磷脂酶Dα1在TuMV激活叶绿素降解相关基因表达中的功能分析

【目的】研究磷脂酶Dα1(phospholipase Dα1)及其产物磷脂酸(phosphatidic acid,PA)在芜菁花叶病毒(turnip mosaic virus,TuMV)促进植物叶绿素降解相关基因表达过程中的作用。【方法】通过UV-2800紫外分光光度计检测TuMV对本氏烟叶绿素含量的影响。利用Real-time qPCR检测TuMV侵染或瞬时表达6K2蛋白对本氏烟叶绿素降解相关基因NbNYE1(Nicotiana benthamiana NON-YELLOWING1)、NbNYE2(Nicotiana benthamiana NON-YELLOWING2)和NbPAO(Nicotiana benthamiana pheide a oxygense)mRNA相对表达水平的影响。敲除NbPLDα1(Nicotiana benthamiana phospholipase D alpha 1)或正丁醇降低磷脂酶D产生的磷脂酸含量,检测对TuMV诱导的NbNYE1、NbNYE2和NbPAO mRNA相对表达水平的影响。体外喷施磷脂酸对NbNYE1、NbNYE2和NbPAO mRNA相对表达水平的影响。【结果】TuMV侵染导致野生型本氏烟叶片叶绿素含量下降48%。TuMV侵染的野生型本氏烟中NbNYE1、NbNYE2和NbPAO表达量分别为健康野生型本氏烟的7.61、15.80和5.19倍。TuMV侵染的NbPLDα1敲除突变体本氏烟中NbNYE1、NbNYE2和NbPAO表达量分别为健康野生型本氏烟的2.35、7.83和1.29倍。正丁醇处理后,TuMV侵染的野生型本氏烟NbNYE1、NbNYE2和NbPAO表达量与健康野生型本氏烟无明显差异。喷施磷脂酸的叶片中NbNYE1、NbNYE2和NbPAO表达量分别为清水处理野生型本氏烟的12.39、3.64和8.26倍。此外,瞬时表达6K2蛋白叶片中NbNYE1、NbNYE2和NbPAO表达量分别为瞬时表达GFP野生型本氏烟的5.64、4.67和3.45倍。【结论】TuMV促进叶绿素降解相关基因表达依赖磷脂酶Dα1及其产物磷脂酸,病毒编码的6K2蛋白是促进叶绿素降解相关基因的关键致病因子。

桃果实磷脂酶Dα基因的电子克隆及序列分析

【目的】克隆桃果实中的磷脂酶Dα基因,并对其进行序列分析和低温表达模式分析。【方法】采用电子克隆与RT-PCR相结合的方法分离桃果实PLDα基因cDNA全长序列;半定量RT-PCR和Northern杂交检测目的基因在桃果实低温贮藏过程中的表达情况。【结果】成功获得全长为2859bp的桃果实PLDα基因序列,该序列具有完整的开放阅读框架(ORF,172～2604bp),编码810个氨基酸。对ORF进行的RT-PCR验证结果与电子克隆序列一致。序列分析显示,桃果实PLDα基因编码的氨基酸序列与草莓、番茄、葡萄等物种的磷脂酶Dα氨基酸序列之间具有高度的保守性,含有N端C2结构域及两个保守的活性中心。半定量RT-PCR和Northern杂交分析显示,桃PLDα基因在低温贮藏过程中被诱导表达。【结论】本研究首次通过电子克隆的方法获得了桃果实PLDα基因的全长序列,揭示了其序列特征,并初步明确了其在桃低温贮藏期间的表达模式。结果证明基于EST数据库的电子克隆已经是获取植物新基因的有效途径,同时为更深入研究桃果实的耐冷性及低温贮藏方法奠定了基础。

