基于柔性电极和信号放大技术构建检测磷脂酶C的电化学传感器

磷脂酶C(PLC)是动植物中重要的脂质水解酶,在哺乳动物细胞的代谢、生长、炎症、分化、衰老和凋亡中起着重要作用,与许多癌症的发生、发展显著相关。蛋白质催化原子转移自由基聚合(PATRP)是高分子设计、制备的有效手段,可通过链式反应将数百个电活性单体连接成一个高相对分子质量的聚合物链,从而使分子识别信号大大增强。首先,在柔性碳布(CC)电极表面修饰纳米金(AuNPs),之后通过3-巯基丙酸、碳二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺,将PLC的特异性底物磷脂酰乙醇胺(PE)固定在电极上,经过PLC对PE的特异性水解产生磷酸基团,引入Zr^(4+),通过Zr^(4+)的配位作用将聚合引发剂α-溴苯乙酸修饰到电极表面,最后在蛋白质催化作用下进行2,2,6,6-四甲基哌啶氧化物(TEMPO)的PATRP聚合反应,在电极表面引入电活性聚合物分子链,构建信号放大型电化学传感器P(TEMPO)/PE/AuNPs/CC,用于磷脂酶C的高灵敏度检测。结果表明,该传感器检测PLC的线性范围为10~1×10^(5)mU/L,检出限为3.568 mU/L(S/N=3)。与其他检测PLC的方法相比,该传感器具有较宽的检测范围和较低的检出限,且在检测实际乳腺癌细胞中的PLC方面有巨大的实际应用潜力。

响应面法优化新型磷脂酶PLC_MED_(193)大豆油脱胶工艺的研究

利用大肠杆菌工程菌制备大量重磷脂PLC_MED_(193),将其应用于大豆毛油的脱胶过程中,在单因素试验的基础上采用响应面试验,得出磷脂酶用于大豆毛油脱胶的最佳工艺条件,即脱胶温度60℃、加酶量300 U/kg、脱胶pH 5.6、加水量3.0 mL、脱胶时间6 h,在此条件下,脱胶后大豆油的磷含量从36.75 mg/kg降低至(5.25±0.03)mg/kg,磷脂酰胆碱PC和磷脂酰乙醇胺PE含量降低至23 mg/g和20 mg/g,满足后续油脂精炼要求。

磷脂酶C通过抑制T-ALL细胞凋亡发挥促癌作用

目的:探讨磷脂酶C(PLC)家族各成员在急性T淋巴细胞白血病(T-ALL)进展中的作用。方法:泛PLC抑制剂U73122和Edelfosine处理T-ALL细胞,AnnexinV-PE/7-AAD双染法检测细胞凋亡。Cox回归和Kaplan-Meier法分析PLC蛋白对T-ALL患者无事件生存率(EFS)的影响。单因素方差分析PLC在各亚型T-ALL中的表达。构建PLCβ1、PLCγ1、PLCη1siRNA逆转录质粒,HEK-293T细胞包装逆转录病毒感染T-ALL细胞。利用RT-PCR和Westernblot检测基因表达。结果:4种T-ALL细胞系中,P12-ICH和CCRF-CEM对U73122和Edelfosine敏感,Jurkat和MOLT4对其耐药。TARGET-ALL数据库中,PLCβ1、PLCγ1、PLCη1高表达T-ALL患者预后不良,PLCβ1、PLCγ1、PLCη1在T-ALL各亚型中分布不均。在P12-ICH和CCRF-CEM中,PLCβ1、PLCγ1和PLCη1分别维持白血病细胞生存,而在MOLT4中,PLCβ1、PLCγ1和PLCη1对细胞生存无影响。结论:PLCβ1、PLCγ1和PLCη1能维持T-ALL细胞株体外生长,促进T-ALL恶性进展,是潜在的治疗靶点。

磷脂酶C1基因rs2274223位点多态性与下咽癌临床病理特征及预后的相关性分析

目的 探讨磷脂酶C1(phospholipase C1,PLC1)基因rs2274223位点多态性与下咽癌临床病理特征及预后的相关性。方法 收集2016年1月~2022年12月间浙江大学医学院附属金华医院耳鼻咽喉头颈外科收治的42例下咽癌患者,所有患者均行根治手术,记录临床病理数据,并均取全血3 ml作DNA提取,Sanger法测序检测PLCE1基因rs2274223位点单核苷酸多态性,分析其与下咽癌临床病理特征及预后的相关性。结果 PLCE1基因rs2274223位点在42例下咽癌患者中有16例突变为AG,位点突变与肿瘤分化程度相关(χ^(2)=5.301,P=0.021),K-M生存分析提示rs2274223位点突变与未突变的下咽癌患者3年生存率分别为75.0%和83.1%,5年生存率分别为18.8%和31.2%,差异有统计学意义(χ^(2)=5.475,P=0.019)。结论PLCE1基因rs2274223位点突变与下咽癌低分化相关,该位点突变的下咽癌患者预后更差。

