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竞争性RT-PCR法定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D基因的表达 被引量:4
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作者 张晓杰 鲁纯平 +2 位作者 唐建华 顾善兰 禹虹 《湖南医科大学学报》 CSCD 北大核心 2003年第4期322-326,共5页
目的 :建立一种定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI PLD)基因表达水平的竞争性RT PCR方法 ,以研究GPI PLD与白血病等疾病的关系。方法 :首先用PCR定点诱变法构建GPI PLD的竞争性cDNA模板 ,该模板与靶cDNA具有相同的引物结合区 ... 目的 :建立一种定量检测糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI PLD)基因表达水平的竞争性RT PCR方法 ,以研究GPI PLD与白血病等疾病的关系。方法 :首先用PCR定点诱变法构建GPI PLD的竞争性cDNA模板 ,该模板与靶cDNA具有相同的引物结合区 ,但在长度上要比靶cDNA少 2 0个碱基。把该竞争性cD NA模板在体外转录出的竞争性RNA作为RT PCR的内标准 ,与白血病细胞株K5 6 2细胞的总RNA在同一体系内进行逆转录和PCR扩增 ,二者的PCR产物因长度不同可经电泳区分开 ,然后对电泳图像进行光密度扫描 ,根据已知的竞争性RNA模板的量计算出GPI PLDmRNA的量 ,从而得到GPI PLD基因的绝对表达量。结果 :构建和制备了长度为 198bp的GPI PLD竞争性RNA模板 ,该模板与靶模板呈明显的竞争性RT PCR反应 ;测得K5 6 2细胞GPI PLD基因的表达水平为每纳克 (44 0± 2 0 )拷贝。结论 :成功地建立了一种定量检测GPI PLD基因表达水平的竞争性RT PCR方法 ,该方法具有灵敏、准确等优点。 展开更多
关键词 竞争性RT-PCR法 定量检测 糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶d基因 表达 白血病
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蒙古冰草磷脂酶D基因cDNA3’端的克隆及分析 被引量:2
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作者 康虹丽 韩冰 李淑芬 《生物技术》 CAS CSCD 2008年第2期1-5,共5页
目的:采用3’RACE方法对蒙古冰草磷脂酶D(PLD)基因3’端全序列进行了快速扩增和序列分析,为得到全序列及研究该基因的功能奠定基础。方法:实验以蒙古冰草幼叶为材料,利用RT-PCR技术得到PLD基因的部分cDNA序列,根据此序列设计一条特异性... 目的:采用3’RACE方法对蒙古冰草磷脂酶D(PLD)基因3’端全序列进行了快速扩增和序列分析,为得到全序列及研究该基因的功能奠定基础。方法:实验以蒙古冰草幼叶为材料,利用RT-PCR技术得到PLD基因的部分cDNA序列,根据此序列设计一条特异性上游引物,反转录引物中的部分序列即M13PrimerM4作为下游引物,按3’RACE试剂盒(TaKaRa)操作流程进行PLD基因3’末端的快速扩增,成功获得993bp的3’RACE反应产物,采用DNAStar软件对扩增的PLD基因的3’RACE产物和中间片段进行拼接,最终获得2113bp的PLD基因3’端cDNA序列。结果:通过BLAST技术,发现该片段与许多植物磷脂酶D基因的同源性为47.0%~80.0%。结论:通过同源性比较,成功克隆了PLD基因cDNA3’端序列。 展开更多
关键词 磷脂酶d基因 3’RACE CdNA
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日本结缕草(Zoysia japonica)磷脂酶D基因部分保守序列的克隆及其对机械损伤的响应 被引量:4
3
作者 李亚超 王玉玲 +3 位作者 朱晨 钟天秀 谢琦 曾会明 《广东农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2014年第24期130-133,141,共5页
以日本结缕草Zenith为材料,通过同源克隆的方法克隆出其磷脂酶D(PLD)基因部分保守序列,序列长399 bp,并通过实时荧光定量PCR检测PLD基因在机械损伤胁迫下随时间变化的表达模式。结果表明,磷脂酶D在胁迫2 h内大量表达,随后逐渐降低,在9 ... 以日本结缕草Zenith为材料,通过同源克隆的方法克隆出其磷脂酶D(PLD)基因部分保守序列,序列长399 bp,并通过实时荧光定量PCR检测PLD基因在机械损伤胁迫下随时间变化的表达模式。结果表明,磷脂酶D在胁迫2 h内大量表达,随后逐渐降低,在9 h已接近于对照水平,说明PLD基因在损伤初期大量参与了应对机械损伤胁迫的防御与修复过程,在损伤后期其作用减弱或被代替;电导率的测定结果表明,细胞膜结构在胁迫初期遭到极大程度的破坏,胁迫9 h后膜损伤程度开始减轻。结合PLD基因和电导率的表达模式,推测PLD基因在6 h内会激活一系列感受信号及下游信号分子,9 h后其相应防御机制发挥作用来减轻胁迫造成的损害。 展开更多