磷脂酶Dα在拟南芥低温驯化过程中的作用途径分析

本研究对低温驯化和未经低温驯化的磷脂酶α基因敲除突变体与野生型拟南芥植株进行冻害胁迫处理后,通过观测植株表型和膜离子渗漏率的变化,鉴定两种基因型植株的抗冻性。结果发现,低温驯化后,PLDα敲除突变体的抗冻性明显低于野生型,表明PLDα参与植物的低温驯化过程。对其作用途径进行分析发现,PLDα不参与低温驯化过程中ABA信号转导作用,也没有参与SOD、CAT和POD等3种抗氧化酶活性的调节,但是参与低温驯化过程中膜稳定性调节和渗透调节过程。

小麦磷脂酶Dα的基因克隆及其编码序列的生物信息学分析

为获得更多小麦抗逆基因资源,利用RT-PCR方法克隆了磷脂酶D基因(PLD),命名为TaPLDα,并对基因及其蛋白进行了生物信息学分析。结果表明,TaPLDα开放阅读框为2 394 bp,编码812个氨基酸残基,等电点5.30,分子量为92 kDa。序列分析显示,TaPLDα基因编码的氨基酸序列含有N端C2结构域及2个保守的活性中心。预测TaPLDα蛋白是一个亲水性稳定蛋白且定位于细胞质,其二级结构含28.82%的α-螺旋、20.07%的延伸链、6.03%的β-转角和45.07%的不规则卷曲。该蛋白不存在信号肽,无跨膜区。TaPLDα与水稻、玉米和拟南芥的PLDα氨基酸序列之间具有高度的保守性,进化分析显示,小麦PLDα序列与毒麦、水稻和玉米PLD序列亲缘关系密切。

正己醇对机械伤香蕉采后生理特性影响及磷脂酶D的抑制作用

为保持采后香蕉贮藏品质,延长贮藏期限,以桂蕉6号香蕉为实验材料,探究正己醇在常温贮藏条件下对采后香蕉果实品质和耐贮性的影响。挑选果实外观完好及成熟度、大小相近的香蕉果实,随机分成对照组和处理组2组,分别用蒸馏水和0.1%浓度正己醇处理,取出晾干后置于PE保鲜袋中扎口包装,于25℃下贮藏15 d,每3 d取样观察测定香蕉果实的硬度、可溶性固形物(TSS)含量、呼吸强度、病情指数、丙二醛(MDA)含量、膜透性和PLD活性的变化,利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析贮藏期间PLDγ和PLDζ表达量的变化。研究结果显示:正己醇处理可显著延缓采后香蕉果实软化的进程(P<0.05),其中,9、12 d延缓效果极显著(P<0.01);在9 d后,正己醇处理极显著抑制TSS含量和病情指数的上升;6 d起,正己醇处理显著抑制呼吸强度,其中,9 d达到呼吸峰值,较对照组极显著降低33.93%;12 d后,与对照组相比,正己醇处理极显著降低MDA含量和膜透性的上升,分别于15 d降低了26.70%和62.20%。此外,正己醇处理显著抑制采后香蕉果实PLD活性,尤其是6~12 d,抑制效果极显著(P<0.01);在15 d,正己醇处理后香蕉PLDγ和PLDζ表达量较对照组分别极显著降低72.06%和33.08%。综合分析可知,正己醇处理可有效延缓采后香蕉果实软化,抑制果实呼吸强度和PLD活性,减轻采后果实病害发生,从而抑制TSS、MDA的产生和膜透性的增大,并下调PLDγ和PLDζ表达,进而维持采后果实贮藏品质和延长贮藏期限。因此,正己醇可作为一种水果保鲜剂,不仅对维持采后果实品质及香蕉产业的发展具有重要意义,且在采后贮藏期间具有良好的应用前景。

