磷脂酶Cβ1过表达对葡萄糖刺激胰岛素分泌的影响

目的观察过表达磷脂酶Cβ1(phospholipase Cβ1,PLCβ1)对葡萄糖刺激胰岛素分泌(glucose-stimulated insulin secretion,GSIS)的影响。方法设定葡萄糖浓度梯度:10、20、40、80、100mmol/L,分别刺激INS-1细胞40min,检测细胞培养上清液中胰岛素含量,确定最适的葡萄糖刺激浓度;设定时间梯度:20、40、60、80、120min,以最适葡萄糖浓度刺激,检测胰岛素含量,确定最适的刺激时间。②以最适葡萄糖浓度刺激INS-1细胞适当时间后,RT-PCR检测PLCβ1表达变化。③构建PLCβ1真核表达载体(PCMV-HA-PLCβ1),转染INS-1细胞,Western blot检测INS-1细胞中PLCβ1蛋白的表达。④收集转染后INS-1细胞培养上清液,检测胰岛素含量。结果用40mmol/L葡萄糖刺激60min,INS-1细胞的胰岛素分泌量最大;RT-PCR观察刺激后PLCβ1表达显著升高;过表达PLCβ1的INS-1细胞培养上清液中胰岛素含量为(1.906±0.080)ng/ml,较转染PCMV-HA载体的对照组(0.740±0.091)ng/ml显著升高(P<0.01)。结论过表达PLCβ1显著增加INS-1细胞的胰岛素分泌,提示PLCβ1可能参与GSIS信息传递。

PDZ支架蛋白PDZK1通过PDZ1与PDZ3结构域与磷脂酶Cβ2羧基末端PDZ结合模块相互作用（英文）

磷脂酶Cβ(PLCβ)在G蛋白偶联受体(GPCR)介导的细胞信号转导中发挥重要作用.通过水解磷脂酰肌醇4,5二磷酸(PIP2),磷脂酶Cβ可以产生3种重要的第二信使分子:二乙酰甘油(DAG)、三磷酸肌醇(IP3)和质子.在果蝇中,磷脂酶Cβ通过它的羧基末端盘状同源区域结合模块(PBM)与盘状同源区域(PDZ)支架蛋白—失活无后电位D蛋白(INAD)相互作用,从而调节果蝇的光信号传导.在哺乳动物中,磷脂酶Cβ家族有4个亚型,每1个亚型的羧基末端都有1个典型的盘状同源区域结合模块.这一结构特点提示我们,磷脂酶Cβ可能通过其羧基末端的盘状同源区域结合模块与盘状同源区域支架蛋白相互作用,进而调节它们自身的细胞定位和功能.然而,目前仍对哺乳动物磷脂酶Cβ家族的盘状同源区域结合蛋白知之甚少.本文运用分析型凝胶过滤和等温滴定量热技术,系统地研究了不同磷脂酶Cβ亚型的羧基末端盘状同源区域结合模块与不同盘状同源区域蛋白质的结合.结果表明,磷脂酶Cβ2的羧基末端盘状同源区域结合模块,可以特异地与含有4个盘状同源区域的支架蛋白—盘状同源区域蛋白1(PDZK1)以2∶1的方式相互结合.进一步的测定显示,磷脂酶Cβ2羧基末端盘状同源区域结合模块在盘状同源区域蛋白1上的结合位点为第1和第3个盘状同源区域,而它们与磷脂酶Cβ2的解离常数分别为11.8±3.4μmol/L和33.3±8.7μmol/L.