关键词 日本结缕草 磷脂酶d(PLd)基因 简并引物 克隆 机械损伤 定量表达
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反义磷脂酶Dγ基因与几丁质酶基因转化美洲黑杨G2 被引量:12
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作者 邹维华 赵强 +1 位作者 崔德才 王斌 《林业科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2006年第1期37-42,共6页
建立美洲黑杨G2组培再生体系,确立美洲黑杨G2分化最适宜培养基和生根培养基。然后分别进行卡那霉素和潮霉素敏感性试验,利用叶盘法依次将反义磷脂酶Dγ(Anti_PLDγ)基因和几丁质酶(CH5B)基因转入美洲黑杨G2中。首先转入反义磷脂酶Dγ基... 建立美洲黑杨G2组培再生体系,确立美洲黑杨G2分化最适宜培养基和生根培养基。然后分别进行卡那霉素和潮霉素敏感性试验,利用叶盘法依次将反义磷脂酶Dγ(Anti_PLDγ)基因和几丁质酶(CH5B)基因转入美洲黑杨G2中。首先转入反义磷脂酶Dγ基因,经诱导不定芽及生根阶段卡那霉素(选择性抗生素)连续筛选,获得了21株卡那霉素抗性植株。抗性植株经PCR及PCR_Southern杂交检测,有13株均呈阳性,证明Anti_PLDγ基因成功整合到美洲黑杨G2基因组中。耐盐性试验表明,4株转基因植株抗NaCl能力比对照都有不同程度提高。选择4号株系继续转入几丁质酶基因,通过潮霉素(选择性抗生素)筛选不定芽及诱导生根获6株潮霉素抗性植株,经PCR及PCR_Southern杂交检测,6株均呈阳性,证明CH5B基因成功整合到美洲黑杨G2基因组中。由于CH5B基因与报告基因GUS处于同一开放阅读框(ORF)内,因此通过GUS基因的组织化学染色分析,证明了6株转化植株几丁质酶基因均获得正常表达。 展开更多
关键词 美洲黑杨 反义磷脂酶dγ基因 几丁质酶基因 耐盐 抗病
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Dip法获得转反义磷脂酶Dγ(PLDγ)基因拟南芥植株 被引量:11
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作者 韩红岩 崔德才 +1 位作者 张岳民 刘天臻 《山东农业大学学报(自然科学版)》 CSCD 北大核心 2003年第1期19-23,共5页
在含反义PLDγ基因的质粒根癌农杆菌的介导下 ,以生长到初果期的健壮拟南芥植株为转基因材料 ,用Dip法进行转基因实验 ,对影响转化率的浸染条件进行了比较研究。适宜的转化条件是将拟南芥的整个花序浸泡于农杆菌悬浮液中 (含 5 %蔗糖 ,0... 在含反义PLDγ基因的质粒根癌农杆菌的介导下 ,以生长到初果期的健壮拟南芥植株为转基因材料 ,用Dip法进行转基因实验 ,对影响转化率的浸染条件进行了比较研究。适宜的转化条件是将拟南芥的整个花序浸泡于农杆菌悬浮液中 (含 5 %蔗糖 ,0 .0 4 %吐温 - 80 ) ,每次浸染 10min ,间隔 3天浸染一次 ,共浸染 3次。每次浸染后将植株横放于暗箱中 2 4h ,再置于 2 2~ 2 4℃的光照下正常生长。待种子收获后在含有卡那霉素 70mg L的选择培养基中选择转化植株。PCR及PCR -Southernblot分析检测 ,该方法的转化率每 10 0粒种子可高达 2 %。 展开更多
关键词 拟南芥 基因 反义磷脂酶dγ基因 diP法 卡那霉素
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小麦磷脂酶Dδ基因的克隆及表达分析 被引量:3
6
作者 王俊斌 丁博 +5 位作者 李明 陈帅君 李欣 张卫国 彭四八 谢晓东 《麦类作物学报》 CAS CSCD 北大核心 2015年第7期888-895,共8页
磷脂酶D(Phospholipase D,PLD)是植物体内重要的信号转导酶。为了深入了解小麦PLD基因功能,利用同源克隆的方法从普通小麦扬麦158中克隆出TaPLDδ基因后进行序列分析,同时对TaPLDδ基因在不同组织及不同胁迫条件下的表达模式进行分析。... 磷脂酶D(Phospholipase D,PLD)是植物体内重要的信号转导酶。为了深入了解小麦PLD基因功能,利用同源克隆的方法从普通小麦扬麦158中克隆出TaPLDδ基因后进行序列分析,同时对TaPLDδ基因在不同组织及不同胁迫条件下的表达模式进行分析。结果表明,TaPLDδ基因编码区长为2 589bp,编码862个氨基酸,等电点为6.93,分子量约为97kDa。氨基酸序列分析显示,TaPLDδ基因编码的氨基酸序列含有N端C2结构域及两个保守的HKD活性中心。预测分析表明,TaPLDδ蛋白属于亲水性稳定蛋白,在细胞质中合成后,不进行蛋白转运;其二级结构包含27.49%的α-螺旋、19.14%的延伸链、6.73%的β-转角和46.64%的不规则卷曲。不同物种间TaPLDδ蛋白的同源性分析比较表明,TaPLDδ与谷子、玉米和拟南芥的PLDδ氨基酸序列之间具有高度的保守性,且与乌拉尔图小麦、二穗短柄草和水稻PLDδ亲缘关系密切。此外,qRT-PCR分析表明,TaPLDδ在叶、根、茎、花和种子中均有不同程度表达,并受ABA、NaCl和PEG诱导表达增强,推测该基因参与小麦渗透胁迫应答。以上这些研究结果为进一步研究TaPLDδ的生物学功能奠定了基础。 展开更多
