苏氨酸激酶信号通路与正畸牙移动的关系

目的探讨磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白质丝氨酸-苏氨酸激酶(AKt)信号通路与正畸牙移动的关系。方法选用24只日本大耳白兔建立正畸牙移动的动物模型,将实验动物上颌右侧戴矫治器,作为实验侧;上颌左侧未戴矫治器,作为对照侧。分别在戴矫治器3、5、7、14 d后各处死6只实验动物。用实时荧光定量聚合酶链反应(RQ-PCR)及Western blot免疫印迹分析方法对PI3K、AKt表达的变化进行检测。结果 RQ-PCR结果显示:加力3 d后,牙周组织中PI3K、AKt mRNA表达增强;7 d后牙周组织中PI3K、AKt mRNA明显增强,随后缓慢下降,与对照侧相比,其差异有统计学意义(P<0.05)。Western blot免疫印迹分析与RQ-PCR结果一致。结论正畸力作用下兔牙周组织中PI3K、AKt的表达增加。提示PI3K/AKt信号通路与正畸牙移动有关,PI3K/AKt信号通路参与正畸牙移动过程中的牙周组织改建。

Adropin对脂肪细胞自噬及磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶通路的影响

目的探讨Adropin对脂肪细胞自噬及磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)通路的影响。方法将小鼠胚胎成纤维前脂肪细胞3T3-L1诱导分化为成熟脂肪细胞,随机分为对照组、Adropin组、自噬激动剂组、Adropin+自噬激动剂组。对照组细胞不予特殊处理,Adropin组细胞加入Adropin(终浓度为1000 nmol·L^-1),自噬激动剂组加入西罗莫司(终浓度为100 nmol·L^-1),Adropin+自噬激动剂组细胞加入Adropin(终浓度为1000 nmol·L^-1)和西罗莫司(终浓度为100 nmol·L^-1),继续培养2 h;采用单丹磺酰尸胺染色检测各组细胞中自噬空泡情况,细胞免疫荧光染色法检测各组细胞微管相关蛋白轻链3(LC3)表达,采用Western blot法检测各组细胞自噬相关蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ、p62及PI3K/AKT通路蛋白PI3K、磷酸化PI3K(p-PI3K)、AKT、磷酸化AKT(p-AKT)的表达。结果与对照组比较,Adropin组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)。与对照组比较,自噬激动剂组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著升高(P<0.05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)。Adropin+自噬激动剂组与对照组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1、p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。与Adropin组比较,自噬激动剂组、Adropin+自噬激动剂组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著升高(P<0.05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著降低(P<0.05)。与自噬激动剂组比较,Adropin+自噬激动剂组细胞中自噬空泡相对含量、LC3阳性细胞比例及LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白相对表达量显著降低(P<0.05),p62、p-PI3K、p-AKT蛋白相对表达量显著升高(P<0.05)。4组细胞中PI3K、AKT蛋白相对表达量两两比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论Adropin可抑制脂肪细胞自噬,其机制可能是通过激活PI3K/AKT通路而实现。

在肿瘤细胞模型中联合应用磷脂酰肌醇3激酶/蛋白酶B通路抑制剂BEZ235和细胞外调解蛋白激酶/丝裂原活化蛋白激酶通路抑制剂U0126的效果

目的探讨通过联合应用磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白酶B(AKT)通路抑制剂BEZ235和细胞外调解蛋白激酶(ERK)通路抑制剂U0126抑制膜受体酪氨酸激酶/PI3K/AKT/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)通路与ERK/丝裂原活化蛋白激酶通路对细胞增殖的影响。方法以磷酸酶和张力蛋白同源物缺失(PTEN-/-)的小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)系作为研究对象,联合应用PI3K、mTOR双重抑制剂BEZ235及ERK激酶抑制剂U0126,通过MTT和Western blot方法检测药物对细胞增殖的影响。结果 BEZ235及U0126对PTEN-/-MEF细胞均有抑制作用,二者半数抑制浓度分别为6.257 nmol/L及22.85μmol/L。但联合应用BEZ235与U0126,二者表现为拮抗的作用方式。结论在PTEN缺失的细胞系中或PTEN突变的肿瘤的联合靶向治疗中,不推荐应用BEZ235与U0126联合使用。