磷脂酶Cβ1上调表达与肝细胞肝癌增殖和预后相关

目的探讨磷脂酶Cβ1(PLCβ1)表达是否与肝细胞肝癌(HCC)患者临床病例参数及预后相关。方法采用组织芯片(TMA)技术和免疫组织化学法检测141例HCC患者肿瘤及癌旁组织PLCβ1表达,分析PLCβ1表达与临床病理特征相关性;集落形成与细胞凋亡实验检测PLCβ1对HCC细胞增殖的影响;Kaplan-Meier法和Cox回归模型多因素分析HCC预后。结果 PLCβ1在肿瘤组织中表达明显高于癌旁组织,并与肿瘤分期密切相关。Kaplan-Meier生存分析表明PLCβ1高表达HCC患者生存率低于低表达患者。Cox多因素分析结果显示PLCβ1高表达是HCC患者预后的独立影响因素。PLCβ1在HCC细胞中过表达,促进HCC细胞增殖并抑制其凋亡。进一步研究发现,细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路激活可能参与PLCβ1介导的HCC细胞生长。结论 PLCβ1促进HCC进展,可作为HCC预后的独立影响因素,有望成为理想的治疗靶点。

大麦非特异性磷脂酶C基因家族全基因组鉴定及苗期胁迫表达分析

【目的】非特异性磷脂酶C(non-specific phospholipase C,NPC)是磷脂酶C的一种,在植物生长发育和响应非生物胁迫等方面发挥重要作用。在大麦全基因组范围内鉴定NPC基因家族成员,分析相关基因表达特点,为大麦NPC基因功能研究及遗传改良提供理论依据。【方法】基于EnsemblPlants数据库收录的大麦全基因组数据,利用生物信息学的方法对大麦NPC基因家族进行鉴定,并对大麦NPC基因家族的理化特性、亚细胞定位、系统进化关系、基因结构、蛋白结构域和启动子顺势元件等进行分析。利用转录组数据和实时荧光定量PCR分析HvNPC基因在不同组织以及苗期在低温、干旱、盐胁迫下的表达特征。【结果】在大麦基因组中,共鉴定了5个非特异性磷脂酶C基因家族成员,其编码蛋白与其他植物的NPC基因结构相似,均具有Phosphoesterase结构域;HvNPC蛋白序列长度为477-553 aa,等电点为5.22-8.83,分子量为53.12-61.33 kD;亚细胞定位预测HvNPC基因定位于叶绿体、液泡膜、细胞质中;HvNPC启动子区含有大量与非生物胁迫有关的顺势作用元件。实时荧光定量PCR分析证实HvNPC基因受干旱、高盐及低温胁迫诱导表达,其中HvNPC2、HvNPC3和HvNPC5受低温和干旱胁迫诱导表达;HvNPC3和HvNPC5受盐胁迫诱导表达。【结论】在大麦基因组中共鉴定5个HvNPC基因,HvNPC基因成员具有器官表达特异性,并且不同基因对非生物胁迫响应不同。

基于柔性电极和信号放大技术构建检测磷脂酶C的电化学传感器

磷脂酶C(PLC)是动植物中重要的脂质水解酶,在哺乳动物细胞的代谢、生长、炎症、分化、衰老和凋亡中起着重要作用,与许多癌症的发生、发展显著相关。蛋白质催化原子转移自由基聚合(PATRP)是高分子设计、制备的有效手段,可通过链式反应将数百个电活性单体连接成一个高相对分子质量的聚合物链,从而使分子识别信号大大增强。首先,在柔性碳布(CC)电极表面修饰纳米金(AuNPs),之后通过3-巯基丙酸、碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺,将PLC的特异性底物磷脂酰乙醇胺(PE)固定在电极上,经过PLC对PE的特异性水解产生磷酸基团,引入Zr^(4+),通过Zr^(4+)的配位作用将聚合引发剂α-溴苯乙酸修饰到电极表面,最后在蛋白质催化作用下进行2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)的PATRP聚合反应,在电极表面引入电活性聚合物分子链,构建信号放大型电化学传感器P(TEMPO)/PE/AuNPs/CC,用于磷脂酶C的高灵敏度检测。结果表明,该传感器检测PLC的线性范围为10~1×10^(5)mU/L,检出限为3.568 mU/L(S/N=3)。与其他检测PLC的方法相比,该传感器具有较宽的检测范围和较低的检出限,且在检测实际乳腺癌细胞中的PLC方面有巨大的实际应用潜力。