关键词 小麦 磷脂酶dδ基因 克隆 基因表达 生物信息学
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反义磷脂酶Dγ(Anti-PLDγ)基因转化美洲黑杨G2的研究 被引量:5
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作者 邹维华 李红双 +1 位作者 崔德才 王斌 《西北植物学报》 CAS CSCD 2004年第11期2002-2006,共5页
通过农杆菌介导法将反义磷脂酶Dγ Anti-PLDγ 基因转入美洲黑杨G2中以提高其耐盐性.本研究建立了美洲黑杨G2组培再生体系,确立了美洲黑杨G2叶片分化最适宜培养基和生根培养基,进行了卡那霉素 选择性抗生素 敏感性试验,改良了传统的农... 通过农杆菌介导法将反义磷脂酶Dγ Anti-PLDγ 基因转入美洲黑杨G2中以提高其耐盐性.本研究建立了美洲黑杨G2组培再生体系,确立了美洲黑杨G2叶片分化最适宜培养基和生根培养基,进行了卡那霉素 选择性抗生素 敏感性试验,改良了传统的农杆菌介导转化法.经诱导不定芽及生根阶段卡那霉素 选择性抗生素 连续筛选,获得了21株卡那霉素抗性植株,抗性植株经PCR及PCR-Southern杂交检测,有13株均呈阳性,证明Anti-PLDγ基因成功整合到美洲黑杨G2基因组中.耐盐性实验表明,4株转基因植株抗NaCl能力比对照有不同程度提高. 展开更多
关键词 美洲黑杨 反义磷脂酶dγ基因 耐盐 整合位点
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花生编码磷脂酶D的类PLD基因的鉴定和部分测序(英文) 被引量:3
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作者 许广 郭宝珠 +1 位作者 C.C.Holbrook R.E.Lynch 《花生学报》 2001年第4期1-10,共10页
花生工业界认为收获前花生黄曲霉毒素的污染是全世界花生工业界面临的最严峻的挑战。干旱胁迫是加重花生黄曲霉真菌侵染和毒素污染最重要的环境因素。选育花生抗性品种将使美国花生工业处于优势地位。在这一研究报告中 ,我们鉴定出了一... 花生工业界认为收获前花生黄曲霉毒素的污染是全世界花生工业界面临的最严峻的挑战。干旱胁迫是加重花生黄曲霉真菌侵染和毒素污染最重要的环境因素。选育花生抗性品种将使美国花生工业处于优势地位。在这一研究报告中 ,我们鉴定出了一个新的类PLD基因 ,它编码磷脂酶D。在植物体中 ,这个酶是负责干旱诱导降解细胞膜磷脂的主要酶。克隆的PLD1片段有 1 0 69个核甘酸对长。推导的氨基酸序列与已知的PLD基因有很高的同一性 ,包括相似的保守序列特征 ,比如两个HXKXXXXD基元。对花生PLD基因特性需要从遗传和生理上作进一步研究 。 展开更多
关键词 黄曲霉毒素 花生栽培种 干旱胁迫 基因克隆磷脂酶d PLd基因
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反义磷脂酶Dγ转基因片段的结构与功能分析及转基因产物预测
9
作者 高建强 崔德才 赵檀方 《生物技术通讯》 CAS 2007年第1期47-50,共4页
目的:从生物信息学角度,对反义磷脂酶Dγ转基因片段的结构、来源进行查找,并预测分析该片段的转录产物、翻译产物,进而推导该片段的最终产物和作用方式。方法:利用http://www.expasy.ch/、http://bioweb.pasteur.fr、http://fasta.bioch... 目的:从生物信息学角度,对反义磷脂酶Dγ转基因片段的结构、来源进行查找,并预测分析该片段的转录产物、翻译产物,进而推导该片段的最终产物和作用方式。方法:利用http://www.expasy.ch/、http://bioweb.pasteur.fr、http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www、http://www.ncbi.nlm.nih.gov等在线分析工具。结果:该片段来自拟南芥第4条染色体上磷脂酶Dγ2(NM_117252.4│GI:42566497),转录生成一段400bp、没有稳定二级结构的RNA,且不能翻译产生蛋白质;经查找,有许多转录物因子和micRNA(mRNA干扰互补RNA,反义RNA)查找。结论:该片段最终产物为micRNA,在RNA干扰(RNAi)水平上调控相关基因的表达。 展开更多
关键词 反义磷脂酶dγ基因 基因片段 基因产物 RNA干扰 生物信息学
