基于磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶信号通路,浅谈中医药治疗慢传输型便秘的研究进展

慢传输型便秘(Slow Transit Constipation,STC)是一种慢性功能性肠病,其主要特征为结肠传导动力不足,结肠传输速度缓慢,致肠内容物排出时间延长,淤积于肠道,不能顺畅排出体外。STC的病因及发病的机制复杂,目前尚无统一定论,大多数观点认为STC的病因及发病机制与Cajal间质细胞功能异常、水通道蛋白异常表达、肠神经功能病变、胃肠神经递质的异常分泌、肠道微生态紊乱及精神心理障碍等有关。近年来,细胞信号转导通路的异常改变,导致细胞信号转导通路下游的相关分子及蛋白的异常表达导致STC的发病,逐渐引起广大临床学者的关注。基于细胞信号转导通路,探讨STC的研究逐渐增多。大量研究表明,中医药治疗STC具有层次多、靶点丰富且通路广泛的优势,并且临床疗效显著。其中的机制也引起广大临床研究者的好奇。磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/内皮型一氧化氮合酶(Endothelial Nitric Oxide Synthase,eNOS)细胞信号转导通路是近年来中医药治疗STC研究的热点通路之一。故文章基于PI3K/Akt/eNOS细胞信号转导通路,探讨中医药治疗STC的研究进展,以期为厘清STC的病因及发病机制提供些许理论支撑,为中医药治疗STC提供现代理论支持,为后期开展更深层次的STC的研究作铺垫。

有氧运动联合抗阻力运动对糖尿病大鼠血管内皮功能的作用及其对磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶通路的影响

目的探讨有氧运动联合抗阻力运动对糖尿病大鼠血管内皮功能及对磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/一氧化氮合酶(PI3K/Akt/eNOS)通路的影响。方法将SD大鼠随机分为对照组(NC)、糖尿病模型组(DM)、单纯有氧运动训练组(AE)、单纯抗阻力运动训练组(RE)及有氧运动+抗阻力运动训练组(ARE),检测各组内皮功能指标、PI3K/Akt/eNOS通路基因及蛋白表达情况。结果乙酰胆碱(Ach)浓度在3×10^(-5) mol/L时,ARE组舒张率高于AE组和RE组(P<0.05)。ARE组VEGF、一氧化氮(NO)表达量高于DM组[(21.45±3.48)vs(8.23±1.14)pg/ml,(25.67±3.19)vs(8.89±1.56)μmol/L,P<0.05]。ARE组PI3K、Akt及eNOS基因相对表达量高于DM组[(4.08±0.83)vs(0.27±0.11),(2.75±0.69)vs(0.26±0.09),(4.25±0.74)vs(0.59±0.19),P<0.05]。ARE组PI3K、磷酸化Akt(p-Akt)及磷酸化eNOS(p-eNOS)蛋白相对表达量高于DM组[(0.78±0.21)vs(0.20±0.09),(1.21±0.38)vs(0.54±0.19),(0.59±0.23)vs(0.16±0.08),P<0.05]。结论有氧运动联合抗阻力运动能改善糖尿病大鼠血管舒张功能,促进VEGF、NO的释放,作用与激活PI3K/Akt/eNOS信号通路有关。