阿伐他汀通过磷脂酰肌醇3-激酶／丝氨酸苏氨酸蛋白激酶／哺乳动物雷帕霉素靶蛋白途径调节HL-60白血病细胞凋亡的作用

目的观察阿伐他汀对白血病细胞HL-60增殖和凋亡的影响，探讨磷脂酰肌醇3-激酶／丝氨酸苏氨酸蛋白激酶／哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（PI3K／AKT／mTOR）信号途径在此过程中的作用。方法取对数生长期细胞，分为阴性对照组和实验组（阿伐他汀干预水平分别为1、5、10μmol/L），培养12、24、48h，采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测白血病细胞的增殖能力；培养48h后，流式细胞术检测白血病细胞凋亡变化，反转录-聚合酶链反应（RT—PCR）和Western blot方法检测PI3K、AKT和mTOR基因表达的变化。结果阿伐他汀对白血病细胞HL-60有明显抑制增殖和促凋亡作用。10μmoL／L阿伐他汀对HL—60细胞干预48h后对细胞增殖的抑制作用最强，抑制率达到（39．77±3．01）％，与阴性对照组相比，差异有统计学意义（t=4．016，P〈0．01），同时对细胞凋亡的诱导作用最强，凋亡率达到（43．29±3．91）％，与阴性对照组相比，差异有统计学意义（t=3．625，P〈0．05）。此外，PI3K、AKT和mTOR在白血病细胞HL-60均有基础表达，10μmol/L阿伐他汀对HL-600细胞干预48h后，PI3K、AKT和mTOR基因mRNA表达水平下调最为明显，分别下降了（37．05±4．11）％、（53．79±3．27）％、（40．63±2．42）％，与阴性对照组比较差异均有统计学意义（t=4．805、3．799、4．312，P均〈0．05），同时对PI3K、AKT和mTOR蛋白表达水平下调最为明显，分别下降了（41．09±3．17）％、（45．67±2．92）％和（63．41±3．59）％，与阴性对照组比较差异均有统计学意义（t=3．576、4．727、4．902，P均〈0．05）。结论阿伐他汀可能通过PI3K／AKT／mTOR信号通路抑制白血病细胞增殖并诱导细胞凋亡。

微RNA-181靶向磷酸酶张力蛋白基因调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶信号通路在高尿酸血症大鼠肾损伤中的作用

目的探讨微RNA(miRNA)-181靶向磷酸酶张力蛋白基因(PTEN)调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(PI3K/Akt)信号通路在高尿酸血症大鼠肾损伤中的作用。方法选择雄性Wistar大鼠40只,随机分为对照组10只、模型组10只、阴性对照组10只和miRNA-181抑制组10只,检测大鼠血清尿酸、肌酐、尿素氮;采用苏木精-伊红(HE)染色,光镜下观察各组大鼠肾脏组织病理形态学改变;实时荧光定量(qRT)-PCR检测各组大鼠肾组织miRNA-181和PTEN、PI3K、Akt mRNA表达水平;蛋白质印迹法检测各组大鼠肾组织PTEN、PI3K、Akt、磷酸化(p)-Akt蛋白表达水平;双荧光素酶报告基因实验验证miRNA-181与PTEN的靶向关系。多组间比较采用单因素方差分析,方差齐,进一步组间两两比较采用LSD-t检验;若方差不齐,进一步组间两两比较采用Tamhane′s T2检验;2组间比较采用独立样本t检验。结果与对照组尿酸(135±21)mmol/L、肌酐(27.8±2.1)μmol/L、尿素氮(6.8±0.5)μmol/L相比,模型组和阴性对照组大鼠尿酸[(213±28)mmol/L,(214±23)mmol/L;肌酐(49.2±2.3)μmol/L,(48.6±2.2)μmol/L;尿素氮(11.5±2.7)μmol/L,(11.7±2.5)μmol/L]含量显著升高(F尿酸=26.739,F肌酐=259.055,F尿素氮=12.921,均P<0.05);与阴性对照组相比,miRNA-181抑制组大鼠尿酸(169±21)mmol/L、肌酐(33.7±1.8)μmol/L、尿素氮(9.1±1.7)μmol/L含量降低(LSD-t尿酸=4.356,LSD-t肌酐=15.773,LSD-t尿素氮=2.858,均P<0.05)。模型组和阴性对照组大鼠肾组织miRNA-181表达水平(1.88±0.16、1.84±0.18)显著高于对照组(0.53±0.08)(F=193.554,P<0.05),而PTEN蛋白(0.18±0.02、0.16±0.02)和mRNA表达水平(0.48±0.08、0.44±0.07)均低于对照组(1.27±0.06、1.27±0.16)(F蛋白表达水平=515.116,FmRNA表达水平=141.470,均P<0.05);抑制miRNA-181后,大鼠肾组织肾组织miRNA-181表达水平(1.35±0.58)显著降低(LSD-t=10.341,P<0.05),PTEN蛋白(0.84±0.05)和mRNA表达水平(0.90±0.08)均升高(LSD-t蛋白表达水平=20.471,Tamhane′s T2 mRNA表达水平=13.881,均P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验分析结果显示,PTEN是miRNA-181的靶基因。与对照组(0.18±0.02、0.09±0.01、0.05±0.02、1.06±0.07、0.96±0.06)相比,模型组和阴性对照组大鼠肾组织PI3K(1.01±0.06、1.00±0.06)、Akt(0.90±0.05、0.95±0.04)、p-Akt蛋白表达水平(0.99±0.07、0.97±0.05)和PI3K(3.63±0.18、3.68±0.22)、Akt mRNA表达水平(2.38±0.05、2.34±0.12)均显著升高(FPI3K蛋白表达水平=169.979,FAkt蛋白表达水平=393.411,Fp-Akt蛋白表达水平=164.201,FPI3K mRNA表达水平=563.944,FAkt mRNA表达水平=141.470,均P<0.05);抑制miRNA-181表达后,大鼠肾组织PI3K(0.69±0.06)、Akt(0.42±0.03)、p-Akt蛋白表达水平(0.50±0.05)和PI3K(2.40±0.09)、Akt mRNA表达水平(1.40±0.12)均降低(LSD-tPI3K蛋白表达水平=7.432,LSD-tAkt蛋白表达水平=18.291,LSD-tp-Akt蛋白表达水平=9.595,Tamhane′s T2PI3K mRNA表达水平=17.070,Tamhane′s T2Akt mRNA表达水平=17.357,均P<0.05)。结论抑制miRNA-181表达,可靶向PTEN抑制PI3K/Akt信号通路保护高尿酸血症大鼠肾损伤。