不动杆菌磷脂酶D基因的表达、生物信息学及底物选择性分析

微生物来源磷脂酶D(Phospholipase D,PLD)因其较高的催化活性和广泛的底物选择谱而成为磷脂合成应用中的热点。本研究以Acinetobacter sp.DUT-2来源的PLD(ADPLD)为研究对象,首先通过生物信息学分析蛋白序列特征,然后构建重组质粒并在大肠杆菌中实现异源表达,进一步纯化酶蛋白并分析ADPLD对不同酰基链长磷脂酰胆碱(PC)的底物选择性,最后通过分子对接和分子模拟探究ADPLD的底物识别机制。通过对ADPLD和其他微生物来源的PLD多序列比对和进化树分析表明,ADPLD与链霉菌来源PLD序列相似度低于30%,且只有一个保守的HKD基序,这表明ADPLD的催化机制可能与传统认知中需要两个HKD基序完成PLD催化过程的反应机制有所不同。ADPLD主要以可溶性蛋白形式表达,仅通过Ni^(2+)亲和层析在50 mmol/L的低浓度咪唑下便能纯化出较为均一的蛋白,以大豆PC为底物时的比活性约为4.09 U/mg。ADPLD对中和短链PC(C6~C14)的活性相对较高,其中ADPLD对8:0/8:0-PC的比活性高于其它酰基链长的PC底物,为13.2 U/mg。当PC的酰基链长从C14增加至C16时,ADPLD对PC的活性明显降低。分子模拟和分子对接结果显示ADPLD的氨基酸残基Thr205、Pro209、Phe293、Ala324、Lys329和Phe453能够分别与PC形成疏水相互作用。Arg383和Gly326能够与PC形成氢键,其中Arg383(N)、Gly326(N)与PC(P)之间的距离<3Å。这些结果表明,ADPLD能够与磷脂分子形成一个稳定的酶与底物的中间体。研究结果为ADPLD的分子改造和进一步工业应用奠定了基础。

高产磷脂酶D的蜡样芽孢杆菌诱变筛选及发酵条件优化

蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种天然的磷脂酶D(PLD)生产菌株,为了提高PLD产量,以野生型蜡样芽孢杆菌(B.cereus CICC 20551)为出发菌,使用紫外线和硫酸二乙酯对其进行复合诱变,通过建立的PLD活性高效筛选方法,从大量突变样本中筛选得到一株高产PLD的蜡样芽孢杆菌S6-UD46。将该菌株摇瓶发酵48 h,产酶量达到0.52 U/mL,相比原始菌株(0.32 U/mL)提高了62.5%。对诱导产酶条件与培养基成分进行了优化,确定最佳发酵条件为:以20 g/L牛肉膏为氮源,10 g/L蔗糖为碳源,在600 nm波长下的光密度(OD600)达到4左右时加入40 g/L卵磷脂(磷脂酰胆碱含量>90%)对突变菌株S6-UD46进行诱导产酶,在37℃、200 r/min下培养48 h,PLD酶活性可达3.22 U/mL,是优化前的6.19倍。

磁性磷脂酶D交联酶聚集体的制备及其酶学性质

以磁性Fe3O4为载体,采用吸附-聚集-交联的方法固定来源于Streptomyces chromofuscus的磷脂酶D(scPLD),制备了磁性磷脂酶D交联酶聚集体(MCLEA)。该方法制备的MCLEA酶活回收率可达72.89%,酶活为(437.00±6.60)U/g。与游离酶相比,MCLEA在不同温度和pH下的稳定性都得到了一定程度的提升,但由于与底物的亲和力降低,需要更高浓度的磷脂酰胆碱(PC)和Ca^(2+)作为反应底物与MCLEA结合。乙醇、四氢呋喃、叔丁醇、乙酸乙酯、乙醚和甲苯对MCLEA的酶促反应具有促进作用,MCLEA在进行连续13次酶促反应后,酶活仍可保留在76%以上,其半衰期为331.67min,该固定化方案可以提高酶的稳定性,从而提高其在催化反应过程中的重复利用性。