磷脂酰肌醇-3-激酶／丝氨酸苏氨酸蛋白激酶／内皮型一氧化氮合酶信号通路在二氮嗪后处理缺血／再灌注大鼠心肌中的作用

目的研究磷脂酰肌醇-3-激酶，丝氨酸苏氨酸蛋白激酶／内皮型一氧化氮合酶（phosphatidylinositol-3-kiHase／protein serine threonine kinase／endothelial nitric oxide synthase，P13K／Akt／eNOS）信号通路在二氮嗪后处理大鼠在体心肌缺血/再灌注（ischemia／reperfusion，I／R）损伤中的作用。方法40只雄性sD大鼠完全随机分为5组，每组8只：假手术组（s组）、I／R组、二氮嗪组（D组）、P13K抑制剂渥蔓菁霉素组（w组）和二氮嗪＋渥蔓菁霉素组（DW组）。结扎左冠状动脉前降支30min、再开放120min，建立在体心肌I／R损伤模型，s组不结扎。再灌注5min前，5组依次分别经股静脉输入0．1％二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）1ml／kg、0．1％DMSO 1ml／kg、二氮嗪7mg/μg、渥蔓菁霉素15μg／kg，DW组于输入二氮嗪前5min输入渥蔓菁霉素；所有药物均输注15min。再灌注末，测定血浆心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I，cTnI）浓度，苏木精咿红（HE）染色观察心肌病理变化，免疫组化分析eNOS的表达情况。结果与s组比较，其余4组cTnI显著增高（JP如．01），心肌明显损伤，eNOS表达增高（P〈0．05或P〈0．01）.与I／R组比较，D组和DW组cTnI[（36．5±5．2）μg/L与（44．5±4．5）μg/L vs（64．7±11．1）μg／L]明显降低（P〈0．01），心肌病理改变减轻，eNOS表达增高[（0．515±0．136）％与（0．394±0．100）％VS（0．241±0．077）％]（P〈0．01）。与D组比较，DW组cTnI明显增高[（44．5±4．5）μg/L VS（36．5±5．2）μg/L]（P〈O．05），心肌损伤加重，eNOS表达降低[（0．394±0．100）％VS（0．515±0．136）％]（P〈0．01）。结论二氮嗪后处理减轻大鼠心肌I／R损伤的作用部分与P13K／Akt／eNOS信号通路激活有关。

β受体激动增加人脐静脉内皮细胞内皮型一氧化氮合酶活性的细胞内机制

背景:β-肾上腺素能受体激动可增加内皮型一氧化氮合酶活性的细胞信号转导通路,对于揭示β-肾上腺素能系统调控血管张力的生理学机制有重要价值,既往实验显示异丙肾上腺素激活内皮型一氧化氮合酶与内皮型一氧化氮合酶蛋白磷酸化有关。目的:探讨β-肾上腺素能受体激动增加人脐静脉内皮细胞内皮型一氧化氮合酶活性信号转导通路中可能涉及的蛋白激酶。设计:对比观察。单位:郑州大学第一附属医院老年病科。材料:实验于2006-09/2007-06在河南省高等学校临床医学重点学科开放实验室完成。实验材料为郑州大学第一附属医院妇产科住院的健康顺产或剖宫产患者自愿捐献的新生儿无血肿、夹痕的脐带。所有患者对实验均知情同意,实验方案经医院伦理委员会批准。主要试剂:β-肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素、磷脂酰肌醇3激酶抑制剂(Wortmannin)、蛋白激酶A抑制剂(H-89)、3H-L-arginine(美国SIGMA公司)。方法:设置空白对照组、H-89组、Wortmannin组及H-89+Wortmannin组,每组因素下再分异丙肾上腺素及空白对照两个干预因素组,每小组三复管。观察H-89和Wortmannin分别与人脐静脉内皮细胞孵育10min,再与异丙肾上腺素孵育30min后内皮型一氧化氮合酶活性变化。同位素二步色谱法测定3H-L-citrulline的产量反映内皮型一氧化氮合酶活性。人脐静脉内皮细胞上3H-L-citrulline的产量相对空白对照组以百分比形式表达。主要观察指标:各组内皮型一氧化氮合酶活性变化。结果:①内皮型一氧化氮合酶基础活性为每微克蛋白(3085.62±272.72)mBq,与空白对照组比较,异丙肾上腺素可明显增加内皮型一氧化氮合酶活性(30.72±3.91)%(P<0.001),单纯H-89及Wortmannin不改变内皮型一氧化氮合酶基础活性(0.44±1.00)%,(0.36±1.47)%(P>0.05)。②预先加入H-89及Wortmannin后再加入异丙肾上腺素,可见异丙肾上腺素增加内皮型一氧化氮合酶活性的作用受到明显抑制(4.73±2.19)%,(17.35±3.72)%(P<0.001)。③联合阻断蛋白激酶A和磷脂酰肌醇3激酶对异丙肾上腺素增加内皮型一氧化氮合酶活性的抑制作用(4.92±0.99)%,与单纯阻断蛋白激酶A的作用类似,无累加效应(P>0.05)。结论:β-肾上腺素能受体激动剂异丙肾上腺素能激活内皮型一氧化氮合酶活性的信号通路,在此过程中蛋白激酶A及磷脂酰肌醇3激酶均有参与。

