黏质沙雷氏菌磷脂酶A_(1)辅助蛋白PlaS对宿主菌细胞膜的影响及亚细胞定位

为证明黏质沙雷氏菌磷脂酶A_(1)辅助蛋白PlaS在大肠杆菌BL21(DE3)异源表达中对细胞膜有明显的破坏作用,探究了细胞膜特性的变化,并采用气相色谱-质谱联用技术鉴定了其对细胞膜脂肪酸的影响,通过激光共聚焦显微镜验证了亚细胞水平定位。结果显示:PlaS异源表达后,宿主菌内外膜通透性明显提高、细胞膜流动性与表面疏水性严重下降,表明细胞膜功能已经丧失;脂肪酸饱和程度下降,即直链饱和脂肪酸和反式单不饱和脂肪酸相对含量降低,以及顺式单不饱和脂肪酸相对含量增加、膜刚性增强、流动性减少,细胞膜组分与结构表现异常导致细胞易死亡。激光共聚焦显微镜显示,在宿主细胞膜上发现明显荧光。综上所述,PlaS属于膜蛋白,在大肠杆菌异源表达中会破坏宿主菌细胞膜的结构与功能,表现生长抑制现象,这将为进一步PlaS抑制机理的研究与其功能开发提供一定支持。

磷脂酶A1辅助蛋白N端截短菌株的构建及其优化表达

根据GenBank公布的磷脂酶A1辅助蛋白plaS基因序列,通过生物信息学软件分析,截短辅助蛋白PlaS的N端35AA。将截短后的辅助蛋白plaS基因经PCR扩增技术与原核表达载体pET-28a(+)连接,再转化到BL21(DE3)宿主菌中进行融合表达,从而成功构建dSP28表达菌株。用异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactoside,IPTG)诱导辅助蛋白表达,对诱导时间、IPTG浓度、起始菌体浓度(OD_(600nm))和温度逐项进行优化,摸索得到辅助蛋白的最佳诱导表达条件为诱导时间8 h,IPTG浓度0.2 mmol/L,起始体浓度(OD_(600nm))0.7,温度40℃,转速200 r/min。在此条件下,对P28、SP28和dSP28发酵中OD_(600nm)进行测定,结果表明,加入IPTG诱导后P28和dSP28能够快速的增殖,且诱导8 h后仍显示增长趋势,而SP28的生长受到明显的抑制作用。

黏质沙雷菌磷脂酶A1辅助蛋白S对表达宿主菌大肠杆菌抑制作用机制

黏质沙雷菌plaS基因编码的磷脂酶A1辅助蛋白S(phospholipase A1 accessory protein S,PlaS)能够显著提高磷脂酶A1在大肠杆菌中的表达活性,但对宿主菌的生长具有抑制作用,且抑制机制尚无相关研究报道。本实验通过对PlaS进行生物信息学分析并对其N端截短系列表达菌株的生长特性进行研究以确定其抑制作用关键区域,并通过扫描电子显微镜观察和流式细胞仪检测来初步探究PlaS对表达宿主菌的抑制机理。结果表明,在PlaS N端分别截短前23、24、25、26、27个氨基酸构建的表达菌株中,dS_(23)P_(28)、dS_(24)P_(28)、dS_(25)P_(28)、dS_(26)P_(28)菌株仍表现出不同程度的生长抑制现象,而dS_(27)P_(28)菌株没有出现生长抑制现象,初步表明PlaS N端的前27个氨基酸为抑制关键区域。扫描电子显微镜和流式细胞仪结果显示,PlaS的表达对大肠杆菌的细胞膜有严重的破坏作用,而N端截短前27个氨基酸的PlaS表达后对大肠杆菌细胞膜的损伤作用消失,这一结果也与生长特性结果一致。本实验结果可为深入研究黏质沙雷菌PlaS功能提供理论参考。