整合磷脂酶C基因重组菌产酶条件优化

为提高磷脂酶C的表达量,对发酵产酶条件进行优化以提高其产酶能力。通过对构建的一株Tn7转座子介导的整合磷脂酶C基因重组菌株,采用IPTG诱导发酵表达方法,并结合CCD响应面实验设计方法,对产酶条件进行优化,获得1个二次模型用于描述发酵产酶条件对产磷脂酶C的影响。优化后的最适产酶条件:将菌种以2.52%的接种量接种,同时加入3%乙醇到培养基中,温度保持28℃-30℃,pH6.5-7.5;当菌体浓度OD600达到0.80时,加入终浓度0.1mmol/L IPTG诱导。发酵试验表明,最优产酶条件的比活力为6.22 U/mg,比初始发酵培养基提高2倍。低浓度的甘氨酸对胞外酶的表达有促进作用。

菜籽油磷脂酶C脱胶工艺优化及效果分析

分别研究了柠檬酸添加量、酶加入量、温度、加水量和时间5个单因素对磷脂酶C(PLC)脱胶效果的影响,在单因素基础上,采用响应面试验设计,对主要脱胶工艺参数进行优化,得到最佳条件:柠檬酸添加量5.80m L/kg,加酶量12.60 m L/kg,酶解温度42.20℃,在该条件下验证,菜籽毛油磷含量由693 mg/kg降低至7.85mg/kg。采用棒状薄层色谱-氢火焰离子化检测器(TLC-FID)对毛油与脱胶油中甘油酯含量进行检测,结果表明:脱胶油中甘一酯的含量变化不明显,甘二酯含量从约2.5%增加到约6.5%,而甘三酯的含量从约93%下降到约89%;而同样采用TLC-FID对水化脱胶磷脂与PLC脱胶磷脂中的溶血磷脂进行检测,分析得知,PLC脱胶磷脂中溶血磷脂含量比水化脱胶磷脂中的高出约50%,酶法脱胶的酶解率显著升高。研究结果表明,磷脂酶C脱胶比常规水化脱胶更有效和彻底,可为油脂精炼提供了一定理论参考。

磷脂酶C在酶法脱胶中的研究进展

磷脂酶C(PLC)是一种作用于甘油磷脂C3位上甘油磷酸酯键的脂类水解酶,水解产物为甘油二酯及有机磷酸酯(磷酸胆碱、磷酸乙醇胺或磷酸肌醇等)。应用PLC进行酶法脱胶因具有显著提高毛油精炼率的优点而得到越来越广泛的关注。主要介绍了PLC酶法脱胶的原理、研究进展及PLC酶法脱胶中存在的问题,以期推动PLC酶法脱胶在我国的研究及应用。

四株高产磷脂酶C新菌株的鉴定和分类

在前面研究高产磷脂酶C(PLC)菌株筛选及其抗血小板功能的基础上 ,对新筛选的四株高产PLC的75 4 1、779、970和 110 7菌株进行了鉴定和分类。通过形态特征、培养特征、生理生化特征以及 16SrRNA序列测定及其同源性分析 ,证实 75 4 1菌株与Bacilluscereus基本一致 ,因此将 75 4 1菌株分类属于蜡状芽孢杆菌 ,命名为蜡状芽孢杆菌深圳株 75 4 1,B cereusshenzhen 75 4 1strain。而 779、970和 110 7三株菌则与Bacillusmycoides基本一致 ,因而将这三株菌分类属于蕈状芽孢杆菌 ,分别命名为蕈状芽孢杆菌深圳株 779,B mycoidesshenzhen 779strain ,蕈状芽孢杆菌深圳株 970 ,B mycoidesshenzhen 970strain ,和蕈状芽孢杆菌深圳株 110 7,B mycoidesshenzhen 110 7strain。这将为进一步利用这些菌株及其PLC打下坚实的基础。

磷脂酶C用于大豆油脱胶的工艺优化

用磷脂酶C对大豆毛油进行实验室模拟脱胶。研究了pH、反应温度、加水量、加酶量、反应时间、搅拌速度对大豆毛油脱胶效果的影响,采用正交试验对脱胶工艺条件进行优化。结果表明,大豆毛油脱胶最佳工艺条件为:加酶量30 mg/kg,反应温度50℃,反应时间1 h,pH 5.0,加水量2%,搅拌速度200 r/min。在此条件下得到的脱胶大豆油磷含量为17.8 mg/kg,为大豆油酶法脱胶开辟了新途径。