磷酸二酯酶抑制剂对乳鼠心肌细胞PI3K-Akt-eNOS信号通路的影响

目的:探讨西洛他唑(Cilostazol)对乳鼠心肌细胞PI3K-Akt-eNOS信号通路的影响。方法:观察西洛他唑对乳鼠心肌细胞NO影响的时效和量效关系,再用PI3K及eNOS抑制剂进行干预。检测NO的浓度,Western免疫印迹法检测总Akt、磷酸化Akt(p-Akt-Ser473)及总eNOS、磷酸化eNOS(p-eNOS-Ser1177)表达水平。结果:西洛他唑升高心肌细胞NO浓度呈剂量和时间依赖性,不同浓度的西洛他唑均能升高Akt和eNOS磷酸化水平,但对Akt及eNOS总蛋白表达无明显影响。eNOS抑制剂L-NAME和PI3K抑制剂Wortmannin均能抑制西洛他唑诱导的NO浓度升高,Wortmannin还能阻断西洛他唑诱导的Akt和eNOS的磷酸化。结论:西洛他唑可能激活乳鼠心肌细胞的PI3K-Akt-eNOS信号通路而促进NO的产生。

黄芪多糖对2型糖尿病患者外周血内皮祖细胞PI3K/Akt/eNOS信号通路的影响

背景:前期研究证实黄芪通过P38MAPK通路促进内皮祖细胞增殖,其影响是否通过PI3K/Akt/eNOS途径实现?目的:观察黄芪多糖对2型糖尿病患者外周血内皮祖细胞蛋白激酶B、内皮型一氧化氮合酶表达的影响。方法:采用密度梯度离心法获取糖尿病患者外周血单个核细胞,培养7d后鉴定内皮祖细胞。观察0,50,200,800,3200,6400mg/L黄芪多糖分别干预6,12,24,48h对内皮祖细胞影响的量效和时效关系;用黄芪多糖及黄芪多糖与PI3K抑制剂LY294002联合干预糖尿病患者内皮祖细胞,Western blot检测磷酸化Akt及磷酸化内皮型一氧化氮合酶的表达水平。以未进行任何处理健康人内皮祖细胞作为对照组。结果与结论:糖尿病患者内皮祖细胞的增殖能力较对照组明显下降(P<0.05)。黄芪多糖显著增加糖尿病患者内皮祖细胞的增殖能力,当黄芪多糖在200～800mg/L质量浓度范围,干预6～24h可呈时间及剂量依赖性增强内皮祖细胞的增殖能力(P<0.01),并呈剂量依赖性升高内皮祖细胞磷酸化Akt及磷酸化内皮型一氧化氮合酶的表达(P<0.05);PI3K抑制剂LY294002能阻断黄芪多糖诱导的Akt、内皮型一氧化氮合酶的磷酸化(P<0.05)。说明黄芪多糖通过激活PI3K/Akt/eNOS信号通路促进内皮祖细胞增殖和向内皮细胞的分化。

PI3K-Akt-eNOS信号通路在三磷酸腺苷后处理减轻兔心肌缺血再灌注损伤中的作用

目的:探讨磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(PI3K-Akt-eNOS)信号通路在三磷酸腺苷(ATP)后处理减轻兔心肌缺血再灌注损伤中的作用。方法:建立兔心肌缺血再灌注模型,随机将动物分为4组:即缺血再灌注组(对照组)、ATP后处理组、磷酯酰肌醇-3激酶抑制剂(Wortmannin)+ATP后处理组(Wortmannin+ATP组)、线粒体ATP依赖性钾通道抑制剂5-羟葵酸(5-HD)+ATP后处理组(5-HD+ATP组)。再灌注结束后,苏木素伊红染色法观察心肌病理组织变化、TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数,免疫组化方法检测心肌Bcl-2、Bax蛋白表达、Bcl-2/Bax比值及磷酸化eNOS(p-eNOS)蛋白表达。结果 :ATP后处理组心肌细胞核变小及细胞间质水肿程度较对照组明显减轻,Wortmannin+ATP组和5-HD+ATP组心肌细胞核大小及细胞间质水肿程度与对照组相似;ATP后处理组与对照组比较,心肌细胞凋亡指数明显减低,抗凋亡因子Bcl-2表达及Bcl-2/Bax比值升高,差异均有统计学意义(P<0.01);Wortmannin+ATP组和5-HD+ATP组心肌细胞凋亡指数、Bcl-2/Bax比值与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05);p-eNOS蛋白阳性表达ATP后处理组较对照组和Wortmannin+ATP组显著增高,差异有统计学意义(P<0.01),与5-HD+ATP组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论 :ATP后处理可能通过激活PI3K-Akt-eNOS信号通路最终作用于线粒体ATP依赖性钾通道,减少细胞凋亡,减轻兔缺血再灌注损伤。

