HPLC检测人重组组织因子脂化物磷脂含量

利用脂质体技术制备凝血酶原时间测定试剂人重组组织因子脂化物,建立高效液相色谱(HPLC)方法用于同时分析人重组组织因子脂化物中的主要成分磷脂酰丝氨酸(DOPS),磷脂酰胆碱(DOPC),以及人重组组织因子(TF)的半定量测定。分析测定条件:色谱柱:Waters Symmetry300 C4色谱柱(150×4.6 mm,5μm,300),流动相甲醇水,梯度洗脱,流速1 mL·min^(-1),柱温:30℃,检测波长210 nm,DOPS保留时间12.275 min,TF保留时间15.4 min,DOPC保留时间18.917 min。研究发现,采用建立的分析方法,DOPS在1.875~15 mg·mL^(-1)的浓度范围内呈良好的线性关系(R 2=0.9974),检出限为1.875 mg·mL^(-1)(S/N=3);DOPC在4.375~35 mg·mL^(-1)浓度范围内线性关系(R 2=0.9993)良好,检出限为4.375 mg·mL^(-1)(S/N=3)。在结合多次制备的人重组组织因子脂化物的产品测试中,该方法也表现出了良好的稳定性和精密度。总之,该方法可同时测定脂化物成分组成,并具有良好的检测效果,可为化妆品、制药和食品补充剂行业提供理想的参考价值。

重组磷脂酶C的研究

磷脂酶C是一类磷脂酰键的水解酶,在生物生命活动中起着第二信使的重要作用,能够抑制血小板的聚集作用,存在于原核生物和真核生物中,尤其是细菌中产生的磷脂酶C可以模拟真核生物中的作用而受到关注。该文叙述了磷脂酶C的克隆和表达、重构的工程菌株及重组磷脂酶C的纯化制备。同时,还简介了作者的研究,重组磷脂酶C可能进一步研究制成Ⅰ类抗血小板聚集作用新药。

重组平颏海蛇磷脂酶A_2对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响

目的:观察重组平颏海蛇磷脂酶A2(rPLA2)对离体大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响。方法:体外培养大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞,采用MTS/PES法确定血管平滑肌细胞的增殖状态。应用流式细胞术测定细胞周期。结果:各组的细胞增殖率分别为对照组(0.781±0.463);rPLA2100mg·L-1组(0.415±0.205);rPLA210mg·L-1(0.942±0.258);rPLA21mg·L-1组(1.005±0.350),,其中高剂量rPLA2100mg·L-1组与对照组相比细胞增殖率有显著差异(P<0.05);低剂量rPLA210mg·L-1和rPLA21mg·L-1组与对照组相比均无显著差异(P>0.05)。流式细胞术测定的结果显示rPLA2100mg·L-1组可以使VSMC大部分处于G0/G1期,与对照组相比有明显差异(P<0.01)。结论:重组平颏海蛇磷脂酶A2对大鼠血管平滑肌细胞增殖有一定的抑制作用。

重组人血小板型磷脂酶A_2杀菌作用的研究

目的 探讨利用基因工程制备重组人血小板型磷脂酶A2 (phospholipaseA2 ,PLA2 )对不同细菌在体外的杀菌作用 ,为临床用于治疗细菌感染提供依据。方法 将不同浓度的重组PLA2 或抗生素与不同的菌株在 37℃共同孵育 2h ,然后铺琼脂板 ,次日记录每一琼脂板上的菌落生成数 (CFU) ,计算出PLA2 作用后细菌生存率和杀灭 95 %细菌 (LD95)的PLA2 浓度。结果 重组人血小板型PLA2 对金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌等革兰阳性 (G+)菌有较强杀菌作用 ,PLA2 的LD95的范围在 6～ 4 0 0ng/ml之间 ,对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)也有较强的作用 ,LD95为 4 0 0ng/ml。结论 重组人血小板型PLA2 对革兰阳菌有较强的杀菌作用 。