胰岛素信号通路磷脂酰肌醇-3激酶／丝氨酸苏氨酸蛋白激酶对海马神经元β-淀粉样前体蛋白裂解酶1表达的影响

目的通过胰岛素和磷脂酰肌醇-3激酶（P13K）抑制剂渥曼青霉素（wortmannin，WORT）对P13K／丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（P13K／Akt）信号通路的激活和抑制作用，观察P13K／Akt信号通路对海马神经元β-淀粉样前体蛋白裂解酶1（BACEI）表达的影响。方法40只sD大鼠随机分为空白对照组、假手术组、胰岛素组和WORT组（每组10只），海马立体定向注射胰岛素和PDK抑制剂WORT。免疫组织化学和Westernblot法检测P13K／Akt信号传导相关蛋白以及BACEI的表达水平。结果注射胰岛素的海马P13K信号通路下游信号分子较对照组：Akt表达增加（0．952±O．060与0．835±0．029，t=4．9150，P=0．0001），Aktser473位点磷酸化（pAkt）水平上调（0．800±O．075与0．657±0．025，t：4．5598，P=0．0002），糖原合成激酶-3α（GSK-3α）磷酸化水平降低（0．604±0．062与0．726±0．041，t=3．5871，P=0．0018），而成熟的BACEl及其裂解产物p分泌酶C末端（母-CTF）表达下调。WORT组的P13K下游信号分子Akt、pAkt表达明显被抑制，磷酸化GSK-3仪表达增加，同时成熟的BACE1（1．004±0．096）和β-CTF（1．031±0．048）的表达较对照组（分别0．498±O．064，0．786±O．101）上调（分别t=11．5980，P=0．0000；t=4．2194，P=0．0004）。结论胰岛素信号通路P13K／Akt可以调节BACE1的表达和活性并参与阿尔茨海默病的发病机制。

微小RNA-153靶向磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶通路调控急性淋巴细胞白血病细胞增殖