罗格列酮对人脐静脉内皮细胞NO和PI3K/PKB/eNOS信号通路的影响

目的:观察罗格列酮对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)一氧化氮(nitric oxide,NO)浓度和内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、磷脂酰肌醇-3激酶(phosphatidylinositol3-kinase,PI3K)和蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)表达的影响,探讨罗格列酮改善内皮功能的信号转导机制。方法:首先观察罗格列酮对内皮细胞NO影响的时效和量效关系,然后加用eNOS和PKB信号阻断剂进行干预。用Griess重氮化反应法检测NO浓度,RT-PCR方法检测PI3K,PKB及eNOS mRNA的表达,Western免疫印迹方法检测PKB,eNOS总蛋白和PKB丝氨酸473(PKB-Ser473),eNOS丝氨酸1177(eNOS-Ser1177)的磷酸化表达。结果:罗格列酮呈剂量和时间依赖性地升高内皮细胞NO浓度,不同浓度的罗格列酮培养内皮细胞均能升高PI3K mRNA表达和PKB-Ser473,eNOS-Ser1177磷酸化,但对PKB和eNOS表达均无影响;eNOS阻断剂L-NAME能完全阻断罗格列酮培养的内皮细胞NO浓度的升高,PI3K阻断剂LY294002能阻断罗格列酮诱导的NO产生和PKB,eNOS的磷酸化。结论:罗格列酮能通过激活PI3K/PKB/eNOS信号通路而增强内皮细胞NO的浓度,改善内皮功能。

Z-没药甾酮通过激活PI3K/AKT/eNOS通路发挥脑微血管内皮细胞保护作用

目的:探讨Z-没药甾酮(Z-GS)对大鼠脑微血管内皮细胞的保护作用及药理机制。方法:脑微血管内皮细胞制作氧糖剥夺模型体外模拟缺血性脑卒中,培养的脑微血管内皮细胞分为对照组、模型组、 Z-GS低、中、高(12.5,25,50μmol·L^(-1))剂量组。给药组细胞在OGD造模前分别给予不同剂量的Z-GS处理。在机制研究中,50μmol·L^(-1) Z-GS+抑制剂组在造模给药前加入PI3K抑制剂LY294002。试剂盒检测细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)释放和血管活性物质水平;免疫印迹分析磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)蛋白表达及磷酸化水平;LY294002用于特异性抑制PI3K表达。结果:Z-GS给药可提高细胞活力、降低LDH释放。同时Z-GS可通过降低内皮素-1和血栓素B2水平、升高血栓调节蛋白和6-酮-前列环素1α水平缓解血瘀。机制研究表明,Z-GS给药可激活PI3K/AKT/eNOS通路,增加一氧化氮(NO)的生成。而在LY294002特异性抑制PI3K后,Z-GS对该通路的调控作用消失。结论:Z-GS可通过调控血管活性物质发挥血管内皮保护作用,其机制与激活PI3K/AKT/eNOS通路,进而促进NO的生成有关。

PI3K-Akt-eNOS信号通路在间歇性低氧减轻大鼠心肌缺血/再灌注损伤中的作用

目的探讨间隙性低氧环境下,磷酯酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶信号通路(PI3K-Akte NOS)在大鼠心肌缺血/再灌注损伤中的作用机制。方法 64只大鼠随机分为4组,假手术组(n=16)、缺血/再灌注组(n=16)、缺血/再灌注组-间歇性低氧组(n=16)、间歇性低氧-缺血/再灌注-磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂组(n=16)。采用球囊结扎冠状动脉方法制作心肌缺血再灌注动物模型,将老鼠暴露在低氧循环制作间隙性低氧动物模型,实验处理结束后,通过TUNEL法检测心肌细胞凋亡指数,Western-Blot方法检测磷酸化AKT蛋白(p-Akt)、磷酸化e NOS(p-e NOS)蛋白表达。结果与缺血/再灌注组比较,间歇性低氧+缺血/再灌注组心肌细胞凋亡指数为(21.73±4.56)%,心肌细胞凋亡指数减少,磷酸化AKt蛋白及磷酸化e NOS蛋白分别为(1.228±0.269)、(1.427±0.375),表达均升高,各组差异均有统计学意义(P<0.05);与间歇性低氧+缺血/再灌注组比较,间歇性低氧-缺血/再灌注组大鼠+磷脂酰肌醇3-激酶抑制剂组大鼠心肌为(30.84±3.65),凋亡指数升高,磷酸化AKt蛋白及磷酸化e NOS蛋白分别为(0.624±0.146)、(0.842±0.246),表达均降低,各组差异均有统计学意义(P<0.05)。结论在间歇性低氧状态下,PI3K-Akt-e NOS信号通路可以减少心肌细胞凋亡,在心肌缺血/再灌注损伤中具有保护机制。

