正己醇对机械伤香蕉采后生理特性影响及磷脂酶D的抑制作用

为保持采后香蕉贮藏品质,延长贮藏期限,以桂蕉6号香蕉为实验材料,探究正己醇在常温贮藏条件下对采后香蕉果实品质和耐贮性的影响。挑选果实外观完好及成熟度、大小相近的香蕉果实,随机分成对照组和处理组2组,分别用蒸馏水和0.1%浓度正己醇处理,取出晾干后置于PE保鲜袋中扎口包装,于25℃下贮藏15 d,每3 d取样观察测定香蕉果实的硬度、可溶性固形物(TSS)含量、呼吸强度、病情指数、丙二醛(MDA)含量、膜透性和PLD活性的变化,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析贮藏期间PLDγ和PLDζ表达量的变化。研究结果显示:正己醇处理可显著延缓采后香蕉果实软化的进程(P<0.05),其中,9、12 d延缓效果极显著(P<0.01);在9 d后,正己醇处理极显著抑制TSS含量和病情指数的上升;6 d起,正己醇处理显著抑制呼吸强度,其中,9 d达到呼吸峰值,较对照组极显著降低33.93%;12 d后,与对照组相比,正己醇处理极显著降低MDA含量和膜透性的上升,分别于15 d降低了26.70%和62.20%。此外,正己醇处理显著抑制采后香蕉果实PLD活性,尤其是6~12 d,抑制效果极显著(P<0.01);在15 d,正己醇处理后香蕉PLDγ和PLDζ表达量较对照组分别极显著降低72.06%和33.08%。综合分析可知,正己醇处理可有效延缓采后香蕉果实软化,抑制果实呼吸强度和PLD活性,减轻采后果实病害发生,从而抑制TSS、MDA的产生和膜透性的增大,并下调PLDγ和PLDζ表达,进而维持采后果实贮藏品质和延长贮藏期限。因此,正己醇可作为一种水果保鲜剂,不仅对维持采后果实品质及香蕉产业的发展具有重要意义,且在采后贮藏期间具有良好的应用前景。

磁性磷脂酶D交联酶聚集体的制备及其酶学性质

以磁性Fe3O4为载体,采用吸附-聚集-交联的方法固定来源于Streptomyces chromofuscus的磷脂酶D(scPLD),制备了磁性磷脂酶D交联酶聚集体(MCLEA)。该方法制备的MCLEA酶活回收率可达72.89%,酶活为(437.00±6.60)U/g。与游离酶相比,MCLEA在不同温度和pH下的稳定性都得到了一定程度的提升,但由于与底物的亲和力降低,需要更高浓度的磷脂酰胆碱(PC)和Ca^(2+)作为反应底物与MCLEA结合。乙醇、四氢呋喃、叔丁醇、乙酸乙酯、乙醚和甲苯对MCLEA的酶促反应具有促进作用,MCLEA在进行连续13次酶促反应后,酶活仍可保留在76%以上,其半衰期为331.67min,该固定化方案可以提高酶的稳定性,从而提高其在催化反应过程中的重复利用性。

高产磷脂酶D的蜡样芽孢杆菌诱变筛选及发酵条件优化

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种天然的磷脂酶D(PLD)生产菌株,为了提高PLD产量,以野生型蜡样芽孢杆菌(B.cereus CICC 20551)为出发菌,使用紫外线和硫酸二乙酯对其进行复合诱变,通过建立的PLD活性高效筛选方法,从大量突变样本中筛选得到一株高产PLD的蜡样芽孢杆菌S6-UD46。将该菌株摇瓶发酵48 h,产酶量达到0.52 U/mL,相比原始菌株(0.32 U/mL)提高了62.5%。对诱导产酶条件与培养基成分进行了优化,确定最佳发酵条件为:以20 g/L牛肉膏为氮源,10 g/L蔗糖为碳源,在600 nm波长下的光密度(OD600)达到4左右时加入40 g/L卵磷脂(磷脂酰胆碱含量>90%)对突变菌株S6-UD46进行诱导产酶,在37℃、200 r/min下培养48 h,PLD酶活性可达3.22 U/mL,是优化前的6.19倍。