目的 探讨微小RNA(miRNA,miR)-153靶向调控磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(Akt)通路对人急性淋巴细胞白血病(ALL)细胞Jurkat的影响。方法 miR-153模拟物(miR-153模拟物组)、miR-153抑制物(miR-153抑制物组)转染Jurkat细胞后,观察细胞增殖、周期和凋亡,检测miR-153、PI3K和Akt mRNA及蛋白表达,并验证PI3K是否为miR-153的靶基因。结果 与阴性对照组比较,miR-153模拟物组miR-153表达显著升高约10倍(t=39.596,P<0.01),miR-153抑制物组miR-153表达明显降低(t=14.651,P<0.01)。miR-153模拟物组细胞活性显著下降(t=10.931,P<0.01),miR-153抑制物组细胞活性明显升高(t=7.640,P<0.01)。miR-153模拟物组中PI3K总蛋白、PI3K mRNA及p-Akt表达明显下降(t=7.161,P<0.01;t=6.684,P<0.01;t=10.769,P<0.01),而miR-153抑制物组PI3K总蛋白、PI3K mRNA及p-Akt表达显著升高(t=3.998,P<0.05;t=8.902,P<0.01;t=7.078,P<0.01)。miR-153模拟物组G0/G1期细胞比例明显增多,而S期和G2/M期细胞显著下降(t=3.786,P<0.05;t=3.012,P<0.05;t=4.948,P<0.01);miR-153抑制物组G0/G1期细胞显著下降,S期和G2/M期细胞所占比例明显增加(t=5.356,P<0.01;t=3.055,P<0.05;t=3.893,P<0.05)。miR-153模拟物组细胞凋亡率明显增加(t=4.673,P<0.05),而miR-153抑制物组凋亡率显著下降(t=5.618,P<0.01)。与空载质粒组比较,3’端非编码区(3’UTR)质粒组相对荧光素酶活性显著降低(t=7.925,P<0.01)。结论 miR-153能够直接靶向PI3K/Akt信号通路,调控Jurkat细胞增殖和凋亡。

磷脂酰肌醇3-激酶-丝氨酸苏氨酸蛋白激酶Akt信号通路与脑缺血再灌注损伤

缺血性脑卒中具有发病率、复发率、致残率及病死率高的特点。脑缺血再灌注损伤的防治一直是神经病学领域的重点，有关其相关机制的研究是当今亟待解决的问题，而缺血半暗带的神经细胞凋亡更是研究的热点。脑缺血再灌注后既启动了凋亡信号通路，也激活了抗凋亡信号通路，两者的动态平衡决定了细胞损伤的最终转归。

microRNA—155通过磷脂酰肌醇3激酶/丝—苏氨酸蛋白激酶信号通路调节低氧诱导的缺血性脑卒中的血管生成研究

目的研究微小RNA155(miRNA-155)通过磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝-苏氨酸蛋白激酶(AKT)信号通路调节低氧诱导的缺血性脑卒中的血管生成作用机制。方法用线栓法建立永久性局灶脑缺血大鼠模型,并在实施造模手术前48 h给予CoCl2构成持续低氧环境。将造模后的大鼠随机分为模型组、对照组、实验A组和实验B组,每组15只;另取15只健康大鼠给予只穿线不结扎处置作为假手术组。模型组和假手术组术后均不给予任何处理;对照组造模手术后5 min给予单侧脑室注射10 mg·kg^(-1)慢病毒载体miRNA-155-siRNA-NC110μL;实验A组造模手术后5 min给予单侧脑室注射10 mg·kg^(-1)慢病毒载体miRNA-155-siRNA 10μL;实验B组造模手术后5 min给予单侧脑室注射10 mg·kg^(-1) LY29400210μL。5组大鼠均每周给药1次,每组均干预28 d。用免疫组化法检测大鼠的脑组织微血管密度(MVD),用蛋白质印迹法检测大鼠脑组织中血管内皮生长因子(VEGF)、磷酸化磷脂酞肌醇3-激酶(p-PI3K)和磷酸化丝-苏氨酸蛋白激酶(p-AKT)蛋白的表达水平。结果假手术组、模型组、对照组、实验A组和实验B组大鼠的MVD分别为(7.53±1.46),(22.00±1.69),(21.73±1.94),(43.60±2.61)和(43.60±3.74)个,VEGF蛋白相对表达水平分别为1.00±0.03,1.35±0.04,1.33±0.03,1.75±0.03和1.80±0.04,p-PI3K蛋白相对表达水平分别为0.99±0.03,5.51±0.06,5.49±0.07,1.99±0.08和2.01±0.06,p-AKT蛋白相对表达水平分别为1.02±0.02,5.31±0.06,5.29±0.07,1.76±0.06和1.74±0.06。模型组、对照组、实验A组和实验B组的上述指标与假手术组相比,实验A组、实验B组的上述指标与模型组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论miRNA-155可调节低氧诱导的缺血性脑卒中的血管生成,其作用机制可能与PI3K/AKT通路有关。