辣椒疫霉菌磷脂酶PcPLD8基因功能研究

以辣椒疫霉菌为试材,采用基因沉默及过表达方法,研究了磷脂酶D PcPLD8基因的功能,揭示该基因对辣椒疫霉菌生长发育及致病力的影响,以期为深入揭示磷脂酶D在辣椒疫霉菌致病中的作用机理提供参考依据。结果表明:与野生型菌株WT和空载体转化子CK相比,PcPLD8基因沉默转化子S1和S5菌丝稀疏,侧枝多且短小,菌落直径小,生长速率慢,对本氏烟的致病力明显下降;PcPLD8基因过表达转化子OE2在菌丝形态、生长速率及对本氏烟的致病力无显著影响。

磷脂酶D的大肠杆菌表达系统及其转酰基催化活性

链霉菌(Streptomyces)来源的磷脂酶D(phospholipase D,PLD)在食品、保健品、医药等行业的应用潜力巨大。目前用大肠杆菌异源表达PLD的方法较常见,但其具有发酵周期长、分离纯化步骤烦琐、培养成本高等缺点。为此,对比研究了大肠杆菌胞内表达、分泌表达和表面展示3种方式对PLD酶活及其磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine,PS)催化合成效率的影响。采用单因素法获得PLD表达的最佳诱导条件为温度20℃、OD600=0.7、IPTG浓度0.3 mmol·L^(-1)。发酵时间曲线表明,在诱导表达8 h时,3种方式的PLD水解酶活均达最高值,分别为0.35,0.23,0.11 U·mL^(-1)。扫描电镜结果表明,大肠杆菌表达PLD后,其细胞结构有一定程度破坏,其中分泌表达菌株的变形塌陷情况最为严重。在水-乙酸乙酯两相体系中,以表面展示菌株全细胞催化磷脂酰胆碱(phosphatidylcholine,PC)方式制备PS的产率最高,可达59.1%,显示了大肠杆菌表面展示表达PLD具有大大降低生物催化转化成本的巨大潜力。

分析拟南芥叶片在激素促进的衰老中内源激素变化来解析抑制磷脂酶Dα1延缓激素促进衰老的机制（英文）

采后衰老进程在很大程度上受到内源和外源激素的影响。抑制拟南芥中磷脂酶Dα1(phospholipase Dα1,PLDα1)的表达后,使得外源脱落酸(abscisic acid,ABA)和乙烯加速的离体叶片衰老过程在一定程度上得到了缓解。然而,内源激素在这个过程中的作用尚不清楚。本研究对比分析了野生型和PLDα1缺失型两种基因型拟南芥叶片在3种不同人工老化过程中(离体诱导的、外源ABA和乙烯促进的衰老过程),内源ABA,茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)、吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)、玉米素核苷(zeatin riboside,ZR)和赤霉素(gibberellic acid,GA3)的含量变化。这5种激素对3种不同衰老处理方式的响应模式表明了人工老化过程存在着两个不同阶段,并且在衰老早期每种激素的变化模式相同。PLDα1功能缺失使得激素加速的衰老过程得以延缓,这与内源ABA、MeJA、ZR和IAA的含量变化有关,而与GA3的含量变化无关。同时,ZR和IAA的变化模式也说明了这两种激素的变化可能是缺失PLDα1延缓激素加速的衰老过程这一事件的原因而非结果。