响应面法优化新型磷脂酶PLC_MED_(193)大豆油脱胶工艺的研究

利用大肠杆菌工程菌制备大量重磷脂PLC_MED_(193),将其应用于大豆毛油的脱胶过程中,在单因素试验的基础上采用响应面试验,得出磷脂酶用于大豆毛油脱胶的最佳工艺条件,即脱胶温度60℃、加酶量300 U/kg、脱胶pH 5.6、加水量3.0 mL、脱胶时间6 h,在此条件下,脱胶后大豆油的磷含量从36.75 mg/kg降低至(5.25±0.03)mg/kg,磷脂酰胆碱PC和磷脂酰乙醇胺PE含量降低至23 mg/g和20 mg/g,满足后续油脂精炼要求。

磷脂酶C在酶法脱胶中的研究进展

磷脂酶C(PLC)是一种作用于甘油磷脂C3位上甘油磷酸酯键的脂类水解酶,水解产物为甘油二酯及有机磷酸酯(磷酸胆碱、磷酸乙醇胺或磷酸肌醇等)。应用PLC进行酶法脱胶因具有显著提高毛油精炼率的优点而得到越来越广泛的关注。主要介绍了PLC酶法脱胶的原理、研究进展及PLC酶法脱胶中存在的问题,以期推动PLC酶法脱胶在我国的研究及应用。

菜籽油磷脂酶C脱胶工艺优化及效果分析

分别研究了柠檬酸添加量、酶加入量、温度、加水量和时间5个单因素对磷脂酶C(PLC)脱胶效果的影响,在单因素基础上,采用响应面试验设计,对主要脱胶工艺参数进行优化,得到最佳条件:柠檬酸添加量5.80m L/kg,加酶量12.60 m L/kg,酶解温度42.20℃,在该条件下验证,菜籽毛油磷含量由693 mg/kg降低至7.85mg/kg。采用棒状薄层色谱-氢火焰离子化检测器(TLC-FID)对毛油与脱胶油中甘油酯含量进行检测,结果表明:脱胶油中甘一酯的含量变化不明显,甘二酯含量从约2.5%增加到约6.5%,而甘三酯的含量从约93%下降到约89%;而同样采用TLC-FID对水化脱胶磷脂与PLC脱胶磷脂中的溶血磷脂进行检测,分析得知,PLC脱胶磷脂中溶血磷脂含量比水化脱胶磷脂中的高出约50%,酶法脱胶的酶解率显著升高。研究结果表明,磷脂酶C脱胶比常规水化脱胶更有效和彻底,可为油脂精炼提供了一定理论参考。

四株高产磷脂酶C新菌株的鉴定和分类

在前面研究高产磷脂酶C(PLC)菌株筛选及其抗血小板功能的基础上 ,对新筛选的四株高产PLC的75 4 1、779、970和 110 7菌株进行了鉴定和分类。通过形态特征、培养特征、生理生化特征以及 16SrRNA序列测定及其同源性分析 ,证实 75 4 1菌株与Bacilluscereus基本一致 ,因此将 75 4 1菌株分类属于蜡状芽孢杆菌 ,命名为蜡状芽孢杆菌深圳株 75 4 1,B cereusshenzhen 75 4 1strain。而 779、970和 110 7三株菌则与Bacillusmycoides基本一致 ,因而将这三株菌分类属于蕈状芽孢杆菌 ,分别命名为蕈状芽孢杆菌深圳株 779,B mycoidesshenzhen 779strain ,蕈状芽孢杆菌深圳株 970 ,B mycoidesshenzhen 970strain ,和蕈状芽孢杆菌深圳株 110 7,B mycoidesshenzhen 110 7strain。这将为进一步利用这些菌株及其PLC打下坚实的基础。

磷脂酶Cε基因在膀胱移行细胞癌中表达及其临床意义

目的探讨磷脂酶Cε(phospholipase Cε,PLCε)基因在膀胱移行细胞癌表达及临床意义。方法采用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测27例膀胱移行细胞癌和12例正常膀胱对照组中PLCε mRNA表达,分析其与膀胱病理学特征的关系。结果PLCε mRNA在膀胱移行细胞癌的表达显著高于正常膀胱组织(P<0.01),PLCε的表达和膀胱移行细胞癌分期有关(P<0.05)而与分级无关(P>0.05)。结论PLCε基因在膀胱移行细胞癌组织中呈高表达,可能是未来检测膀胱移行细胞癌一种新的有价值的肿瘤标志物,同时也可能成为膀胱肿瘤生物学治疗中一个新靶点。

