重组人磷脂酶D1/腺病毒表达载体的构建与表达

将磷脂酶D1基因及其功能缺陷点突变基因从真核表达载体pCGN PLD1亚克隆至带有绿色荧光标记蛋白的穿梭质粒pAdTrack CMV中 ;再与腺病毒骨架载体一起在大肠杆菌BJ5 1 83中进行同源重组 ;阳性重组子经PacⅠ线性化后 ,转染入病毒组装细胞系 2 93细胞 ,成功构建磷脂酰胆碱专一性磷脂酶D1重组腺病毒 ;并用该病毒颗粒感染嗜铬细胞瘤细胞PC1 2细胞 ,高效表达磷脂酶D1蛋白。证明大蛋白基因 ,如磷脂酶D1基因的同源重组腺病毒表达构建切实可行 。

磷脂酶D1对胰腺癌细胞增殖的影响

目的探究磷脂酶D1(PLD1)对于胰腺癌细胞增殖的影响。方法通过CCK-8法、Ed U荧光染色和流式细胞术检测PLD、PLD1及PLD2抑制剂对胰腺癌细胞系Capan-2细胞活力、增殖、周期的影响;采用同样方法检测抑制/过表达PLD1对Capan-2细胞活力、增殖、周期的影响。结果 PLD、PLD1抑制剂均抑制了Capan-2增殖(P=0.004、0.044),而PLD2抑制剂对Capan-2增殖无明显影响(P=0.945)。下调PLD1的表达使Capan-2细胞活力降低(P=0.000)、增殖能力减弱(P=0.002),阻碍了细胞周期进展(P=0.004、0.002);上调PLD1的表达使Capan-2细胞活力提高(P=0.004)、增殖能力增强(P=0.002),促进细胞周期进展(P=0.000 4、0.035)。结论 PLD1能够促进胰腺癌细胞的增殖,在胰腺癌的发展中发挥着重要的作用。

磷脂酶D1促进非酒精性脂肪肝体外模型的脂肪生成

目的探讨PLD1在非酒精性脂肪肝体外细胞模型中对脂肪生成的作用。方法实验分为空白对照组、FFA模型对照组、si-PLD1对照组、si-PLD1+FFA模型干预组、Ad-PLD1对照组、Ad-PLD1+FFA模型干预组。1 mmol/L浓度游离脂肪酸(free fatty acid,FFA)体外持续作用HepG2细胞诱导脂肪肝细胞体外模型;CCK-8检测FFA的细胞毒性;空白对照组和FFA模型对照组行油红O染色,鉴定脂肪肝细胞模型成功构建。qRT-PCR检测空白对照组和FFA模型对照组PLD1和PLD2 mRNA表达水平;以PLD1为干预靶点,构建PLD1特异性小干扰RNA(si-PLD1 RNA)转染细胞和过表达慢病毒株(Ad-PLD1)感染细胞,通过流式细胞术检测各组尼罗红染色后的平均荧光强度,通过RT-qPCR检测各组细胞成脂相关基因的表达。结果非酒精性脂肪肝体外细胞模型构建成功,且CCK-8检测显示FFA无细胞毒性(P<0.01);FFA模型对照组PLD1 mRNA表达水平明显低于空白对照组(P<0.05);沉默PLD1后,流式细胞术示FFA模型对照组较空白对照组细胞内脂滴显著增加(P<0.001),而si-PLD1+FFA模型干预组较FFA模型对照组细胞内脂滴显著减少(P<0.001);RT-qPCR显示,FFA模型对照组较空白对照组FASN表达明显升高(P<0.05),而si-PLD1+FFA模型干预组较FFA模型对照组FASN表达明显减少(P<0.01)。过表达PLD1后,流式细胞术示FFA模型对照组较空白对照组细胞内脂滴显著增加(P<0.001),且Ad-PLD1+FFA模型干预组较FFA模型对照组细胞内脂滴增多(P<0.001);同时RT-qPCR显示FFA模型对照组较空白对照组FASN表达明显升高(P<0.05),且Ad-PLD1+FFA模型干预组较FFA模型对照组FASN表达明显增加(P<0.05)。结论非酒精性脂肪肝体外细胞模型中PLD1参与细胞脂滴生成,并可促进细胞脂滴生成。PLD1可能成为NAFLD的治疗新靶标。