人重组钙依赖性磷脂结合蛋白Ⅴ在大肠杆菌中的高效表达、纯化及细胞凋亡检测

目的 :为细胞凋亡研究提供快速可靠的实验方法。方法 :利用RT PCR技术从人外周血单核细胞系U937cDNA文库中扩增出编码钙依赖性磷脂结合蛋白Ⅴ (AnnexinⅤ )cDNA ,并克隆到大肠杆菌表达载体中 ,在大肠杆菌中表达含凝血酶识别序列的MS2AnnexinⅤ融合蛋白。表达产物经凝血酶消化 ,可除去MS2细菌蛋白 ,再经离子交换层析纯化 ,可得成熟的AnnexinⅤ纯品 ,FITC标记后的AnnexinⅤ可用于细胞凋亡的检测。结果 :在大肠杆菌表达的人重组AnnexinⅤ占菌体蛋白的 5 6 % ,经纯化获得 99%纯度的非融合型AnnexinⅤ ,FITC标记的An nexinⅤ能有效地检测凋亡细胞。结论 :成功地建立了批量获取AnnexinⅤ的技术路线 。

重组人血小板型磷脂酶A_2在杀菌过程中与抗菌药的相互作用

目的 研究重组人血小板型磷脂酶 A2 (PL A2 )在杀菌过程中与常用抗菌药间相互作用关系 ,为临床用药提供依据 ,并探讨其杀菌机制。方法 将重组人血小板型 PL A2 和抗菌药分别单独以及联合作用于金黄色葡萄球菌 ,通过测定细菌菌落数来评价杀菌效果。结果 青霉素、头孢拉定、磷霉素、万古霉素增强血小板型 PL A2 杀菌活性 ;红霉素减弱血小板型 PL A2 杀菌活性 ;氧氟沙星对血小板型 PL A2 杀菌作用无影响。结论 血小板型 PL A2与破坏细胞壁的杀菌类药物有协同作用 ,与抑菌类药物合用受到拮抗 ;细菌细胞壁的结构及其生长状态是影响血小板型 PL A2

重组平颏海蛇磷脂酶A_2抑制晚期糖基化终产物诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖

目的观察重组平颏海蛇磷脂酶A2(rPLA2)对晚期糖基化终产物(AGEs)刺激下离体大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞增殖的影响。方法体外培养大鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMCs),应用不同浓度的AGEs分别刺激VSMCs并设立对照组进行比较,采用非放射性的MTS/PES法确定血管平滑肌细胞的增殖状态。结果与对照组相比,AGEs对VSM-Cs增殖具有明显的刺激作用(P<0.05)。在AGEs刺激下,rPLA2可明显抑制VSMCs的生长(0.753±0.098 vs. 1.100±0.226, P<0.05)。结论rPLA2可抑制晚期糖基化终产物诱导的血管平滑肌细胞增殖。

低浓度肝素对重组人血小板型磷脂酶A_2杀菌活性的抑制

目的 :研究肝素对重组人血小板型磷脂酶 A2 (PL A2 )杀菌活性的影响 ,探讨血小板型 PL A2 电荷性质在其杀菌机制中的作用。方法 :将金黄色葡萄球菌与重组人血小板型 PL A2 共同孵育 ,试验组加入肝素 ,通过测定细菌菌落数来评价杀菌效果。结果 :低浓度肝素对重组人血小板型 PL A2 杀菌功能有明显抑制作用 ,仅 0 .0 30 0 U / ml的肝素其杀菌抑制率达 10 0 %。结论 :1血小板型 PL A2 的正电荷性在其杀菌作用中是关键因素 ;2肝素是血小板型 PL A2 一种有效的抑制剂。

重组人磷脂酰肌醇3-激酶p110β催化亚基的原核表达

目的 :表达人磷脂酰肌醇 3 激酶p110 β催化亚基。 方法 :将构建有人磷脂酰肌醇 3 激酶 (phosphatidylinositol 3 kinase ,PI 3 K) p110 β催化亚基cDNA的重组质粒 ,转化大肠杆菌BL 2 1(DE3 ) ,用IPTG进行诱导表达。用磷脂酰肌醇 4、5 二磷酸、[γ 3 2 P]ATP与重组PI 3 K p110 β催化亚基一起保温的方法测定PI 3 K的活性 ;3 2 P标记的磷脂用氯仿和甲醇抽提、板薄层层析和放射自显影来分析。结果 :SDS PAGE显示表达出一 110kD的新蛋白质分子 ,重组蛋白占菌体总蛋白的比例为 15 % ,大多数重组蛋白以可溶性形式存在。wortmannin是PI 3 K特异的抑制剂 ,wortmannin对重组PI 3 K p110 β亚基有抑制作用 ,这种抑制作用呈剂量依赖关系 ( 2 .5～ 2 0nmo1/L)。结论 :重组蛋白是有活性的人PI 3 K p110 β催化亚基。