磷脂酶C用于大豆油脱胶的工艺优化

用磷脂酶C对大豆毛油进行实验室模拟脱胶。研究了pH、反应温度、加水量、加酶量、反应时间、搅拌速度对大豆毛油脱胶效果的影响,采用正交试验对脱胶工艺条件进行优化。结果表明,大豆毛油脱胶最佳工艺条件为:加酶量30 mg/kg,反应温度50℃,反应时间1 h,pH 5.0,加水量2%,搅拌速度200 r/min。在此条件下得到的脱胶大豆油磷含量为17.8 mg/kg,为大豆油酶法脱胶开辟了新途径。

杨树磷酸肌醇特异性磷脂酶C基因家族鉴定与分析

为了对已测序杨树Populus trichocarpa Torr.＆Gray中磷酸肌醇特异性磷脂酶C（phosphoinositidespecific phospholipase C,PI-PLC）家族基因进行系统分析,利用杨树基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定杨树PI-PLC家族基因的基因结构、染色体定位和编码蛋白,通过蛋白序列比对进行进化和分类分析。结果表明,杨树中含有7个PI-PLC家族基因,含有8-10个外显子,分布于杨树的4条染色体上。MEME和Pfam保守结构域分析显示,杨树PI-PLC蛋白均含有4个保守的EF、X、Y和C2结构域。蛋白质进化树分析结果表明PI-PLC可分为2个亚家族。

磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C对内毒素血症大鼠肝组织CD14表达的抑制作用

目的观察磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C(PI-PLC)对大鼠内毒素血症时肝组织中Kuffer细胞(KCs)的活性、CD14mRNA的表达和血浆细胞因子释放的作用。方法将Wistar大鼠90只,随机分为LPS组(静注LPS5mg/kg)、PI-PLC组(注LPS前30min注PI-PLC100U/kg)和生理盐水NS组。分别于注射前及注射后1、3、6和12h取材,每组每时相点6只,测定血浆内毒素(鲎试剂基质偶氮显色法)、LBP及TNF-α(均用ELISA法)和IL-6(放免法)的含量,用RT-PCR检测肝组织中CD14mRNA的表达,并观察其形态学变化。结果LPS组LBP、TNF-αI、L-6的含量和CD14mRNA的表达明显增加,并伴有KCs激活,数量增多,体积增大,吞噬功能增强,肝细胞出现变性和坏死等;而PI-PLC处理组所致的上述变化明显减轻。结论PI-PLC对内毒素所致肝组织内KCs的激活有一定抑制作用。

中国美利奴绵羊磷脂酶C zeta基因真核表达载体的构建及其表达研究

旨在构建PLCζ真核表达载体,初步研究其在体细胞系中的表达特性。本研究用PCR技术扩增出PLCζ基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,鉴定无误后,将构建了重组质粒pEGFP-N1-PLCζ转染293T细胞和绵羊成纤维细胞,在倒置荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察重组质粒在细胞中的表达和分布。经酶切与测序证明,本试验成功的构建了pEGFP-N1-PLCζ真核表达载体,并且成功与绿色荧光蛋白融合表达。本试验实现了pEGFP-N1-PLCζ在绵羊胎儿成纤维细胞中的表达,这将有利于进一步通过核移植来研究其重组蛋白对卵母细胞的激活作用。