抑制磷脂酶D1活性可促进缺血性脑卒中模型小鼠神经功能恢复

目的探讨小鼠缺血性脑卒中发生后不同时期病灶脑组织自噬的动态变化,以及抑制磷脂酶D(phospholipase D,PLD)1活性与自噬及神经功能的关系。方法先用21只8周龄成年雄性C57BL/6小鼠构建缺血性脑卒中模型,随机分为假手术组和缺血性脑卒中后4 h、6 h、8 h、12 h、24 h、72 h组,每组各3只,采用蛋白质印迹法和免疫荧光染色法检测小鼠病灶脑组织中自噬相关蛋白LC3的表达及分布情况。另将36只8周龄成年雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、缺血性脑卒中后腹腔注射PBS组和4个浓度(0.3、0.9、1.8和3.6 mg/kg)的PLD活性抑制剂FIPI组,每组各6只;缺血性脑卒中发生后的第1、第3和第7天,分别通过贴纸去除实验、触须诱发前肢放置实验和TTC染色法评估抑制剂最佳浓度及其对神经功能和脑梗死面积的影响。再将9只8周龄成年雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、缺血性脑卒中后立即腹腔注射PBS和0.9 mg/kg FIPI组,每组3只,通过蛋白质印迹法检测FIPI对自噬相关蛋白表达的影响。最后将36只8周龄成年雄性C57BL/6小鼠随机分为假手术组、缺血性脑卒中后立即腹腔注射PBS组以及不同时间窗(术后立即和术后4 h、8 h、12 h)腹腔注射0.9 mg/kg FIPI组,每组各6只,通过行为学实验和TTC染色法评估缺血性脑卒中小鼠的神经功能和脑梗死面积。结果小鼠缺血性脑卒中发生后,病灶组织中LC3-Ⅱ相对表达水平开始升高,24 h达到峰值(P<0.05),然后逐渐下降。与PBS组相比,给予0.9 mg/kg的PLD1活性抑制剂FIPI组能明显抑制小鼠缺血性脑卒中后病灶组织中LC3-Ⅱ相对表达水平(P<0.05),缩小梗死面积(P<0.05),促进损伤后神经功能的恢复(P<0.05)。与PBS组相比,除了缺血性脑卒中后立即给予FIPI组外,缺血性脑卒中后4 h、8 h和12 h腹腔给予FIPI也都可以明显缩小梗死面积(P<0.05),使小鼠神经功能得到明显恢复(P<0.05)。结论缺血性脑卒中发生后24 h病灶组织自噬最为明显,降低PLD1活性可以明显抑制自噬,从而促进缺血性脑卒中后神经功能的恢复。同时,除了缺血性脑卒中后立即给予FIPI外,延迟4~12 h给予FIPI也可以缩小梗死面积,促进神经功能的恢复,这拓宽了缺血性脑卒中的治疗窗口期,可能为临床治疗脑卒中提供新的策略。

磷脂酶D1在乳腺癌细胞中的表达及雷公藤甲素的干预作用

目的:探讨磷脂酶D1(PLD1)在不同乳腺癌细胞中的表达情况以及雷公藤甲素(TP)对人乳腺癌细胞PLD1表达的影响.方法:体外培养人乳腺癌细胞MCF7、MDA-MB-231和小鼠乳腺癌细胞4T1,以人乳腺上皮细胞MCF10A为对照,采用半定量RT-PCR测定PLD1 mRNA表达水平,Western blot法测定PLD1蛋白表达水平,并分别测定不同浓度TP对PLD1及细胞周期素D1(cyclin D1)mRNA和蛋白的表达水平的影响.结果:半定量RT-PCR和Western blot分析均显示,PLD1 mRNA和蛋白在乳腺癌细胞MCF7、MDA-MB-231和4T1中的表达显著高于乳腺上皮细胞MCF10A,其中MDA-MB-231细胞PLD1蛋白表达水平约为MCF10A细胞的20倍.TP抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的同时下调PLD1和cyclin D1表达水平,并且呈一定浓度依赖性.结论:相比乳腺正常上皮细胞,PLD1 mRNA和蛋白在乳腺癌细胞中表达增高,TP抑制乳腺癌细胞增殖的作用机制与其抑制PLD1的表达有关.