重组人磷脂酶D2在体内能明显抑制慢性哮喘豚鼠血清中GPI-PLD的表达(英文)

通过建立慢性豚鼠哮喘模型,研究重组人磷脂酶D2(rhPLD2)干预慢性哮喘豚鼠血清中糖基化磷脂酰肌醇特异性磷脂酶D(GPI-PLD)含量的变化,探寻可能的机制.以rhPLD2干预慢性哮喘豚鼠,用TX-114分相法检测豚鼠血清中GPI-PLD酶活性.与正常状态豚鼠相比较,慢性哮喘状态豚鼠其血清中GPI-PLD酶活性显著升高.但以rhPLD2及地塞米松干预慢性哮喘豚鼠后,该指标显著下降.rhPLD2可通过抑制其血清中GPI-PLD酶活性表达,来抑制哮喘发生过程中的炎症反应.

重组海蛇碱性磷脂酶A_2的抗肿瘤活性与相对酶活性的关系

背景与目的:蛇毒磷脂酶A2(snakevenomphospholipaseA2,SVPLA2)是一类分子量为14ku左右的蛋白家族,除了酶活性,该蛋白还具有多种药理活性。迄今,陆地蛇PLA2的结构与功能关系特别是其酶活性与药理活性的关系已被广泛研究,但对海蛇PLA2的研究则较少。本文旨在研究重组平颏海蛇碱性磷脂酶A2(recombinantseasnakebasicphospholipaseA2,rSSBPLA2)及其突变体(rN48和rK49)体内外抗肿瘤作用,并探讨酶活性相关位点对抑瘤作用的影响。方法:对酶活性相关位点48、49位氨基酸进行His→Asn和Asp→Lys的定点突变,用MTT法检测rSSBPLA2及其突变体rN48和rK49对人原髓白血病细胞HL-60、人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH、人胃癌细胞MGC-803和人肝癌细胞HepG2的生长抑制作用;用小鼠S180移植瘤和艾氏腹水癌(EAC)模型对rSSBPLA2进行抗肿瘤作用观察;并检测突变体对小鼠移植瘤的抗瘤活性。结果:与rSSBPLA2相比较,突变体rN48和rK49的相对酶活力分别为0和5%。rSSBPLA2对HL-60细胞、SK-N-SH细胞和MGC-803细胞的IC50值分别为(45.28±0.09)μg/ml、(57.07±0.12)μg/ml和(69.34±0.35)μg/ml,对HepG2细胞生长没有抑制作用;而rN48和rK49对以上细胞均无抑制作用。rSSBPLA2对小鼠S180移植瘤具有明显的抑制作用,按2mg/kg(qd×10)、2mg/kg(q2d×5)、4mg/kg(qd×1)、4mg/kg(q5d×2)实验给药,其抑瘤率分别为50.8%、43.2%、38.2%、55.5%;rSSBPLA2按4mg/kg(q5d×2)剂量给药时,对EAC抑瘤率为33.5%,与对照组比较均有显著性差异(P<0.01)。而突变体rN48和rK49分别按4mg/kg(q2d×5)和7mg/kg(qd×10)方案进行实验,无明显抗肿瘤作用。结论:rSSBPLA2的抑瘤活性可能与其酶活性密切相关。

重组人磷脂爬行酶1的原核表达及纯化

目的:建立重组人磷脂爬行酶1(hPLSCR1)原核表达及纯化工艺。方法:PCR扩增hPLSCR1编码基因并连接到原核表达载体pET-28a,转化大肠杆菌BL21(DE3)并进行诱导表达,Western印迹鉴定所表达蛋白;优化表达条件后,Ni2+柱亲和层析纯化重组蛋白。结果:构建了pET-28a-PLSCR1重组质粒,诱导表达后,经SDS-PAGE分析目的蛋白的表达量达32%,Ni2+金属螯合法纯化目的蛋白后纯度达到95%以上,Western印迹验证了融合蛋白的特异性。结论:建立了高效稳定的His-PLSCR1表达体系,获得大规模生产His-PLSCR1的分离纯化工艺,为进一步研究其蛋白功能奠定了基础。

不含氨基端的人磷脂酶D2在大肠杆菌中的表达及其抗炎活性研究(英文)