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砂藓RcPLD基因的抗旱功能分析 被引量:1
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作者 马天意 张时通 +4 位作者 朱巍巍 张梅娟 李莹莹 彭疑芳 沙伟 《西北植物学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第7期1091-1100,共10页
砂藓(Racomitrium canescens)是一种具有极强耐脱水性的苔藓植物,编码磷脂酶D的基因RcPLD能够在砂藓的脱水和复水过程中产生显著的表达响应,它可能参与了砂藓的强耐脱水性功能。该研究使用已克隆的RcPLD编码序列构建拟南芥(Arabidopsis ... 砂藓(Racomitrium canescens)是一种具有极强耐脱水性的苔藓植物,编码磷脂酶D的基因RcPLD能够在砂藓的脱水和复水过程中产生显著的表达响应,它可能参与了砂藓的强耐脱水性功能。该研究使用已克隆的RcPLD编码序列构建拟南芥(Arabidopsis thaliana)过量表达转基因株系rcpld-oe,初步考察过表达株系的干旱胁迫耐受能力及其相关的生理生化指标,分析RcPLD增强拟南芥抗旱性的机制。结果表明:(1)利用已克隆的RcPLD编码序列构建了植物中的过表达载体,成功构建了RcPLD的过表达转基因拟南芥株系rcpld-oe,并获得了多个T3代rcpld-oe纯合体株系。(2)在正常生长条件下,rcpld-oe株系T3代纯合体植株比野生型拟南芥植株体积小,但营养生长期较长,抽薹较晚,莲座叶衰老速率较慢;在干旱处理条件下,rcpld-oe株系表现出比野生型拟南芥更强的干旱耐受能力。(3)在干旱胁迫处理过程中,rcpld-oe株系莲座叶的水分散失速率降低,可能在一定程度上降低了干旱对膜完整性的损伤和光合作用的抑制,但其渗透调节物质含量的变化相对较小。研究发现,在干旱胁迫条件下,rcpld-oe植株莲座叶的水分散失速率和光合作用抑制程度显著降低,从而表现出明显强于野生型的干旱耐受能力,这为后续RcPLD功能的深入研究和更多砂藓抗旱功能基因的挖掘奠定了基础。 展开更多
关键词 砂藓 磷脂酶d基因(PLd) 干旱胁迫 抗旱功能分析
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草莓PLDα基因cDNA克隆及反义植物表达载体构建
11
作者 卢秀丽 罗淑萍 +2 位作者 袁海英 吴玉霞 周长发 《新疆农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2009年第6期1182-1187,共6页
【目的】获得草莓磷脂酶Dα(PLDα)的HKD2功能区基因序列构建反义植物表达载体。研究PLDα基因对草莓果实耐贮性的影响。【方法】以草莓完熟果实为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到PLDα基因的cDNA片段,将其T-A克隆至pMD19-T simpl... 【目的】获得草莓磷脂酶Dα(PLDα)的HKD2功能区基因序列构建反义植物表达载体。研究PLDα基因对草莓果实耐贮性的影响。【方法】以草莓完熟果实为材料提取总RNA,利用RT-PCR技术扩增得到PLDα基因的cDNA片段,将其T-A克隆至pMD19-T simple vector上,测序正确后克隆载体经双酶切消化,目的片断反向插入到植物表达载体pBI121中。【结果】构建草莓PLDα基因的反义植物表达载体pBI121-PLD。【结论】通过冻融法将携带反义cDNA的植物表达载体质粒导入根癌农杆菌LBA44404,为进一步通过反义技术延长草莓果实贮藏的寿命奠定了基础。 展开更多
关键词 草莓 磷脂酶dα基因 反义植物表达载体
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Genome-wide analysis and expression profiling of the phospholipase D gene family in Gossypium arboreum 被引量:9
12
作者 Kai TANG Chunjuan DONG Jinyuan LIU 《Science China(Life Sciences)》 SCIE CAS CSCD 2016年第2期130-141,共12页