长链非编码RNA DLX6-AS1调控微小RNA-15b和磷脂酶D1影响口腔鳞状细胞癌侵袭转移的分子机制研究

目的:探讨长链非编码RNA(long non-coding RNA,lncRNA)生长停滞特异性蛋白6-反义RNA1(growth arrest specific protein 6-antisense RNA1,DLX6-AS1)对口腔鳞状细胞癌(口腔鳞癌)细胞增殖、迁移和侵袭的影响及作用机制。方法:实时荧光定量聚合酶链反应(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测口腔鳞癌组织及癌旁组织中DLX6-AS1、微小RNA-15b(microRNA-15b,miR-15b)和磷脂酶D1(phospholipase D1,PLD1)mRNA的表达水平。转染DLX6-AS1小干扰RNA至口腔鳞癌细胞HSC3,四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法(MTT法)、Transwell小室和Western印迹法(Western blot)检测抑制DLX6-AS1表达对HSC3细胞的增殖、迁移和侵袭能力,以及对p21、基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase 2,MMP-2)和E-钙黏附素(E-cadherin)蛋白表达的影响。分别共转染miR-15b抑制剂或PLD1过表达载体与DLX6-AS1小干扰RNA至HSC3细胞,用上述相同方法观察抑制miR-15b或过表达PLD1对DLX6-AS1表达抑制的HSC3细胞增殖、迁移和侵袭能力,以及对p21、MMP-2和E-cadherin蛋白表达的影响。双荧光素酶报告基因实验验证DLX6-AS1与miR-15b及miR-15b与PLD1的调控关系。结果:与癌旁组织比较,口腔鳞癌组织中DLX6-AS1和PLD1 mRNA表达水平升高(P<0.001),miR-15b表达水平降低(P<0.001)。抑制DLX6-AS1表达可降低HSC3细胞存活率、迁移和侵袭,以及MMP-2的蛋白表达水平(P<0.001),提高p21和E-cadherin蛋白表达水平(P<0.001)。抑制miR-15b表达或过表达PLD1均可降低抑制DLX6-AS1表达对HSC3细胞的存活率、迁移和侵袭及P21、MMP-2和E-cadherin蛋白表达的影响。DLX6-AS1在HSC3细胞中靶向负调控miR-15b,miR-15b靶向负调控PLD1。结论:抑制DLX6-AS1表达可能通过靶向调控miR-15b和PLD1轴抑制口腔鳞癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

磷脂酶D1基因mRNA在前列腺癌细胞雄激素非依赖性转化中的作用分析

目的探讨磷脂酶D1(phospholipase D1,PLD1)mRNA在前列腺癌细胞雄激素非依赖性转化中的作用。方法利用Arraystar Human LncRNA Microarray V3.0基因芯片,比较了前列腺癌标准株细胞LNCa P在发生雄激素非依赖性转化前后的mRNA和lncRNA的差异表达,分析表达显著的PLD1 mRNA及其信号通路的相关基因,检测PLD1 mRNA表达受相应shRNA慢病毒载体抑制后LNCa P细胞增殖能力的改变。结果 LNCa P细胞在雄激素非依赖性转化后其PLD1mRNA升高373倍(P<0.05),PI3K/AKT信号途径的有关mRNA表达升高;在其PLD1 mRNA表达受慢病毒抑制后,与空白对照和阴性对照组比较,其生长率下降了近30%,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 PLD1 mRNA及其有关的PI3K/AKT信号通路在前列腺癌细胞雄激素非依赖性中可能存在重要作用,下调PLD1 mRNA的表达能在一定程度上抑制前列腺癌细胞雄激素非依赖转化后的增殖速度。