七氟醚后处理减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤及对线粒体融合蛋白2表达和PI3K-Akt通路的影响

目的探讨七氟醚后处理对大鼠心肌缺血再灌注损伤(MIRI)的保护作用以及其对线粒体融合蛋白2(Mfn-2)的表达和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3K-Akt)通路的影响。方法将30只SD大鼠随机分为5组:S组、MIRI组、SP组、SP+W组、W组,每组6只。麻醉固定大鼠暴露心脏,除外S组,其余4组均结扎左前降支3 0 min,复灌1 2 0 min,SP组在复灌前1 0 min吸入2.3%七氟醚15 min,SP+W组在吸入前股静脉注射稀释的渥曼青霉素1 mL,W组则只在复灌前静注渥曼青霉素。结束后检测指标:ELISA法测cT n-I,蛋白免疫印迹法检测总Akt、P-Akt、Mfn-2的表达,电镜下观察心肌细胞形态学变化。结果各组总Akt接近,差异无统计学意义(P>0.05)。与S组相比较,其他各组cT n-I含量、P-Akt表达上调,差异有统计学意义;与SP组比较,MIRI组、SP+W组、W组cT n-I表达上调,P-Akt表达下调,差异均有统计学意义(P<0.05);MIRI组、SP+W组、W组组间cT n-I、P-Akt表达接近,差异无统计学意义。与S组相比较,其他各组Mfn-2表达上调,差异有统计学意义(P<0.05);SP组与SP+W组Mfn-2表达差异无统计学意义(P>0.05),MIRI组与W组Mfn-2表达差异无统计学意义(P>0.05);与SP组、SP+W组比较,MIRI组与W组Mfn-2表达上调,差异有统计学意义(P<0.05)。电镜下显示S组无受损迹象,SP组明显较MIRI组、SP+W组、W组损伤减轻。结论七氟醚后处理通过下调Mfn-2表达进而激活PI3K-Akt通路减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤。

PP2C蛋白磷酸酶调控的细胞信号通路研究进展

2C类蛋白磷酸酶是蛋白磷酸酶家族的重要成员,可以对丝/苏氨酸残基特异性脱磷酸。近来研究表明,2C类蛋白磷酸酶控制着大量关键的细胞功能,如增殖、细胞周期阻滞、衰老和细胞程序性死亡、凋亡和自噬等,因而在介导机体免疫反应、衰老、神经发育及肿瘤发生发展中发挥重要的生物学作用。总结PP2C基因各亚型参与介导的重要细胞信号通路,如丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶/丝苏氨酸蛋白激酶(PI3K/AKT)、转化生长因子-β(TGF-β)/Smads、核转录因子-κB(NF-κB)及DNA损伤应答通路,以期为阐明上述生理病理过程的分子基础和调控机制提供新的思路。

乙酰半胱氨酸对LPS诱导肺泡上皮细胞氧化应激反应迁移和EMT进程的抑制作用机制研究

目的探讨乙酰半胱氨酸(NAC)对脂多糖(LPS)诱导肺泡上皮细胞A549氧化应激、迁移、上皮间充质转化(EMT)及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝苏氨酸蛋白激酶(AKT)信号通路的调控作用。方法体外培养肺泡上皮细胞A549,分为NC组(不进行干预)、LPS组(10μg·mL^(-1)LPS)、NAC组(10μg·mL^(-1)LPS+1 mmol·L^(-1)NAC)、A组(10μg·mL^(-1)LPS+100 ng·mL^(-1)PI3K/AKT通路激活剂胰岛素样生长因子(IGF)-Ⅰ)、NAC+A组(10μg·mL^(-1)LPS+1 mmol·L^(-1)NAC+100 ng·mL^(-1)IGF-Ⅰ)和NAC+Y组(10μg·mL^(-1)LPS+1 mmol·L^(-1)NAC+5μmol·L^(-1)PI3K/AKT通路抑制剂LY294002),LPS和NAC分别作用24 h。用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)测定细胞活力,丙二醇(MDA)试剂盒检测MDA表达,超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒检测SOD表达,划痕法检测细胞迁移率,蛋白免疫印迹(WB)法测定PI3K、AKT、磷酸化(p)-PI3K、p-AKT、E-钙粘蛋白(E-cadherin)、N-钙粘蛋白(N-cadherin)以及波形蛋白(vimentin)的表达。结果根据细胞活力情况选择1 mmol·L^(-1)浓度NAC进行后续实验。与NC组相比,LPS组SOD表达、E-cadherin、p-PI3K和p-AKT蛋白水平降低,MDA表达、细胞迁移率、N-cadherin和vimentin蛋白表达升高,差异有统计学意义(P<0.05);与LPS组相比,NAC组和A组扭转了上述指标的变化,差异有统计学意义(P<0.05);与NAC组相比,NAC+A组中的IGF-I增强了NAC对A549细胞的作用,NAC+Y组中的LY294002削弱了NAC对A549细胞的作用(P<0.05)。结论NAC可抑制LPS诱导的肺泡上皮A549细胞的氧化应激反应和迁移能力,并阻碍其EMT进程,其作用机制可能与PI3K/AKT通路的活化有关。