磷脂酶Cε基因在膀胱移行细胞癌中表达及其临床意义

目的探讨磷脂酶Cε(phospholipase Cε,PLCε)基因在膀胱移行细胞癌表达及临床意义。方法采用逆转录PCR(RT-PCR)方法检测27例膀胱移行细胞癌和12例正常膀胱对照组中PLCε mRNA表达,分析其与膀胱病理学特征的关系。结果PLCε mRNA在膀胱移行细胞癌的表达显著高于正常膀胱组织(P<0.01),PLCε的表达和膀胱移行细胞癌分期有关(P<0.05)而与分级无关(P>0.05)。结论PLCε基因在膀胱移行细胞癌组织中呈高表达,可能是未来检测膀胱移行细胞癌一种新的有价值的肿瘤标志物,同时也可能成为膀胱肿瘤生物学治疗中一个新靶点。

大肠杆菌重组表达磷脂酶C的发酵工艺优化

以重组表达铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa 41磷脂酶C的大肠杆菌BL21(DE3)/pET28a-plcH为考察菌株,从TB培养基出发,在优化缓冲液、碳源种类和质量浓度的基础上,比较异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)、乳糖诱导重组酶表达的效果,并考察甘氨酸对重组酶发酵的影响;最后,在7L发酵罐规模对上述优化工艺进行放大验证。结果表明:重组大肠杆菌最适培养基组成为:蛋白胨12g/L、酵母膏24g/L、甘油5g/L,0.25mol/L Tris-HCl(pH7.2～7.4)缓冲液配制;在此培养基中添加卡那霉素(Kana)的质量浓度至0.15mg/mL,37℃、200r/min培养6h后,添加乳糖至终质量浓度为5g/L,在25℃、150r/min诱导培养20 h,重组磷脂酶C活力可达到(1422.42±37.17)U/mL;7L发酵罐实验中,总酶活力达到(11583.35±70.21)U/mL,比摇瓶条件下提高了7倍左右,其中胞内酶活力最高为(10957.97±58.03)U/mL,胞外酶活力最高为(645.27±13.87)U/mL。

产气荚膜梭菌磷脂酶C的重组表达及其脱胶应用

将产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)磷脂酶C(Cp-PLC)基因在大肠杆菌BL21(DE3)中进行了重组表达,并对重组Cp-PLC表达条件进行了优化。结果表明:当菌体生长至OD600为1.0时,添加8 g/L乳糖在30℃下诱导32 h,得到的重组Cp-PLC的酶活最大,为398.35 U/mL;重组Cp-PLC用于菜籽毛油脱胶的最佳条件为温度57℃、pH 5.0、加酶量600 U/kg、反应时间1.5 h;在最佳条件下,菜籽毛油的磷含量可降至5.66 mg/kg,能够满足物理精炼的要求。

桃磷酸肌醇特异性磷脂酶C基因家族鉴定与分析

为了对桃(Prunus persica var.Lovell)中PI-PLC家族基因进行系统分析,利用桃基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定桃PI-PLC家族基因的基因结构、染色体定位和编码蛋白,通过序列比对进行进化和分类分析。结果表明,桃中含有5个PI-PLC家族基因,预测他们均含有9个外显子,分布于桃的2条染色体上。保守结构域分析结果显示,桃中PI-PLC蛋白均含有4个保守的EF、X、Y和C2结构域。进化树分析结果表明桃PI-PLC家族基因可分为4个亚家族。

杨树磷酸肌醇特异性磷脂酶C基因家族鉴定与分析

为了对已测序杨树Populus trichocarpa Torr.＆Gray中磷酸肌醇特异性磷脂酶C（phosphoinositidespecific phospholipase C,PI-PLC）家族基因进行系统分析,利用杨树基因组数据库,通过生物信息学手段,鉴定杨树PI-PLC家族基因的基因结构、染色体定位和编码蛋白,通过蛋白序列比对进行进化和分类分析。结果表明,杨树中含有7个PI-PLC家族基因,含有8-10个外显子,分布于杨树的4条染色体上。MEME和Pfam保守结构域分析显示,杨树PI-PLC蛋白均含有4个保守的EF、X、Y和C2结构域。蛋白质进化树分析结果表明PI-PLC可分为2个亚家族。

“环境-遗传-基因互作”模式中磷脂酶Cε1对食管癌易感性的影响

随着全基因组关联分析(genome-wide association study,GWAS)和后GWAS研究的深入,越来越多的疾病相关单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)被发现。近年的研究[1-3]提示,部分疾病相关SNP可导致其所在基因以及相关基因转录和蛋白表达水平发生变化,进一步影响肿瘤的发生和发展,甚至影响肿瘤的转归(预后),这些发现极大丰富了“环境-遗传-基因互作”模式对肿瘤发生、发展和转归影响的新理论;这些SNP可分为增加疾病易感性的SNP和致病性SNP两大类。推测致病性SNP不但影响相关基因的转录和蛋白表达,并且也可能影响驱动基因突变。