磷脂酶Dα1与H2S参与冬凌草甲素对拟南芥的化感作用

以拟南芥哥伦比亚野生型(WT)、磷脂酶Dα1(PLDα1)缺失型突变体pldα1、D-/L-半胱氨酸脱巯基酶(D-/L-CDes)缺失型突变体d-cdes和l-cdes幼苗为试验材料,60μmol·L^-1冬凌草甲素为处理浓度,研究了拟南芥响应二萜类化合物冬凌草甲素的化感作用中磷脂酶Dα1(PLDα1)与气体信号分子硫化氢(H2S)的信号关系。结果表明:冬凌草甲素显著提高了野生型拟南芥幼苗H2S含量、PLD和D-/L-CDes酶的活性及其基因表达;冬凌草甲素处理下,pldα1突变体幼苗的D-CDes和L-CDes活性明显低于WT,外源添加磷脂酸(PA)后D-CDes和L-CDes活性显著提高,并高于WT;冬凌草甲素显著抑制4种株系根的生长,其中d-cdes和l-cdes对冬凌草甲素更加敏感,外施NaHS可以促进冬凌草甲素处理下4种株系根的生长及内源H2S产生,外施PA只对冬凌草甲素处理下的WT、pldα1和l-cdes株系根的生长及内源H2S产生有促进作用,而对d-cdes株系没有明显作用。说明PLDα1和H2S在拟南芥响应冬凌草甲素过程中发挥作用,且PLDα1/PA位于D-CDes上游,参与调控拟南芥幼苗H2S的产生及根生长的信号过程。

沙丁胺醇与色甘酸钠对大鼠腹腔肥大细胞脱颗粒过程中磷脂酶D活性的影响

采用主动致敏的大鼠腹腔肥大细胞 (RPMC)为实验材料 ,细胞脱颗粒以 β 氨基己糖苷酶释放率为指标 ,细胞磷脂酶D(PLD)活性采用酶联化学发光法检测 .结果发现 ,卵白蛋白 (4mg·L- 1)攻击主动致敏的RPMC 12 0s后 ,细胞PLD活性与β 氨基己糖苷酶释放率均明显增加 ,分别为对照组的 2倍及 8倍以上 .1%正丁醇 ,10mmol·L- 12 ,3 二磷酸甘油酸能显著抑制PLD活性 ,且使PLD活性及细胞 β 氨基己糖苷酶释放率均降低到对照水平 .Wortmannin ,30 0nmol·L- 1能显著抑制PLD活性 ,并减少细胞 β 氨基己糖苷酶释放 .1,10 μmol·L- 1的沙丁胺醇与色甘酸钠均能部分抑制PLD活性 ,并减少细胞 β 氨基己糖苷酶的释放 .结果表明 ,PLD在主动致敏的RPMC脱颗粒过程中起一定作用 ;沙丁胺醇 (1,10 μmol·L- 1) ,色甘酸钠 (1,10 μmol·L- 1)抑制主动致敏的RPMC脱颗粒的作用机理与抑制PLD有关 .

植物中的磷脂酶D

介绍了植物磷脂酶D(PLD)的生化性质、克隆、基因组结构、氨基酸序列结构、活性调控、信号转导和细胞生理功能的研究进展。

植物磷脂酶D基因表达与衰老的关系

磷脂酶D(PLD)是一种重要的磷脂水解酶,在植物细胞中普遍存在。磷脂酶D能激活许多重要的细胞生理功能,包括调控细胞膜的重建、跨膜信号传导及细胞内调控、细胞骨架组装、防御反应以及种子萌发和植物的衰老等。对磷脂酶D的基本特性、磷脂酶D基因特异性表达模式及其活性抑制与植物衰老的关系进行了综述,并探讨和展望了今后植物磷脂酶D基因的研究方向。

链霉菌磷脂酶D的分离纯化及部分酶学性质

由链霉菌发酵所得的磷脂酶D经过硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子色谱、Source 30S阳离子色谱和Superdex 75凝胶过滤色谱分离纯化,相对分子质量约为57k。在55℃和pH 7.0时显示最高相对酶活力。酶动力学参数K_m和V_(max)分别为254mmol/L和0.417μmol/min。

