磷蛋白32高表达人胶质瘤细胞株U251加入替莫唑胺、H_2O_2、乙醇后的增殖活性变化及其机制

目的观察磷蛋白32(pp32)高表达人胶质瘤细胞株U251加入替莫唑胺、H_2O_2、乙醇后的增殖活性变化,并探讨其可能机制。方法 pp32慢病毒转染U251细胞株,嘌呤霉素筛选pp32高/低表达稳定细胞株。其中,pp32高表达慢病毒稳转染的U251细胞作为32A组,pp32高表达阴性对照慢病毒稳转染的U251细胞作为32A-C组,pp32干扰慢病毒稳转染的U251细胞作为siA组,pp32干扰阴性对照慢病毒稳转染的U251细胞作为siA-C组;未经转染的U251细胞作为NC组。分别将100μg/mL替莫唑胺、0.15 mmol/mL H_2O_2以及600 mmol/mL乙醇加入上述各组U251细胞0、12、24 h,采用CCK-8实验检测细胞光密度值(OD值,代表细胞增殖活性);上述药物加入U251细胞24 h,采用免疫细胞化学染色法检测增殖细胞核抗原(PCNA)(反映细胞增殖活性)。取正常U251细胞株,加入0、50 ng/mL人pp32重组蛋白后,分别采用免疫细胞化学染色及Western blotting法检测该细胞内人类抗原R(HuR)蛋白。结果成功建立了pp32高/低表达U251细胞株。与0、12 h相比,分别加入TMZ、H_2O_2、乙醇24 h,U251细胞OD值降低(P均<0.05);分别加入TMZ、H_2O_2、乙醇24 h,与NC、32A-C组比较,32A组细胞OD值升高,PCNA蛋白相对表达量增加(P均<0.05);与NC、siA-C组比较,siA组细胞OD值降低,PCNA蛋白相对表达量减少(P均<0.05)。与未加入人pp32重组蛋白比较,加入人重组pp32蛋白后,U251细胞中HuR蛋白细胞核中的表达减少,细胞质中的表达增多;加入人重组pp32蛋白后,U251细胞质中的HuR蛋白相对表达量高于未加入人重组pp32蛋白(P<0.05),整体细胞中HuR蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论 pp32蛋白可使人胶质瘤细胞株U251替莫唑胺、H_2O_2、乙醇作用后的增殖活性增强,其作用可能与促进HuR从细胞核向细胞质转移有关。

酸性核磷蛋白32A表达在结直肠癌肝转移中的临床意义

为探讨酸性核磷蛋白32A(ANP32A)的表达与结直肠癌肝转移的相关性,选取本院收治的结直肠癌162例。其中肝转移35例设为转移组,无肝转移127例设为无转移组。采用免疫组织化学SP法检测ANP32A在结直肠癌与癌旁组织中的表达水平,分析ANP32A表达与结直肠癌肝转移的相关性。结果显示,癌组织中ANP32A阳性表达率高于癌旁组织(P<0.05),肝转移组ANP32A阳性表达率高于无肝转移组(P<0.05)。单因素分析显示肿瘤浸润深度、肿瘤分化程度、淋巴结转移、CEA、CA199和ANP32A高表达与结直肠癌肝转移密切相关(P<0.05),多因素Logistic回归分析显示区域淋巴结转移、CEA、CA199和ANP32A表达为结直肠癌肝转移的独立危险因素(P<0.05)。结果表明,ANP32A在结直肠癌组织中呈高表达,与结直肠癌肝转移密切相关。

新的犬ANP32A的克隆及其在流感病毒跨物种感染中的作用

物种特异的酸性核磷蛋白32A(acidic nuclear phosphoprotein 32A,ANP32A)调节不同宿主A型流感病毒RNA聚合酶活性。为分析犬ANP32A(canine ANP32A,caANP32A)的物种特异性及其在流感病毒跨物种感染中的作用,利用RT-PCR方法从MDCK细胞以及犬肺、脾、肠不同组织中扩增和克隆caANP32A;激光共聚焦试验分析caANP32A与A型流感病毒RNA聚合酶的相互作用;双荧光素酶报告基因试验检测过表达caANP32A对A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响。结果显示,从MDCK细胞中扩增到新的caANP32A,比已报道的caANP32A多出4个氨基酸插入,从犬肺、脾和肠组织中均扩增到该新的caANP32A;对caANP32A的基因进行测序分析,发现该新的caANP32A不是由mRNA选择性剪接形成的;激光共聚焦试验发现,新caANP32A与H3N2 CIV的RNA聚合酶在细胞核中共定位;聚合酶活性试验显示,在哺乳动物细胞过表达新caANP32A不能促进H9N2禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)和H3N2犬流感病毒(canine influenza virus,CIV)的RNA聚合酶活性,而鸡ANP32A(chANP32A)能够促进。本研究克隆的新caANP32A较以往报道,在176至179位存在四个氨基酸LSLV的插入,但新caANP32A对AIV的RNA聚合酶活性仍然有物种限制性且该新的caANP32A也未增强CIV的RNA聚合酶活性。本研究为进一步解析犬在流感病毒跨物种感染中的作用提供依据。