磷脂酶D的大肠杆菌表达系统及其转酰基催化活性

链霉菌(Streptomyces)来源的磷脂酶D(phospholipase D,PLD)在食品、保健品、医药等行业的应用潜力巨大。目前用大肠杆菌异源表达PLD的方法较常见,但其具有发酵周期长、分离纯化步骤烦琐、培养成本高等缺点。为此,对比研究了大肠杆菌胞内表达、分泌表达和表面展示3种方式对PLD酶活及其磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)催化合成效率的影响。采用单因素法获得PLD表达的最佳诱导条件为温度20℃、OD600=0.7、IPTG浓度0.3 mmol·L^(-1)。发酵时间曲线表明,在诱导表达8 h时,3种方式的PLD水解酶活均达最高值,分别为0.35,0.23,0.11 U·mL^(-1)。扫描电镜结果表明,大肠杆菌表达PLD后,其细胞结构有一定程度破坏,其中分泌表达菌株的变形塌陷情况最为严重。在水-乙酸乙酯两相体系中,以表面展示菌株全细胞催化磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)方式制备PS的产率最高,可达59.1%,显示了大肠杆菌表面展示表达PLD具有大大降低生物催化转化成本的巨大潜力。

重组人磷脂酶D2在体内能明显抑制慢性哮喘豚鼠血清中GPI-PLD的表达(英文)

通过建立慢性豚鼠哮喘模型,研究重组人磷脂酶D2(rhPLD2)干预慢性哮喘豚鼠血清中糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI-PLD)含量的变化,探寻可能的机制.以rhPLD2干预慢性哮喘豚鼠,用TX-114分相法检测豚鼠血清中GPI-PLD酶活性.与正常状态豚鼠相比较,慢性哮喘状态豚鼠其血清中GPI-PLD酶活性显著升高.但以rhPLD2及地塞米松干预慢性哮喘豚鼠后,该指标显著下降.rhPLD2可通过抑制其血清中GPI-PLD酶活性表达,来抑制哮喘发生过程中的炎症反应.

植物磷脂酶D基因表达与衰老的关系

磷脂酶D(PLD)是一种重要的磷脂水解酶,在植物细胞中普遍存在。磷脂酶D能激活许多重要的细胞生理功能,包括调控细胞膜的重建、跨膜信号传导及细胞内调控、细胞骨架组装、防御反应以及种子萌发和植物的衰老等。对磷脂酶D的基本特性、磷脂酶D基因特异性表达模式及其活性抑制与植物衰老的关系进行了综述,并探讨和展望了今后植物磷脂酶D基因的研究方向。

桃果实磷脂酶Dα基因的电子克隆及序列分析

【目的】克隆桃果实中的磷脂酶Dα基因,并对其进行序列分析和低温表达模式分析。【方法】采用电子克隆与RT-PCR相结合的方法分离桃果实PLDα基因cDNA全长序列;半定量RT-PCR和Northern杂交检测目的基因在桃果实低温贮藏过程中的表达情况。【结果】成功获得全长为2859bp的桃果实PLDα基因序列,该序列具有完整的开放阅读框架(ORF,172～2604bp),编码810个氨基酸。对ORF进行的RT-PCR验证结果与电子克隆序列一致。序列分析显示,桃果实PLDα基因编码的氨基酸序列与草莓、番茄、葡萄等物种的磷脂酶Dα氨基酸序列之间具有高度的保守性,含有N端C2结构域及两个保守的活性中心。半定量RT-PCR和Northern杂交分析显示,桃PLDα基因在低温贮藏过程中被诱导表达。【结论】本研究首次通过电子克隆的方法获得了桃果实PLDα基因的全长序列,揭示了其序列特征,并初步明确了其在桃低温贮藏期间的表达模式。结果证明基于EST数据库的电子克隆已经是获取植物新基因的有效途径,同时为更深入研究桃果实的耐冷性及低温贮藏方法奠定了基础。

反义磷脂酶Dγ基因与几丁质酶基因转化美洲黑杨G2

建立美洲黑杨G2组培再生体系,确立美洲黑杨G2分化最适宜培养基和生根培养基。然后分别进行卡那霉素和潮霉素敏感性试验,利用叶盘法依次将反义磷脂酶Dγ(Anti_PLDγ)基因和几丁质酶(CH5B)基因转入美洲黑杨G2中。首先转入反义磷脂酶Dγ基因,经诱导不定芽及生根阶段卡那霉素(选择性抗生素)连续筛选,获得了21株卡那霉素抗性植株。抗性植株经PCR及PCR_Southern杂交检测,有13株均呈阳性,证明Anti_PLDγ基因成功整合到美洲黑杨G2基因组中。耐盐性试验表明,4株转基因植株抗NaCl能力比对照都有不同程度提高。选择4号株系继续转入几丁质酶基因,通过潮霉素(选择性抗生素)筛选不定芽及诱导生根获6株潮霉素抗性植株,经PCR及PCR_Southern杂交检测,6株均呈阳性,证明CH5B基因成功整合到美洲黑杨G2基因组中。由于CH5B基因与报告基因GUS处于同一开放阅读框(ORF)内,因此通过GUS基因的组织化学染色分析,证明了6株转化植株几丁质酶基因均获得正常表达。