重组磷脂酶C的研究

磷脂酶C是一类磷脂酰键的水解酶,在生物生命活动中起着第二信使的重要作用,能够抑制血小板的聚集作用,存在于原核生物和真核生物中,尤其是细菌中产生的磷脂酶C可以模拟真核生物中的作用而受到关注。该文叙述了磷脂酶C的克隆和表达、重构的工程菌株及重组磷脂酶C的纯化制备。同时,还简介了作者的研究,重组磷脂酶C可能进一步研究制成Ⅰ类抗血小板聚集作用新药。

中国美利奴绵羊磷脂酶C zeta基因真核表达载体的构建及其表达研究

旨在构建PLCζ真核表达载体,初步研究其在体细胞系中的表达特性。本研究用PCR技术扩增出PLCζ基因片段,克隆至载体pEGFP-N1,鉴定无误后,将构建了重组质粒pEGFP-N1-PLCζ转染293T细胞和绵羊成纤维细胞,在倒置荧光显微镜和激光扫描共聚焦显微镜下观察重组质粒在细胞中的表达和分布。经酶切与测序证明,本试验成功的构建了pEGFP-N1-PLCζ真核表达载体,并且成功与绿色荧光蛋白融合表达。本试验实现了pEGFP-N1-PLCζ在绵羊胎儿成纤维细胞中的表达,这将有利于进一步通过核移植来研究其重组蛋白对卵母细胞的激活作用。

单增李斯特氏菌磷脂酶C(lm-plcB)基因的克隆表达及其在油脂脱胶中的应用

在大肠杆菌中克隆表达单增李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)磷脂酶C,并进行发酵优化。当接种量为4%时,37℃,200 r/min培养2 h后添加2.5 g/L乳糖,25℃摇瓶诱导发酵26 h,最终获得重组磷脂酶C的活力达到754.6 U/mL。利用该重组磷脂酶C对大豆毛油和菜籽毛油进行脱胶,精炼油中的含磷量分别从216.67mg/kg和183.70 mg/kg下降到3.70 mg/kg和4.50 mg/kg,说明该重组磷脂酶C能够用于不同植物毛油脱胶,可以达到后续精炼工艺要求,同时增加毛油精炼率,在油脂脱胶工艺方面具有较大的应用前景。

5-HT_2受体-磷脂酶C的激活易化大鼠基底外侧杏仁核突触可塑性的研究

为了探讨5-HT2受体激动剂盐酸2,5-二甲氧基-4-碘苯基丙烷(DOI)对杏仁核突触可塑性的调节作用,本研究在杏仁核脑片上记录基底外侧杏仁核(BLA)场电位,应用单串的θ频率波刺激(TBS)诱导突触可塑性,观察DOI对TBS诱导的突触可塑性的影响,及5-HT2受体拮抗剂、磷脂酶C抑制剂能否抑制DOI的作用。结果显示:单串的TBS刺激外囊,在BLA仅诱导约为10min的短时程增强。灌流液中加入100μmol/L DOI 20min,对基础的场电位没有作用。但在DOI存在的情况下,单串的TBS即可诱导长时程增强,强直刺激30min后,增强的场电位斜率仍维持在基础值的(162.5±9.7)%(n=9,P<0.01)。DOI对TBS诱导的突触可塑性的易化作用可被5-HT2A/2C受体拮抗剂ketanserin和PLC抑制剂U73122所抑制。以上结果提示5-HT2A/2C受体的激活可通过磷脂酶C通路易化杏仁核的突触可塑性。

磷脂酶C特异性抑制剂U-73122对玉米大斑病菌分生孢子萌发及毒素活性的影响

磷脂酶C(Phospholipase C,PLC)通过降解细胞膜上的磷脂分子产生IP3和DAG两个第二信使分子,分别激活下游的Ca2+途径和蛋白激酶C。研究表明,PLC与植物病原真菌的致病及发育过程有关。利用PLC特异性抑制剂U-73122初步研究了玉米大斑病菌PLC的功能。结果显示,U-73122对玉米大斑病菌菌丝生长及分生孢子的萌发均具有明显的抑制作用,且抑制率随抑制剂浓度升高而增强;并且可引起芽管的缩短和不规则膨大。此外,U-73122也可以导致病菌粗毒素的生物学活性明显降低。由此说明PLC可以通过影响菌丝及芽管的极性生长,而调控玉米大斑病菌的菌丝及分生孢子发育;同时参与病菌的毒素合成。