拟南芥中H_2S与PLDα1响应干旱胁迫的作用研究

以野生型拟南芥WT、PLDα1合成缺陷突变体pldα1-1以及L-半胱氨酸脱巯基酶(L-cysteine desulfyrase,L-CDes)合成缺陷突变体lcd-4幼苗为材料,以0.3 mol·L^(-1)甘露醇模拟干旱胁迫,研究磷脂酶Dα1(phospholipase Dα1,PLDα1)与气体信号分子硫化氢(hydrogen sulfide,H2S)响应干旱胁迫的作用及可能存在的信号关系。结果显示:干旱胁迫下,野生型拟南芥的H_2S含量、PLD与L/D-CDes活性及其基因相对表达量均发生显著的变化。萌发率实验中,与WT相比,pldα1-1和lcd-4对干旱胁迫更加敏感,外施NaHS可以促进干旱胁迫下WT、pldα1-1以及lcd-4种子萌发及內源H_2S产生,而外施PA能提高干旱胁迫下WT、pldα1-1种子萌发率及H_2S含量,但对lcd-4萌发率及H_2S含量没有显著影响。研究结果表明,信号分子H_2S和PLDα1在拟南芥的干旱胁迫响应中发挥一定的作用,且H_2S可能位于PLDα1的下游参与调控拟南芥种子萌发的信号过程。

分析拟南芥叶片在激素促进的衰老中内源激素变化来解析抑制磷脂酶Dα1延缓激素促进衰老的机制（英文）

采后衰老进程在很大程度上受到内源和外源激素的影响。抑制拟南芥中磷脂酶Dα1(phospholipase Dα1,PLDα1)的表达后,使得外源脱落酸(abscisic acid,ABA)和乙烯加速的离体叶片衰老过程在一定程度上得到了缓解。然而,内源激素在这个过程中的作用尚不清楚。本研究对比分析了野生型和PLDα1缺失型两种基因型拟南芥叶片在3种不同人工老化过程中(离体诱导的、外源ABA和乙烯促进的衰老过程),内源ABA,茉莉酸甲酯(methyl jasmonate,MeJA)、吲哚乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)、玉米素核苷(zeatin riboside,ZR)和赤霉素(gibberellic acid,GA3)的含量变化。这5种激素对3种不同衰老处理方式的响应模式表明了人工老化过程存在着两个不同阶段,并且在衰老早期每种激素的变化模式相同。PLDα1功能缺失使得激素加速的衰老过程得以延缓,这与内源ABA、MeJA、ZR和IAA的含量变化有关,而与GA3的含量变化无关。同时,ZR和IAA的变化模式也说明了这两种激素的变化可能是缺失PLDα1延缓激素加速的衰老过程这一事件的原因而非结果。

磷脂酶Dα1与H2S参与冬凌草甲素对拟南芥的化感作用

以拟南芥哥伦比亚野生型(WT)、磷脂酶Dα1(PLDα1)缺失型突变体pldα1、D-/L-半胱氨酸脱巯基酶(D-/L-CDes)缺失型突变体d-cdes和l-cdes幼苗为试验材料,60μmol·L^-1冬凌草甲素为处理浓度,研究了拟南芥响应二萜类化合物冬凌草甲素的化感作用中磷脂酶Dα1(PLDα1)与气体信号分子硫化氢(H2S)的信号关系。结果表明:冬凌草甲素显著提高了野生型拟南芥幼苗H2S含量、PLD和D-/L-CDes酶的活性及其基因表达;冬凌草甲素处理下,pldα1突变体幼苗的D-CDes和L-CDes活性明显低于WT,外源添加磷脂酸(PA)后D-CDes和L-CDes活性显著提高,并高于WT;冬凌草甲素显著抑制4种株系根的生长,其中d-cdes和l-cdes对冬凌草甲素更加敏感,外施NaHS可以促进冬凌草甲素处理下4种株系根的生长及内源H2S产生,外施PA只对冬凌草甲素处理下的WT、pldα1和l-cdes株系根的生长及内源H2S产生有促进作用,而对d-cdes株系没有明显作用。说明PLDα1和H2S在拟南芥响应冬凌草甲素过程中发挥作用,且PLDα1/PA位于D-CDes上游,参与调控拟南芥幼苗H2S的产生及根生长的信号过程。