The plant phospholipase D (PLD) plays versatile functions in multiple aspects of plant growth, development, and stress re- sponses. However, until now, our knowledge concerning the PLD gene family members and their ... The plant phospholipase D (PLD) plays versatile functions in multiple aspects of plant growth, development, and stress re- sponses. However, until now, our knowledge concerning the PLD gene family members and their expression patterns in cotton has been limited. In this study, we performed for the first time the genome-wide analysis and expression profiling of PLD gene family in Gossypium arboretum, and finally, a total of 19 non-redundant PLD genes (GaPLDs) were identified. Based on the phylogenetic analysis, they were divided into six well-supported clades (tx, 13/?, 8, ~, ~ and q~). Most of the GaPLD genes with- in the same clade showed the similar exon-intron organization and highly conserved motif structures. Additionally, the chro- mosomal distribution pattern revealed that GaPLD genes were unevenly distributed across 10 of the 13 cotton chromosomes. Segmental duplication is the major contributor to the expansion of GaPLD gene family and estimated to have occurred from 19.61 to 20.44 million years ago when a recent large-scale genome duplication occurred in cotton. Moreover, the expression profiling provides the functional divergence of GaPLD genes in cotton and provides some new light on the molecular mecha- nisms of GaPLDcd and GaPLD62 in fiber development. 展开更多
关键词 Gossypium arboreum phospholipase d gene family expression patterns fiber development
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山羊伪结核棒状杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立和初步应用 被引量:8
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作者 马玉馨 李文贵 +4 位作者 郑国英 邬培昆 邵庆勇 李志明 高华峰 《畜牧与兽医》 北大核心 2018年第10期82-87,共6页
为了快速检测无临床症状的山羊是否感染山羊伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis),根据Gen Bank中伪结核棒状杆菌磷脂酶D(phospholipase D,PLD)基因序列,分别设计1对特异性引物和Taq Man探针,经过反应条件和体系优化... 为了快速检测无临床症状的山羊是否感染山羊伪结核棒状杆菌(Corynebacterium pseudotuberculosis),根据Gen Bank中伪结核棒状杆菌磷脂酶D(phospholipase D,PLD)基因序列,分别设计1对特异性引物和Taq Man探针,经过反应条件和体系优化,测定特异性、敏感性和稳定性,建立山羊伪结核病Taq Man荧光定量PCR检测方法,并对54份临床样品进行检测。结果显示:建立的山羊伪结核棒状杆菌方法具有很好的特异性,在20μL扩增体系中,引物浓度为0.20μmol/m L,探针浓度为0.45μmol/m L,退火温度59℃时最佳;最低可检测出4.6×102个拷贝数的细菌DNA,标准曲线相关系数是0.996。同时,对Taq Man荧光定量PCR和常规PCR进行了比较,前者的敏感性是后者的1 000倍;对54份临床样品进行检测,Taq Man荧光定量PCR检出的阳性率为68.5%(37/54),常规PCR检出的阳性率为53.7%(29/54)。研究表明:Taq Man荧光定量PCR法检出率较高,有特异、敏感且快速的特点,适用于临床样品的检测。 展开更多
关键词 伪结核棒状杆菌 磷脂酶d基因(PLd) 实时荧光定量PCR
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