酸性富含亮氨酸的核磷蛋白32家族成员A对心肌细胞肥大的影响及机制研究

目的探讨酸性富含亮氨酸的核磷蛋白32家族成员A(Anp32a)对心肌细胞肥大的作用及机制。方法通过挖掘数据库小鼠心脏假手术组及主动脉缩窄手术组芯片数据,进行差异基因分析。选取8~10周龄小鼠,随机分为模型组和假手术组(n=7或8),终末取材提取心脏组织RNA检测Anp32amRNA表达水平。构建Anp32a敲低(AdshAnp32a),Anp32a过表达(AdAnp32a)及其相应的对照组AdshRNA,AdGFP腺病毒并转染H9C2心肌细胞,以血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激H9C2心肌细胞诱导心肌细胞肥大,提取细胞RNA通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测心肌肥厚指标[心房利钠肽(AnP),脑利钠肽(Bnp),β-肌球蛋白重链(β-Mhc)]表达变化,并通过心肌细胞骨架蛋白(α-actinin)的免疫荧光染色观察Anp32a对心肌细胞大小的影响。机制研究方面,通过蛋白免疫印迹(Western blot)检测Anp32a在调节心肌肥厚过程中涉及的信号通路的变化。结果 Anp32a在心肌肥厚模型中表达下调。AngⅡ刺激细胞,免疫荧光染色检测AdAnp32a组细胞明显较其对照组(AdGFP)减小,而AdshAnp32a组心肌细胞与其对照组(AdshRNA)相比显著增大。qPCR检测显示AdAnp32a组心肌肥厚基因(Anp、Bnp、β-Mhc)的mRNA表达降低,而AdshAnp32a组表达则相反。Western blot检测发现Anp32a能够抑制AngII诱导的Akt蛋白磷酸化水平的升高。结论 Anp32a通过AKT信号通路抑制心肌细胞肥大,可作为防治心肌肥厚及心力衰竭的潜在治疗靶点。

壳聚糖修饰左旋多巴纳米脂质体对异动症大鼠行为学及多巴胺和环磷腺苷调节的磷酸化蛋白32磷酸化水平的影响

背景:左旋多巴是目前治疗帕金森病最主要的药物,但是长期应用后大多数患者会出现异动症等难以控制的运动并发症。目的:观察左旋多巴与纳米脂质体诱发异动症大鼠模型的行为学特点和纹状体区多巴胺和环磷腺苷调节的磷酸化蛋白32蛋白磷酸化状态的改变。方法:建立6-羟多巴胺偏侧毁损致帕金森病大鼠模型,25只成功造模大鼠随机分为3组,帕金森病生理盐水组(n=5),一般左旋多巴组(n=10),壳聚糖修饰的左旋多巴纳米脂质体组(n=10),分别予以生理盐水、卡比多巴和左旋多巴、壳聚糖修饰的左旋多巴纳米脂质体治疗4周。结果与结论:在行为学观察中,异常不自主运动评分在脂质体组与一般左旋多巴组皆随治疗时间延长而升高,但脂质体组评分明显低于一般左旋多巴组(P<0.05);纹状体区多巴胺和环磷腺苷调节的磷酸化蛋白32的Thr-34位点磷酸化水平在一般左旋多巴组及脂质体组较对照组均明显升高(P<0.05),但脂质体组升高水平明显低于一般左旋多巴组(P<0.05)。提示壳聚糖修饰的左旋多巴纳米脂质体在防治帕金森病异动症方面可能有效。