反义磷脂酶Dγ基因与几丁质酶基因转化美洲黑杨G2

建立美洲黑杨G2组培再生体系,确立美洲黑杨G2分化最适宜培养基和生根培养基。然后分别进行卡那霉素和潮霉素敏感性试验,利用叶盘法依次将反义磷脂酶Dγ(Anti_PLDγ)基因和几丁质酶(CH5B)基因转入美洲黑杨G2中。首先转入反义磷脂酶Dγ基因,经诱导不定芽及生根阶段卡那霉素(选择性抗生素)连续筛选,获得了21株卡那霉素抗性植株。抗性植株经PCR及PCR_Southern杂交检测,有13株均呈阳性,证明Anti_PLDγ基因成功整合到美洲黑杨G2基因组中。耐盐性试验表明,4株转基因植株抗NaCl能力比对照都有不同程度提高。选择4号株系继续转入几丁质酶基因,通过潮霉素(选择性抗生素)筛选不定芽及诱导生根获6株潮霉素抗性植株,经PCR及PCR_Southern杂交检测,6株均呈阳性,证明CH5B基因成功整合到美洲黑杨G2基因组中。由于CH5B基因与报告基因GUS处于同一开放阅读框(ORF)内,因此通过GUS基因的组织化学染色分析,证明了6株转化植株几丁质酶基因均获得正常表达。

Dip法获得转反义磷脂酶Dγ(PLDγ)基因拟南芥植株

在含反义PLDγ基因的质粒根癌农杆菌的介导下 ,以生长到初果期的健壮拟南芥植株为转基因材料 ,用Dip法进行转基因实验 ,对影响转化率的浸染条件进行了比较研究。适宜的转化条件是将拟南芥的整个花序浸泡于农杆菌悬浮液中 (含 5 %蔗糖 ,0 .0 4 %吐温 - 80 ) ,每次浸染 10min ,间隔 3天浸染一次 ,共浸染 3次。每次浸染后将植株横放于暗箱中 2 4h ,再置于 2 2～ 2 4℃的光照下正常生长。待种子收获后在含有卡那霉素 70mg L的选择培养基中选择转化植株。PCR及PCR -Southernblot分析检测 ,该方法的转化率每 10 0粒种子可高达 2 %。

干旱胁迫下拟南芥磷脂酶Dδ与一氧化氮在种子萌发中的信号关系

以拟南芥野生型(WT)、一氧化氮合酶(NOS)缺失型突变体(noa1)、硝酸还原酶(NR)缺失型突变体(nia1,nia2)及磷脂酶Dδ(PLDδ)缺失型突变体(pldδ)幼苗为材料,研究了0.3 mol·L-1甘露醇模拟干旱胁迫响应过程中PLDδ和一氧化氮(NO)之间的信号转导关系。结果显示:干旱胁迫下NO含量,PLD和NR活性及基因相对表达量显著升高,pldδ和nia2较其他突变体对干旱胁迫更敏感;外源添加NO供体硝普钠(SNP)可以提高干旱胁迫下WT,nia2和pldδ的种子萌发,而外源添加磷脂酸(PA)可以促进WT和pldδ的种子萌发,但不能促进nia2的种子萌发;PA可以促进干旱胁迫下WT和pldδ的NO产生,但不能促进nia2中NO的产生。表明:干旱胁迫下PLDδ/PA位于NO信号的上游,且PLDδ/PA主要通过NR2途径产生的NO促进干旱胁迫下拟南芥的种子萌发。

高山离子芥磷脂酶D活性测定及酶动力学分析

高山离子芥(Chorispora bungean)是一种高抗逆的多年生高山草本植物,具有特殊的分子及生理抗逆响应机制。磷脂水解酶磷脂酶D(PLD)是重要的跨膜信号转导酶。以高山离子芥愈伤组织为试材,利用酶联免疫分光光度计法,优化磷脂酶D活性测定体系,建立了在25℃反应温度条件下,200弘L反应体系中,膜蛋白的含量35μg、反应时间30 min、pH为7.0的缓冲液系统最适合高山离子芥愈伤组织磷脂酶D活性测定体系,分析表明不同膜结合态磷脂酶D的酶动力学特征存在差异,为进一步探讨磷脂酶D在高山离子芥响应逆境胁迫中的作用奠定基础。