磷脂酶Dα在拟南芥低温驯化过程中的作用途径分析

本研究对低温驯化和未经低温驯化的磷脂酶α基因敲除突变体与野生型拟南芥植株进行冻害胁迫处理后,通过观测植株表型和膜离子渗漏率的变化,鉴定两种基因型植株的抗冻性。结果发现,低温驯化后,PLDα敲除突变体的抗冻性明显低于野生型,表明PLDα参与植物的低温驯化过程。对其作用途径进行分析发现,PLDα不参与低温驯化过程中ABA信号转导作用,也没有参与SOD、CAT和POD等3种抗氧化酶活性的调节,但是参与低温驯化过程中膜稳定性调节和渗透调节过程。

沙丁胺醇与色甘酸钠对大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒过程中磷脂酶D活性的影响

采用主动致敏的大鼠腹腔肥大细胞 (RPMC)为实验材料 ,细胞脱颗粒以 β 氨基己糖苷酶释放率为指标 ,细胞磷脂酶D(PLD)活性采用酶联化学发光法检测 .结果发现 ,卵白蛋白 (4mg·L- 1)攻击主动致敏的RPMC 12 0s后 ,细胞PLD活性与β 氨基己糖苷酶释放率均明显增加 ,分别为对照组的 2倍及 8倍以上 .1%正丁醇 ,10mmol·L- 12 ,3 二磷酸甘油酸能显著抑制PLD活性 ,且使PLD活性及细胞 β 氨基己糖苷酶释放率均降低到对照水平 .Wortmannin ,30 0nmol·L- 1能显著抑制PLD活性 ,并减少细胞 β 氨基己糖苷酶释放 .1,10 μmol·L- 1的沙丁胺醇与色甘酸钠均能部分抑制PLD活性 ,并减少细胞 β 氨基己糖苷酶的释放 .结果表明 ,PLD在主动致敏的RPMC脱颗粒过程中起一定作用 ;沙丁胺醇 (1,10 μmol·L- 1) ,色甘酸钠 (1,10 μmol·L- 1)抑制主动致敏的RPMC脱颗粒的作用机理与抑制PLD有关 .

高山离子芥磷脂酶D活性测定及酶动力学分析

高山离子芥(Chorispora bungean)是一种高抗逆的多年生高山草本植物,具有特殊的分子及生理抗逆响应机制。磷脂水解酶磷脂酶D(PLD)是重要的跨膜信号转导酶。以高山离子芥愈伤组织为试材,利用酶联免疫分光光度计法,优化磷脂酶D活性测定体系,建立了在25℃反应温度条件下,200弘L反应体系中,膜蛋白的含量35μg、反应时间30 min、pH为7.0的缓冲液系统最适合高山离子芥愈伤组织磷脂酶D活性测定体系,分析表明不同膜结合态磷脂酶D的酶动力学特征存在差异,为进一步探讨磷脂酶D在高山离子芥响应逆境胁迫中的作用奠定基础。

链霉菌磷脂酶D的分离纯化及部分酶学性质

由链霉菌发酵所得的磷脂酶D经过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子色谱、Source 30S阳离子色谱和Superdex 75凝胶过滤色谱分离纯化,相对分子质量约为57k。在55℃和pH 7.0时显示最高相对酶活力。酶动力学参数K_m和V_(max)分别为254mmol/L和0.417μmol/min。

植物中的磷脂酶D

介绍了植物磷脂酶D(PLD)的生化性质、克隆、基因组结构、氨基酸序列结构、活性调控、信号转导和细胞生理功能的研究进展。

磷脂酶Dδ参与植物的低温驯化过程

对经低温驯化和未经低温驯化的磷脂酶Dδ(PLDδ)基因敲除突变体与野生型植株进行冻害胁迫处理后,比较2种基因型植株的抗冻性。结果发现,经低温驯化的PLDδ敲除突变体的抗冻性明显低于野生型,而未经低温驯化的PLDδ敲除突变体与野生型的抗冻性没有显著差异,表明PLDδ参与植物的低温驯化过程。对PLDδ的作用途径进行分析,发现PLDδ在低温驯化过程中不参与抗氧化酶活性的调节,对脯氨酸和可溶性糖的积累起负调节作用,但是参与低温信号转导物质ABA诱导抗冻性的过程。

磷脂酶D催化大豆磷脂合成磷脂酰丝氨酸工艺

磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,简称PS)是一种具备独特生理功能的稀有磷脂,自然界中含量稀少,分离提取难度大。利用磷脂酶D(PLD)催化大豆磷脂进行磷脂酰基转移反应合成PS具有条件温和、产品收率高等显著优点,受到广泛重视。本文研究采用固定化磷脂酶D催化合成PS的工艺。磷脂酶D催化大豆磷脂合成PS是油-水两相界面反应,通过采用吸附-交联法将PLD固定化于硅藻土载体上,取得了PS收率达57%的结果。采用硅胶柱色谱对粗产品进行分离纯化,PS纯度高达85%。