二氮嗪后处理对大鼠缺血再灌注心肌损伤和糖原合成酶激酶-3β表达的影响

目的探讨激活磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/蛋白质丝氨酸苏氨酸激酶(Akt)信号通路对二氮嗪后处理大鼠缺血再灌注(I/R)心肌保护作用的影响及其机制。方法60只雄性Sprague-Dawley大鼠随机分入假手术组、I/R组、二氮嗪后处理组(予二氮嗪7mg/kg)、渥曼青霉素组(予渥曼青霉素15μg/kg)和二氮嗪+渥曼青霉素组(复合组)。结扎左冠状动脉前降支30min、再开放120min建立心肌I/R损伤模型。再灌注末,采用比色法检测血浆乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)表达水平,应用电子显微镜观察心肌超微结构变化,采用比色法测定心肌组织内半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶-3(Caspase-3)活性,Western免疫印迹试验检测糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)和磷酸化GSK-3β(p-GSK-3β)的表达水平。结果I/R组、二氮嗪后处理组、渥曼青霉素组、复合组的LDH、CK表达水平,心肌组织内Caspase-3的活性值均显著高于假手术组(P值均<0.01);二氮嗪后处理组和复合组均显著低于I/R组(P值均<0.01);复合组均显著高于二氮嗪后处理组(P值均<0.05);I/R组与渥曼青霉素组间的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。二氮嗪后处理组和复合组的p-GSK-3β表达水平显著高于假手术组和I/R组(P值均<0.01),复合组显著低于二氮嗪后处理组(P<0.01),假手术组、I/R组和渥曼青霉素组间的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。结论二氮嗪后处理通过激活PI3K/Akt信号通路减轻大鼠心肌I/R损伤的机制与p-GSK-3β的表达增加有关。

API-2靶向抑制PI3K/Akt信号通路干预胃癌细胞生长的研究

目的研究蛋白激酶B抑制剂-2(API-2)靶向抑制PI3K/Akt信号通路中Akt位点,从而对胃癌细胞生长的影响。方法使用API-2处理人胃癌细胞株SGC7901。MTT法检测0,2,4,6,8μmol/LAPI-2作用不同时间对细胞增殖的影响;荧光染料AO/EB染色观察不同浓度API-2作用24h后细胞凋亡情况;流式细胞仪检测细胞周期变化;Western blot法检测p-AKT蛋白以及下游蛋白NF-κB表达情况。结果API-2可抑制SGC7901细胞的增殖,并呈浓度和时间依赖性;不同浓度API-2作用24h后,对细胞的部分周期有明显的影响,也可直接导致肿瘤细胞凋亡、坏死,并且p-AKT蛋白及下游蛋白NF-κB表达均减少。结论API-2有效地抑制PI3K/Akt信号通路中Akt位点,影响SGC7901细胞的周期,减少NF-κB的表达,具有增殖抑制及诱导凋亡作用。