辅助蛋白基因的剪接对磷脂酶A1酶活的影响

为探究磷脂酶A1辅助蛋白(phospholipase A1 accessory protein,PlaS)对磷脂酶A1(phospholipase A1,PlaA1)酶活关键调控区域,根据PlaS的结构特点,设计出截短突变体,利用聚合酶链式反应技术将PlaA1与PlaS共表达基因plaB中编码辅助蛋白的基因plaS进行了剪接,并对各截短菌株进行酶活检测和酶学性质分析。结果表明:PlaS属于锚蛋白(ankyrin,ANK)家族,主要由N端域、ANK结构域、C端域三部分组成,其中ANK结构域包含4个典型的ANK重复序列(ANK repeat)。从构建的5株截短菌株中筛选出了2株胞外酶活相对较高的菌株AN-3与AN-4,与未截短菌株BP28相比,比酶活分别提高了73%和78%,催化效率(K_(cat)/K_(m))分别提高了216%和211%,而最适温度(45℃)和最适pH值(6.0)没有发生变化。K_(cat)/K_(m)的结果显示,在所有的截短菌株中AN菌株的催化效率最低。plaS剪接结果表明,PlaS的ANK结构域至少需要3个ANK repeat才会对PlaA1酶活表现为胞外促进作用,PlaS的C端域对维持PlaA1的结构稳定性起到重要的作用,研究为揭示PlaS对PlaA1的调控机制提供了理论基础。

成人特发性膜性肾病肾组织M型磷脂酶A2受体1抗原的检测

目的检测在成人特发性膜性肾病患者肾组织中M型磷脂酶A2受体1(PLA2R1)抗原的阳性率及其与特发性膜性肾病关系。方法选取经肾活检证实的108例肾小球疾病患者,其中包括41例特发性膜性肾病、2例乙型肝炎病毒相关性膜性肾病、8例V型狼疮肾炎、27例Ig A肾病、19例微小病变性肾病、5例轻度系膜增生性肾小球肾炎和6例局灶节段性肾小球硬化。应用间接免疫荧光法检测患者肾组织中PLA2R1抗原。结果 41例特发性膜性肾病患者中35例肾组织PLA2R1抗原阳性,阳性率为85.37%。其中PLA2R1沿着肾小球毛细血管襻呈细颗粒状沉积。在V型狼疮性肾炎、乙型肝炎病毒相关性膜性肾病及其他肾小球疾病肾组织中均未发现PLA2R1抗原沉积。特发性膜性肾病PLA2R1阳性患者与PLA2R1阴性患者相比较,年龄、血肌酐、血清白蛋白、24 h尿蛋白定量均无统计学差异(P>0.05)。结论在成人特发性膜性肾病患者肾组织中应用间接免疫荧光法证实PLA2R1抗原的阳性率为85.37%,PLA2R1阳性与阴性患者在临床表现上无统计学差异。

氧化低密度脂蛋白促进脂蛋白相关磷脂酶A2在单核细胞中的表达

目的：研究氧化低密度脂蛋白（oxLDL）对脂蛋白相关磷脂酶A2（Lp-PLA2）表达调控的影响和Lp-PLA2介导的oxLDL促动脉粥样硬化作用。结果：实验采用培养的人单核细胞系THP-1细胞为模型，观察oxLDL和低密度脂蛋白（LDL）对Lp—PLA2在THP-1细胞表达的影响。应用Lp—PLA2抑制剂SB435495研究了Lp-PLA2介导的oxLDL对炎症因子表达、细胞黏附及细胞毒性的影响。结果显示，OxLDL能够明显上调THP．1细胞中Lp-PLA2mRNA表达水平，以及Lp—PLA2蛋白的表达，而LDL却无此作用。OxLDL的这一作用是通过其所含的氧化磷脂（oxPCs）介导的，而OxLDL水解后的产物溶血卵磷脂（1ysoPCs）没有此作用。OxLDL／oxPCs能够激活p38MAPK及PPA聊通路。而p38MAPK的抑制剂SB203580及SB202190均能够阻断oxLDL对Lp-PLA2表达的影响。PPAR7的拮抗剂GW9662能够减弱，但不能完全抑制oxLDL促进Lp-PLA2表达的作用。另外，Lp-PLA2抑制剂SB435495不能够阻止LDL的氧化，但能抑制LDL在氧化过程中lysoPCs的生成。抑制Lp—PLA2的活性能够减弱oxLDL的促炎症因子表达、促细胞黏附及细胞毒性作用，表明Lp—PLA2通过水解oxLDL生成lysoPCs产生致炎作用。结论：OxLDL／oxPCs能够促进Lp-PLA2在单核细胞中的表达，该作用是通过p38MAPK介导的。PPAIⅥ部分参与了OxLDL／oxPCs的这一作用。另外，抑制Lp-PLA2的活性能够减弱oxLDL的促炎症因子表达、促细胞黏附及细胞毒性作用，说明Lp-PLA2具有促动脉粥样硬化的作用。