雄黄主要成分As_(2)S_(2)通过“ANP32A-INHAT-H3乙酰化”轴抑制三阴性乳腺癌细胞增殖、迁移的表观遗传调控机制

目的探究雄黄主要成分二硫化二砷(As_(2)S_(2))对三阴性乳腺癌(triple negative breast cancer,TNBC)的作用及表观遗传调控机制。方法采用CCK-8、平板克隆形成和细胞划痕实验探究As_(2)S_(2)对人正常乳腺上皮细胞MCF-10A及TNBC细胞增殖和迁移的影响;4D-label free定量蛋白质组学分析挖掘As_(2)S_(2)抗TNBC的潜在干预靶点酸性核磷蛋白家族成员32A(acidic nuclear phosphoprotein family member 32A,ANP32A);慢病毒感染法构建ANP32A过表达敲低细胞株,探究潜在靶点ANP32A对As_(2)S_(2)抗TNBC作用的影响;蛋白质免疫共沉淀和Western blot实验探究As_(2)S_(2)是否通过ANP32A调控TNBC细胞H3乙酰化。结果As_(2)S_(2)对人正常乳腺上皮细胞MCF-10A影响甚微,但显著抑制TNBC细胞增殖和迁移,且呈剂量依赖性;4D-lable free定量蛋白质组学分析结果显示,促癌因子ANP32A被As_(2)S_(2)显著下调,且ANP32A表达影响As_(2)S_(2)在TNBC中的抗增殖和迁移效果。As_(2)S_(2)能下调ANP32A的蛋白水平,抑制乙酰转移酶抑制剂复合物亚基的招募,增加H3乙酰化水平。结论As_(2)S_(2)通过下调ANP32A蛋白调控TNBC细胞中H3乙酰化,抑制TNBC细胞增殖和迁移。

犬ANP32蛋白多态性及其对A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响

【目的】探索犬酸性核磷蛋白32(canis acidic(leucine-rich)nuclear phosphoprotein 32 ku,caANP32)对不同物种A型流感病毒(Influenza A virus,IAV)RNA聚合酶活性的影响。【方法】利用实时荧光定量PCR方法分析caANP32家族基因(caANP32A、caANP32B及caANP32E)的组织分布并对其进行扩增和克隆,评估caANP32家族蛋白对不同物种A型流感病毒RNA聚合酶活性的支持作用。【结果】caANP32家族基因在不同组织中分布相似,其中caANP32B基因组织丰度显著或极显著高于caANP32A和caANP32E基因(P<0.05;P<0.01),在心脏、盲肠和大脑中caANP32E基因组织丰度极显著或显著高于caANP32A基因(P<0.01;P<0.05),在肝脏、肺脏等组织中caANP32E与caANP32A基因丰度均无显著差异(P>0.05)。在犬心脏组织和MDCK细胞中发现,caANP32A基因仅存在1个转录本,caANP32B基因存在3个不同剪接变体:caANP32B_X1、caANP32B_X2和caANP32B_X3;caANP32E基因具有2个不同剪接变体:caANP32E_X1和caANP32E_X2。通过分析ANP32家族蛋白对不同物种A型流感病毒RNA聚合酶活性的影响发现,caANP32A和caANP32B均能支持犬流感病毒(H3N2_(GD11))和马流感病毒(H3N8_(JL89))RNA聚合酶活性,而对禽流感病毒(H9N2_(ZJ12))RNA聚合酶活性支持较低。caANP32B_X2剪接变体对哺乳动物流感病毒RNA聚合酶活性的支持能力显著高于caANP32B_X1和caANP32B_X3(P<0.05);而caANP32E不支持A型流感病毒RNA聚合酶活性。【结论】本研究初步解析了caANP32家族蛋白的组织分布及序列多态性,阐明了其对不同物种A型流感病毒RNA聚合酶活性的支持作用,为解析MDCK细胞作为流感病毒分离和疫苗生产细胞系的分子机制提供了新的借鉴。