益气通络方通过PI3K/Akt/HIF-1α通路减轻脑缺血再灌注损伤的氧化应激及凋亡的机制研究

目的探讨益气通络方通过磷脂酰肌醇-3激酶/丝氨酸—苏氨酸蛋白激酶/低氧诱导因子-1α(phosphoinositide 3-kinase/serine threo-nine kinase/hypoxia inducible factor-1α,PI3K/Akt/HIF-1α)信号通路对脑缺血/再灌注大鼠的神经保护作用。方法40只大鼠随机分为假手术组、模型组、益气组、尼莫益气组,每组10只,采用大脑中动脉栓塞再灌注法进行造模,连续灌胃相应药物14天,采用Zea-longa评分法检测大鼠神经肌肉功能,病理染色观察脑组织形态。ELISA检测乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)含量和细胞内超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活力及活性氧(reactive oxygen species,ROS)分布水平,血清肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、超敏C反应蛋白(hypersensitive C-reactive protein,hs-CRP)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的含量。Western blot法检测脑组织PI3K、p-Akt、HIF-1α、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2-associated X protein,Bax)蛋白表达。结果与假手术组比较,模型组大鼠脑组织明显损伤,血清中TNF-α、IL-6、hs-CRP、LDH、ROS含量升高,SOD含量降低,脑组织中Bax表达水平升高,PI3K、p-Akt、HIF-1α、Bcl-2表达水平降低(P<0.05);与模型组比较,益气组及尼莫益气组大鼠脑组织损伤程度较轻,血清中TNF-α、IL-6、hs-CRP、LDH、ROS含量降低,SOD、VEGF含量升高,脑组织中Bax表达水平降低,PI3K、p-Akt、HIF-1α、Bcl-2表达水平升高(P<0.05)。结论益气通络方能够抑制大鼠神经细胞凋亡、降低炎症损伤,其机制可能与激活PI3K/Akt、上调HIF-1α信号通路及Bax/Bcl-2比率有关。

内皮素1受体拮抗剂通过调控PI3K-Akt-HIF-1α信号通路减轻兔单肺通气时肺损伤的研究

目的 探讨调控磷脂酰肌醇3-激酶-丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶-缺氧诱导因子1α(phosphatidylinositol 3-kinase-serine threonine protein kinase-hypoxia inducible factor 1 alpha,PI3K-Akt-HIF-1α)信号通路对减轻内皮素1受体拮抗剂BQ-123预处理的兔单肺通气(one-lung ventilation,OLV)时肺损伤的作用。方法 20只健康日本大耳白兔,雌雄不限,随机分为对照组、OLV组、OLV+BQ-123组和OLV+BQ-123+LY294002组,每组5只。对照组兔持续双肺通气2.5 h,OLV组、OLV+BQ-123组及OLV+BQ-123+LY294002组先行右侧OLV 2 h,再恢复双肺通气0.5 h。OLV+BQ-123组和OLV+BQ-123+LY294002组兔在OLV前10 min经股静脉注射BQ-123 50μg/kg,OLV+BQ-123+LY294002组在给予BQ-123前静脉输注磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)的特异性抑制剂(LY294002) 0.3 mg/kg,输注时间为5 min。实验结束后留取左侧肺组织,称重计算湿/干比(wet-to-dry,W/D),行病理学切片并评估肺损伤程度;采用Western blot测定PI3K-Akt-HIF-1α信号通路关键因子磷酸化丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶(phosphorylated serine-threonine protein kinase,p-Akt)及缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factor 1 alpha,HIF-1α)蛋白表达。结果 与对照组比较,OLV组兔肺水肿状态、W/D、肺损伤病理评分增加,p-Akt和HIF-1α蛋白相对表达量下调(P均<0.05);BQ-123预处理干预后,OLV+BQ-123组兔肺损伤程度、W/D下降、p-Akt和HIF-1α蛋白相对表达量上调(P均<0.05),且较OLV+BQ-123+LY294002组兔肺损伤程度、W/D降低、p-Akt和HIF-1α蛋白相对表达量上调(P均<0.05)。结论 内皮素1受体拮抗剂BQ-123通过调控PI3K-Akt-HIF-1α信号通路可减轻兔OLV时非通气侧的肺损伤。