干旱胁迫下拟南芥磷脂酶Dδ与一氧化氮在种子萌发中的信号关系

以拟南芥野生型(WT)、一氧化氮合酶(NOS)缺失型突变体(noa1)、硝酸还原酶(NR)缺失型突变体(nia1,nia2)及磷脂酶Dδ(PLDδ)缺失型突变体(pldδ)幼苗为材料,研究了0.3 mol·L-1甘露醇模拟干旱胁迫响应过程中PLDδ和一氧化氮(NO)之间的信号转导关系。结果显示:干旱胁迫下NO含量,PLD和NR活性及基因相对表达量显著升高,pldδ和nia2较其他突变体对干旱胁迫更敏感;外源添加NO供体硝普钠(SNP)可以提高干旱胁迫下WT,nia2和pldδ的种子萌发,而外源添加磷脂酸(PA)可以促进WT和pldδ的种子萌发,但不能促进nia2的种子萌发;PA可以促进干旱胁迫下WT和pldδ的NO产生,但不能促进nia2中NO的产生。表明:干旱胁迫下PLDδ/PA位于NO信号的上游,且PLDδ/PA主要通过NR2途径产生的NO促进干旱胁迫下拟南芥的种子萌发。

Dip法获得转反义磷脂酶Dγ(PLDγ)基因拟南芥植株

在含反义PLDγ基因的质粒根癌农杆菌的介导下 ,以生长到初果期的健壮拟南芥植株为转基因材料 ,用Dip法进行转基因实验 ,对影响转化率的浸染条件进行了比较研究。适宜的转化条件是将拟南芥的整个花序浸泡于农杆菌悬浮液中 (含 5 %蔗糖 ,0 .0 4 %吐温 - 80 ) ,每次浸染 10min ,间隔 3天浸染一次 ,共浸染 3次。每次浸染后将植株横放于暗箱中 2 4h ,再置于 2 2～ 2 4℃的光照下正常生长。待种子收获后在含有卡那霉素 70mg L的选择培养基中选择转化植株。PCR及PCR -Southernblot分析检测 ,该方法的转化率每 10 0粒种子可高达 2 %。

Streptomyces septatus磷脂酶D在毕赤酵母中的重组表达及酶学性质分析

以Streptomyces septatus TCCC 21057基因组为模板,扩增得到磷脂酶D(phospholipase D,PLD)基因(pld),经合成获得pld密码子优化基因(pldm),以pPIC9K为表达载体,毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115为宿主菌株,构建获得毕赤酵母重组菌株GS115/pPIC9K-pldm,摇瓶发酵后获得的重组PLD(rPLDM)转酯活力达2.37 U/mL;rPLDM经纯化后进行转酯酶学性质分析,其最适作用温度为60℃,最适作用pH值为6.5;在单水相反应体系中,40℃、pH 6.5、Ca2+浓度10 mmol/L、大豆磷脂酰胆碱和L-丝氨酸物质的量比1∶10、rPLDM添加4.0 U/mL,反应6 h后,磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)的产率可达到33%。本研究通过对rPLDM的重组表达、转酯酶学性质及催化合成PS的研究,为进一步实现酶法合成新资源食品PS奠定了基础。

对映-贝壳杉烷型二萜化合物Leukamenin E对拟南芥愈伤组织磷脂酶D及抗氧化物酶活性的影响

以拟南芥愈伤组织为材料,研究磷脂酶D和抗氧化酶系对具有化感潜能的二萜化合物Leukamenin E的响应机制.结果表明:100μmol/LLeukamenin E处理36 h时线粒体膜结合态PLD活性最高,200μmol/L Leukamenin E处理24 h时微粒体膜结合态PLD活性最高.PLD基因实时荧光定量PCR分析表明该基因的表达受Leukamenin E诱导.随着Leukamenin E作用时间的延长,H2O2浓度逐渐升高,SOD,POD,CAT,APX活性总体呈先升高后降低的趋势.说明Leukamenin E能够影响与膜稳定性密切相关的PLD和抗氧化酶活性,这二者都积极响应了Leukamenin E的胁迫.

磷脂酶D及其催化机制的研究进展

磷脂酶D是一类具有水解作用和磷酰基转移作用的酶,故其在磷脂改性方面发挥重要作用。主要对磷脂酶D及其催化机制研究现状进行介绍,包括磷脂酶D的来源与制备、催化合成磷脂质、磷脂酶D的分子结构、分子催化机制与分子改造。最后对磷脂酶D的发展进行了展望。