ANP32A对结肠癌细胞增殖的影响及机制研究

目的探讨酸性核磷蛋白32A(ANP32A)对结肠癌细胞增殖的影响及相关机制。方法利用生物信息学分析结肠癌组织中ANP32A mRNA水平及其与患者预后的关系。在DLD-1和HCT-116细胞中构建稳定沉默ANP32A的慢病毒细胞系,并用CCK-8和集落形成实验检测细胞增殖能力。采用瞬时转染的方法将myc-ANP32A质粒转入DLD-1和HCT-116细胞,并用CCK-8和集落形成实验检测细胞增殖能力。利用实时荧光定量PCR(qPCR)和Western blot检测ANP32A对高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达的影响。利用Western blot检测ANP32A对细胞外调节蛋白激酶(ERK)通路的影响。最后在沉默ANP32A的细胞中转入flag-HMGB1质粒,并利用Western blot、CCK-8检测ERK通路的蛋白水平和结肠癌细胞的增殖能力。结果结肠癌组织中ANP32A mRNA高表达,ANP32A mRNA高表达的结肠癌患者预后较差。沉默ANP32A可以减弱结肠癌细胞的增殖能力,过表达ANP32A可以增强结肠癌细胞增殖能力。ANP32A可以增强HMGB1的转录进而促进其蛋白表达。ANP32A可以通过HMGB1激活ERK信号通路进而促进结肠癌细胞增殖。结论ANP32A在结肠癌中高表达,通过调控HMGB1转录增强其蛋白表达,并激活ERK通路促进结肠癌细胞增殖。

DARPP-32磷酸化与止颤汤改善大鼠帕金森病运动并发症的研究

目的观察纹状体多巴胺和环磷腺苷调节的磷酸化蛋白-32(DARPP-32)(Thr34)磷酸化与止颤汤对大鼠帕金森病运动并发症的影响。方法采用6-羟基多巴胺(6-OHDA)注射于大鼠脑部黑质造成帕金森病(PD)模型,进一步予以左旋多巴/苄丝肼腹腔注射制作异动症(LID)模型。实验设立正常组,LID模型组,LID西药组及小剂量中药组、中剂量中药组、大剂量中药组,并采用免疫组化法观察各组大鼠DARPP-32(Thr34)磷酸化的表达情况。结果免疫组化显示,假手术组DARPP-32(Thr34)磷酸化表达明显低于模型组(P<0.01)。中药小剂量组、中剂量组、大剂量组DARPP-32磷酸化表达与西药组表达比较,差异有统计学意义(P<0.05);中剂量组磷酸化与小剂量组比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论止颤汤可有效降低纹状体DARPP-32(Thr34)磷酸化的表达,可能是止颤汤治疗异动症的机制。

恩他卡朋对异动症大鼠行为学及其纹状体区DARPP-32磷酸化表达的影响

目的:研究左旋多巴/卡比多巴与左旋多巴/卡比多巴/恩他卡朋诱发异动症模型大鼠的行为学特点,以及纹状体区多巴胺和环磷腺苷调节的磷酸化蛋白-32(DARPP-32)磷酸化状态的改变。方法:成功建立的帕金森病模型大鼠29只随机分为4组:生理盐水组(NS)5只,左旋多巴/卡比多巴组(LC)8只,恩他卡朋等效剂量组(LCE)8只,恩他卡朋额外添加组(LCE+)8只。分别予以相应药物灌胃,共给药28 d。开始灌胃后的第1、4、8、12、16、20、24、27 d进行行为学观察。通过western blot检测纹状体区DARPP-32磷酸化水平。结果:LCE组AIM评分为(21.7±10.2)分,LC组AIM评分为(22.2±11.1)分,差异无统计学意义(P>0.05);且2组各时间点AIM评分差异无统计学意义(P>0.05)。LCE+组AIM评分为(28.6±14.9)分,高于LCE组和LC组(均P<0.05);自第8天起,LCE+组AIM评分开始高于LC组和LCE组(均P<0.05)。LCE组、LCE+组与LC组毁损侧DARPP-32磷酸化水平均高于各组健侧水平(均P<0.05);LCE+组毁损侧DARPP-32磷酸化水平高于NS组、LCE组和LC组毁损侧(均P<0.05),LCE组和LC组毁损侧DARPP-32磷酸化水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:在等效剂量水平下添加恩他卡朋作为左旋多巴添加治疗不会增加或减少异动症发生。

ANP32A对神经系统功能调节作用的研究进展

酸性核磷蛋白32A(ANP32A)由1个球形的富含亮氨酸重复序列(LRRs)的氨基端和1个伸展的富含酸性氨基酸的羧基端组成,其在细胞增殖、凋亡、转录调控、信号转导和细胞内物质运输等多种重要生命过程中发挥作用。近年研究发现,ANP32A与多种神经系统疾病的发生、发展有关。ANP32A参与神经系统的发育并可调控神经元分化;其过表达可导致tau蛋白高磷酸化,促进阿尔茨海默病的发生;其能保护神经元免于兴奋性毒性损伤;其可通过影响PP2A通路在1型脊髓小脑共济失调中发挥作用。