川芎嗪对感染性休克大鼠脑组织PI3K/AKT信号通路及热休克蛋白70的影响

目的探讨川芎嗪对感染性休克大鼠脑组织磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/丝氨酸-苏氨酸激酶(AKT)信号通路及热休克蛋白70(HSP70)的影响。方法将60只SD大鼠随机分为假手术组(sham组)、感染性休克组(LPS组)、川芎嗪低剂量组(LPS+Lig-L组)和川芎嗪高剂量组(LPS+Lig-H组),通过尾静脉注射川芎嗪建立感染性休克大鼠模型。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组大鼠血清S-100β和神经元特异性烯醇化酶(NSE)含量;苏木精-伊红(HE)染色检测各组大鼠脑组织病理损伤情况;ELISA检测各组大鼠脑组织超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6(IL-6)含量;脱氧核苷酸转移酶标准记法(TUNEL)检测各组大鼠脑组织细胞凋亡情况;免疫印迹法(Western Blotting)检测各组大鼠脑组织PI3K/AKT信号通路相关蛋白和HSP70表达情况。结果川芎嗪可减少大鼠血清S-100β和NSE表达,脑组织海马区细胞排列较整齐,边界较LPS组清晰,有完整的细胞带。与LPS组比较,川芎嗪可增加大鼠脑组织SOD表达(P<0.05或P<0.01),降低MDA、NO、TNF-α、IL-1β和IL-6表达(P<0.05或P<0.01)。川芎嗪可降低脑组织TUNEL阳性细胞数量,脑组织PI3K蛋白表达水平上调,AKT蛋白磷酸化程度增加,HSP70蛋白表达水平上调。结论川芎嗪对感染性休克有明显的治疗作用,可能与激活PI3K/AKT信号通路,抑制氧化应激、炎症和凋亡,提高HSP70蛋白表达有关。

亮氨酸对增龄小鼠腓肠肌蛋白质合成的影响

目的:观察膳食补充亮氨酸对增龄小鼠骨骼肌蛋白质合成的影响并初步探讨其可能性机制。方法:13月龄雄性ICR小鼠据体重随机分为补充亮氨酸、补充丙氨酸以及空白对照组,补充亮氨酸和补充丙氨酸组分别在饲料中给予亮氨酸(5%)和丙氨酸(3.4%)添加8周,空白对照组则进食普通维持饲料。末次给食后禁食17 h并处死小鼠,用血糖仪检测血糖;ELISA检测血清胰岛素;HE染色观察腓肠白肌肌纤维适应性变化;Western blotting检测PI3K III(m VPS34)与MHCⅡ蛋白表达及m TOR、p70S6K、4E-BP1磷酸化率。结果:添加亮氨酸并未显著影响小鼠体重与采食量,且未致胰岛素与血糖水平变化不显著。腓肠白肌湿重、湿重/体重比值、肌纤维横截面积与直径表现出增大的趋势,但变化并不显著。但肌肉蛋白总量、m VPS34与MHCⅡ的蛋白表达及m TOR、p70S6K、4E-BP1磷酸化率均显著增加。结论:5%比例亮氨酸具有促进骨骼肌蛋白质合成并减缓老年前期小鼠肌肉的萎缩的潜力,其机制可能涉及肌细胞内PI3K III(m VPS34)/m TOR/p70S6K信号通路的活化。

基于PI3K/Akt/mTOR 通路探究七氟醚麻醉对大鼠神经细胞凋亡的影响

目的探讨七氟醚麻醉对大鼠认知功能及神经细胞凋亡的影响。方法取96只大鼠,随机分为对照组(吸入2 L·min^(−1)氧气)、七氟醚低浓度组(吸入体积分数为1%的七氟醚+2 L·min^(−1)氧气)、七氟醚中浓度组(吸入体积分数为2%的七氟醚+2 L·min^(−1)氧气)、七氟醚高浓度组(吸入体积分数为4%的七氟醚+2 L·min^(−1)氧气),持续吸入6 h。用Morris水迷宫实验观察各组大鼠认知能力,用HE染色观察海马组织学形态,用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)测定海马组织中枢神经特异性蛋白(soluble protein 100β,S-100β)、神经元特异性烯醇化酶(neuron-specific enolase,NSE)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)水平,流式细胞术测定神经细胞凋亡情况,蛋白印迹法(Western blotting)测定海马组织B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bcl2-associated X protein,Bax)、磷酸化磷脂酰肌醇3-激酶(phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinase,p-PI3K)、磷酸化丝氨酸/苏氨酸激酶(phosphorylated serine/threonine kinase,p-Akt)和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)的水平。结果HE染色结果表明,对照组海马组织神经细胞结构正常,排列紧密,七氟醚各浓度组大鼠海马组织神经细胞减少,排列紊乱,分布不均匀。与对照组比较,七氟醚各浓度组大鼠逃避潜伏期时间,S100-β、NSE、IL-1β、TNF-α水平,Bax蛋白水平和神经细胞凋亡率均升高,穿越平台次数,平台停留时间,Bcl-2、p-PI3K、p-Akt和p-mTOR蛋白水平均降低(P<0.05);七氟醚各浓度组诸项指数水平变化规律相同,并呈剂量依赖性(P<0.05)。结论七氟醚麻醉可诱导大鼠神经细胞凋亡,使大鼠认知能力衰退,其可能与调控PI3K/Akt/mTOR信号通路有关。