5-HT_2受体-磷脂酶C的激活易化大鼠基底外侧杏仁核突触可塑性的研究

为了探讨5-HT2受体激动剂盐酸2,5-二甲氧基-4-碘苯基丙烷(DOI)对杏仁核突触可塑性的调节作用,本研究在杏仁核脑片上记录基底外侧杏仁核(BLA)场电位,应用单串的θ频率波刺激(TBS)诱导突触可塑性,观察DOI对TBS诱导的突触可塑性的影响,及5-HT2受体拮抗剂、磷脂酶C抑制剂能否抑制DOI的作用。结果显示:单串的TBS刺激外囊,在BLA仅诱导约为10min的短时程增强。灌流液中加入100μmol/L DOI 20min,对基础的场电位没有作用。但在DOI存在的情况下,单串的TBS即可诱导长时程增强,强直刺激30min后,增强的场电位斜率仍维持在基础值的(162.5±9.7)%(n=9,P<0.01)。DOI对TBS诱导的突触可塑性的易化作用可被5-HT2A/2C受体拮抗剂ketanserin和PLC抑制剂U73122所抑制。以上结果提示5-HT2A/2C受体的激活可通过磷脂酶C通路易化杏仁核的突触可塑性。

桃磷酸肌醇特异性磷脂酶C基因家族鉴定与分析

为了对桃(Prunus persica var.Lovell)中PI-PLC家族基因进行系统分析,利用桃基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定桃PI-PLC家族基因的基因结构、染色体定位和编码蛋白,通过序列比对进行进化和分类分析。结果表明,桃中含有5个PI-PLC家族基因,预测他们均含有9个外显子,分布于桃的2条染色体上。保守结构域分析结果显示,桃中PI-PLC蛋白均含有4个保守的EF、X、Y和C2结构域。进化树分析结果表明桃PI-PLC家族基因可分为4个亚家族。

大肠杆菌重组表达磷脂酶C的发酵工艺优化

以重组表达铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 41磷脂酶C的大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-plcH为考察菌株,从TB培养基出发,在优化缓冲液、碳源种类和质量浓度的基础上,比较异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、乳糖诱导重组酶表达的效果,并考察甘氨酸对重组酶发酵的影响;最后,在7L发酵罐规模对上述优化工艺进行放大验证。结果表明:重组大肠杆菌最适培养基组成为:蛋白胨12g/L、酵母膏24g/L、甘油5g/L,0.25mol/L Tris-HCl(pH7.2～7.4)缓冲液配制;在此培养基中添加卡那霉素(Kana)的质量浓度至0.15mg/mL,37℃、200r/min培养6h后,添加乳糖至终质量浓度为5g/L,在25℃、150r/min诱导培养20 h,重组磷脂酶C活力可达到(1422.42±37.17)U/mL;7L发酵罐实验中,总酶活力达到(11583.35±70.21)U/mL,比摇瓶条件下提高了7倍左右,其中胞内酶活力最高为(10957.97±58.03)U/mL,胞外酶活力最高为(645.27±13.87)U/mL。

植物磷脂酶C及其参与的信号途径

就植物磷脂酶C(PLC)的结构特征、基因克隆和其在介导植物对外界刺激应答反应的信号转导过程中的作用等研究进展做了介绍。

磷脂酶C水解大豆油磷脂提高油脂精炼率的研究

大豆毛油中磷脂含量约为2%,采用正己烷为溶剂,用磷脂酶C水解大豆毛油中的磷脂,生成甘油二酯,可以减少毛油的炼耗,提高精炼率。磷脂酶C水解大豆毛油中丙酮不溶物(AI)的速度和底物浓度、温度、搅拌速度在一定范围内成正相关;在毛油浓度高时,扩散成为限速步骤;最佳水解条件为:搅拌速度100 r/min,反应温度40℃,毛油浓度75%,酶的加入量0.02%,反应6 h丙酮不溶物的水解率为85.7%,毛油的精炼率提高3.08%。

产气荚膜梭菌磷脂酶C的重组表达及其脱胶应用

将产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)磷脂酶C(Cp-PLC)基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了重组表达,并对重组Cp-PLC表达条件进行了优化。结果表明:当菌体生长至OD600为1.0时,添加8 g/L乳糖在30℃下诱导32 h,得到的重组Cp-PLC的酶活最大,为398.35 U/mL;重组Cp-PLC用于菜籽毛油脱胶的最佳条件为温度57℃、pH 5.0、加酶量600 U/kg、反应时间1.5 h;在最佳条件下,菜籽毛油的磷含量可降至5.66 mg/kg,能够满足物理精炼的要求。