黏质沙雷氏菌plaA及plaS的生物信息学分析

磷脂酶A1是一类水解磷脂的酶类,利用生物信息学方法对磷脂酶A1基因及辅助蛋白基因进行分析,为进一步研究磷脂酶提供基础。通过对黏质沙雷氏菌plaA(Phospholipase A1)及plaS(accessory protein)进行克隆和测序,对其核苷酸序列和氨基酸序列特征进行分析;对其蛋白质二级结构、三级结构进行了预测;同时运用ML、MP和BI 3种方法构建了系统发育树。结果表明,plaS的dN/dS的值较plaA高,所受的选择压力较小,进化速率较快;Pla A蛋白和Pla S蛋白的二级结构都以α螺旋和无规则卷曲为主;plaA与plaS联合构建的系统发育树支持率较16S单独构建的支持率高。基于plaA、plaS和16S 3个基因联合构建的系统发育树中,解脲沙雷氏菌和嗜线虫沙雷氏菌都与黏质沙雷氏菌聚为一支,在亲缘关系上,这两种沙雷氏菌可能跟黏质沙雷氏菌更为接近。

人Ⅰ型磷脂酶A_2的N末端衍生多肽PLA_2N_(1-15)的杀菌活性研究

目的：观察人I型磷脂酶A2（PLA2）的N末端衍生多肽PLA2N1-15对不同细菌的体外杀菌活性。方法：以人I型PLA2N末端的15个氨基酸残基为模板，合成多肽PLA2N1-15.采用琼脂铺板计数法，记录并计算不同质量浓度（1000、250、62．5、15．625μg／ml）的PLA2N1-15对革兰阳性（G^＋）菌（金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、枯草芽孢杆菌）和革兰阴性（G^-）菌（大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌）的杀菌率。结果：15．625、62．5、250、1000gg／ml的PLA2N1-15对G^＋菌的杀菌率分别为10％～19％、36．55％～89．73％、83％～100％、96％～100％，对G^-菌的杀菌率分别为8．86％～22．63％、21．61％～40．55％、40％～83％、87％～93％。结论：高浓度PLA2N1-15对G^＋和G^-均具有较强的杀菌活性，特别是对G^＋。

IgG亚型、PLA2R及血清抗体检测在特发性膜性肾病诊断中的意义

目的研究特发性膜性肾病(IMN)患者肾组织IgG亚型、PLA2R及血清抗体表达,并评估PLA2R及抗体在IMN诊断中的价值。方法选取经肾活检证实的65例IMN患者,同时选取乙型肝炎相关膜性肾病(HBV-MN)、肿瘤相关膜性肾病等继发性膜性肾病28例及其他肾病25例(IgAN、微小病变肾病等)作为对照。本实验我们采用免疫组化荧光染色观察肾组织PLA2R及IgG亚型的表达,ELISA法检测血清抗PLA2R抗体,并将其与患者肾功能做相关分析。结果IgG4在IMN患者肾组织表达最多;肾组织PLA2R在IMN组、继发性膜性肾病组及其他肾病组阳性比例分别为76.92%、10.7%、4.0%,其诊断IMN的敏感度为76.9%,特异性为92.5%;血清抗PLA2R在IMN组、继发性膜性肾病组及其他肾病阳性比例分别为70.7%、7.1%、4.0%,其诊断IMN的敏感度为70.7%,特异性为94.3%;肾组织PLA2R及血清抗PLA2R抗体阳性比例在IMN患者的表达显著高于其他肾病,差异有统计学意义(P<0.05);且血清抗PLA2R抗体与血清ALB成负相关(r=-0.500)、与24 h尿蛋白成正相关(r=0.617)。结论肾组织IgG4、PLA2R及其血清抗PLA2R抗体可能作为特发性膜性肾病患者诊断标志物,用于IMN的诊断及病情的评估。

腰痛灵栓初步药效学研究

目的观察腰痛灵栓抗炎、镇痛作用及其作用机理。方法建立大鼠化学神经根炎模型模拟腰椎间盘突出症,观察腰痛灵栓对炎症、痛阈、步态和血清中磷脂酶A2(PLA2)、白介素1(IL1)含量的影响;用小鼠耳廓二甲苯致炎法观察其抗炎作用;用小鼠热刺激法(热板法)和小鼠化学刺激法(扭体法)观察其镇痛作用。结果腰痛灵栓剂对大鼠神经根炎模型有显著的抑制作用,对其步态和痛阈有明显恢复作用,能降低血清中PLA2和IL1的含量。腰痛灵栓还能够抑制二甲苯所致的小鼠耳肿胀,对热刺激、化学刺激引起的小鼠疼痛有显著抑制作用。结论腰痛灵栓具有明显的抗炎、镇痛作用。