水稻磷脂酶Dζ1在盐胁迫反应中的作用

本研究通过生化和分子遗传突变分析发现水稻(Oryza sativa)磷脂酶Dζ1(PLDζ1)参与盐胁迫反应过程。水稻PLDζ1在分蘖期和开花期的叶片中表达量较高,生化分析表明PLDζ1需要磷脂酰肌醇4,5-二磷酸激活,而在PLDα和PLDδ反应条件下的活性极低。PLDζ1缺失突变导致植株对盐胁迫的敏感性增加,在盐胁迫下pldζ1突变体株高和存活率均显著低于野生型(WT),并且pldζ1突变体植株钠离子(Na+)含量显著高于WT,其Na+吸收与转运相关基因HKT1表达量显著高于WT,而Na+流向液泡相关基因NHX1表达量则显著低于WT。这些结果表明水稻PLDζ1参与钠离子转运过程,从而正向调节植株的耐盐性。

雷公藤甲素对乳腺癌细胞增殖的抑制作用

目的探究雷公藤甲素对乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7增殖的抑制作用。方法取培养的乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7,用雷公藤甲素按不同浓度处理24 h后提取细胞蛋白和RNA,用Western blot和RT-PCR来检测磷脂酶D1(PLD1)和c-Myc的表达。结果雷公藤甲素能够抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7的增殖,并且在MDA-MB-231细胞中下调PLD1和c-Myc的表达。结论雷公藤甲素能够抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231及MCF-7的增殖。

基于复杂网络的中医方剂治疗肺癌核心药物及其干预靶点分析

目的探讨中药方剂治疗肺癌的核心药物以及对其作用机制和效应靶点预测。方法通过复杂网络的方法基于近20年文献首先筛选中药方剂中治疗肺癌的主药,再通过中药网络药理学数据库以及TCGA肿瘤全基因组数据库,通过数据挖掘方法探讨预测主药治疗肺癌的机制及关键靶点,并通过大数据高通量全基因组信息观察调节关键靶点对肺癌患者生存期的影响。结果黄芪是肺癌治疗中医方药中的核心主药,不仅使用率最高并且与其他药物的配伍最多,能有效干预磷脂酶D1(phospholipaseD1,PLD1)基因靶点,而PLD1作为特异性基因在肺癌尤其是小细胞肺癌中呈现高表达,调节PLD1的表达可有效提高小细胞肺癌患者的生存率。结论黄芪是肺癌治疗方药中的核心主药,其机制可能是干预PLD1起作用。

MiR-497/PLD1调控机制参与多次七氟醚暴露后新生大鼠认知功能障碍

大量文献报道七氟醚暴露可能对发育期大脑产生神经毒性,七氟醚相关认知功能障碍受到医学界和社会普遍关注。单次、短时间的七氟醚暴露对发育期大脑影响较小,但多次长时间的七氟醚暴露会导致远期认知功能障碍。本研究目的在于探讨miR-497/PLD1在多次七氟醚暴露导致的新生大鼠神经毒性中发挥的作用。方法 本研究采用新生大鼠(PD7)分别在PD7、PD9和PD11接受3%七氟醚暴露,每天2h。莫里斯水迷宫实验测试大鼠认知功能改变,TUNEL试验检测大鼠海马组织神经细胞凋亡情况。然后采用qRT-PCR的方法检测miR-497的表达水平;并通过荧光素酶报告基因实验和免疫印迹的方法验证miR-497与PLD1的直接作用关系。并在经原代神经元细胞中采用miR-497 mimic、miR-497 inhibitor过表达和抑制miR-497的表达后观察细胞中PLD1的表达情况。使用免疫组织化学染色观察PLD1在七氟醚暴露后新生大鼠海马组织中的表达情况。结果 本研究发现多次七氟醚暴露导致海马组织神经细胞凋亡以及新生大鼠远期术后认知功能障碍。miR-497在七氟醚暴露后的大鼠海马组织中表达增高。miR-497通过作用于靶基因的3’-UTR端可以直接抑制PLD1的表达,抑制或过表达原代神经元细胞中miR-497的表达,发现PLD1蛋白表达受到miR-497的调控。而PLD1在多次暴露的新生大鼠海马组织中表达明显降低。结论 miR-497可能通过调控PLD1的表达参与了多次七氟醚暴露后新生大鼠认知障碍的发生。