目的研究重组人磷脂酶D2(rhPLD2)在体内外的免疫学活性,尤其是研究其抗炎活性。方法将编码rh-PLD2的cDNA片段经RT-PCR克隆至pET-30a载体中,并纯化来自包涵体中由大肠杆菌表达的rhPLD2重组蛋白。通过测定豚鼠慢性哮喘模型的支气管肺泡灌洗液(BALF)和血液中嗜酸性粒细胞的数量及肺组织中IL-5、MMP-9的表达来评定rhPLD2重组蛋白的抗炎活性。结果从人Daudi细胞中获得了不含膜结合部位及信号肽的,可编码631个氨基酸的rh-PLD2 cDNA序列(GenBank登录号:AY178289)。rhPLD2重组蛋白的纯度约76%,其生物活性达到50.9745U/L(0.9212g/L)。用rhPLD2治疗慢性哮喘动物模型证实了其的抗炎功效。包括:能下调炎性细胞因子IL-5的表达。结论由大肠杆菌表达的rhPLD2重组蛋白具有抗炎活性。

重组人血小板型PLA_2体外抗菌活性研究

目的观察重组人血小板型磷脂酶A2（PLA2）的体外抗菌活性。方法将不同浓度的重组PLA2与9种细菌在37％共同孵育2h，然后倾注琼脂板，次日记录每一琼脂板上的菌落生成数（CFU），计算出PLA2杀菌率和PLA2的最低杀菌浓度（MBC）。结果重组人血小板型PLA2对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、炭疽杆菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌等革兰氏阳性（G^＋）菌有较强杀菌作用，作用2h后PLA2的MBC范围为0．015～0．240μg／ml。对大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌等革兰氏阴性（G^-）菌则需要较高浓度的血小板型PLA2，作用2h后的MBC为30～90μg／ml。结论血小板型PLA2对G^＋菌有较强的杀菌作用，对G^＋菌的杀菌作用较弱。

脂对泛醌细胞色素c还原酶的影响

用羟基磷灰石柱亲和层析法制备了高纯度的缺脂泛醌细胞色素ｃ还原酶．脂的缺失使该酶活力丢失，部分细胞色素（约５２．８％细胞色素ｂ和８２．５％细胞色素Ｃ１）呈现还原状态．将缺脂泛醌细胞色素。还原酶与磷脂重组，可恢复其活性，同时那些呈还原状态的细胞色素也恢复到氧化态此结果表明如此制备的缺脂泛醌细胞色素ｃ还原酶仍保持着活力所必需的构象状态。

重组人血小板型磷脂酶A_2对耐药菌的杀菌作用与耐药性诱导

目的探讨重组人血小板型磷脂酶A2（PLA2）的对临床分离耐药菌株的杀菌作用及其细菌耐药性，为开发新型抗菌蛋白提供重要信息。方法将不同浓度的血小板型PLA2与细菌在37℃共同孵育2h，然后加入营养琼脂平皿中，37℃培养18～20h，计每一琼脂板上的菌落形成数（CFU），计算出血小板型PLA2杀菌率；根据耐药性诱导试验，用PLA2诱导金黄色葡萄球菌，观察细菌耐药性。结果血小板型PLA2对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌的标准菌株与耐药菌株均同样具有较强的杀灭作用，对3种标准菌株的最低杀菌浓度（MBC）分别为0．81、0．1、0．2μg／ml，对耐药菌株的MBC为0．1～0．3μg／ml；连续三代诱导未见引起金黄色葡萄球菌耐药。结论血小板型PLA2对耐药的革兰阳性菌有较强的杀菌作用，其不易引起金黄色葡萄球菌耐药。

磷脂化重组人铜锌超氧化物歧化酶修饰率的测定

目的建立磷脂化重组人铜锌超氧化物歧化酶（PC-SOD）中蛋白和胆碱含量的测定方法,并计算PC-SOD的修饰率。方法采用凯氏定氮法,即通过测定供试品的总氮含量及经钨酸沉淀去除蛋白质的供试品滤液中的非蛋白氮含量,计算PC-SOD蛋白氮含量,并验证方法的准确性和重复性;应用磷脂C检测试剂盒,经碱水解显色法检测PCSOD的胆碱含量,并验证方法的准确性和重复性。通过PC-SOD中的蛋白氮和胆碱含量计算其修饰率。同时采用该方法对3批PC-SOD供试样品进行检测。结果凯氏定氮法的回收率为95%-105%,RSD为0.59%;碱水解显色法的回收率为95%-105%,RSD为1.65%。3批PC-SOD供试样品的修饰率分别为4.46、4.33和4.28。结论该方法操作简便,具有良好的准确性及重复性,可用于PC-SOD修饰率的检测。