化瘀通便汤对慢传输型便秘大鼠PI3K/Akt/eNOS信号通路及血管活性肽的影响

目的:研究化瘀通便汤对磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(PI3K/Akt/eNOS)信号通路及血管活性肽(VIP)的影响,探讨该方药对慢传输型便秘大鼠的治疗机制。方法:90只大鼠随机抽取15只为正常组,其余75只按复方地芬诺酯灌胃造模法制造慢传输型便秘模型,根据简单随机抽样方法分为5组(模型组、化瘀通便汤低剂量组、化瘀通便汤中剂量组、化瘀通便汤高剂量组、麻仁软胶囊组),每组15只。化瘀通便汤低、中、高剂量组分别予化瘀通便汤24 g/(kg·d)、48 g/(kg·d)、96 g/(kg·d)灌胃。麻仁软胶囊组用常温蒸馏水调配麻仁软胶囊至2.4 g/mL,灌胃量为20 mL/(kg·d)。模型组与正常组均与等量常温蒸馏水进行灌胃,日1次。各组干预2周后,检测大鼠首次排黑便时间、粪便含水率及结肠组织磷酸化蛋白激酶B(P-Akt)阳性细胞、VIP、一氧化氮(NO)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)水平。结果:与模型组比较,化瘀通便汤各组及麻仁软胶囊组均能缩短大鼠首次排黑便时间,增加大鼠粪便含水率,提高大鼠结肠组织P-Akt含量、P-Akt阳性细胞水平,降低VIP的表达,降低结肠组织中NO及eNOS的含量(P<0.05);与麻仁软胶囊组比较,化瘀通便汤低剂量组与麻仁软胶囊组相近(P>0.05),化瘀通便汤中、高剂量组明显优于麻仁软胶囊组(P<0.05)。结论:化瘀通便汤可通过调控PI3K/Akt/eNOS信号通路及VIP表达,对慢传输型便秘大鼠起治疗作用。

秋水仙碱通过激动PI3K/AKT/eNOS信号通路对急性心肌梗死大鼠心功能的影响

目的:探究秋水仙碱通过调节磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路对急性心肌梗死(AMI)大鼠心功能的影响。方法:78只大鼠中随机选取12只作为假手术组,剩余大鼠构建AMI模型,造模成功大鼠分为模型组、秋水仙碱组[4 mg/(kg·d)]、秋水仙碱[4 mg/(kg·d)]+LY294002(20 mg/mL)组、秋水仙碱[4 mg/(kg·d)]+MK-2206(60μg/mL)组、秋水仙碱[4 mg/(kg·d)]+L-NAME(1.6 mg/mL)组,每组12只。超声心动图检测大鼠左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、射血分数(EF)及短轴缩短率(FS)。处死大鼠,苏木素-伊红(HE)染色检测大鼠心肌组织石蜡切片病理学变化;末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测心肌细胞凋亡率;酶联免疫吸附实验(ELISA)测定大鼠血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)以及心肌组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)水平;免疫印迹法(Western Blot)测定大鼠心肌组织PI3K/AKT/eNOS通路蛋白表达。结果:与假手术组相比,模型组大鼠LVESD、LVEDD,血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平,心肌匀浆MDA、心肌细胞凋亡率升高,EF、FS水平,心肌匀浆SOD、CAT,心肌组织磷酸化PI3K(p-PI3K)/PI3K、磷酸化AKT(p-AKT)/AKT、磷酸化eNOS(p-eNOS)/eNOS降低(P<0.05);与模型组相比,秋水仙碱组大鼠LVESD、LVEDD,血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平,心肌匀浆MDA、心肌细胞凋亡率降低,EF、FS水平,心肌匀浆SOD、CAT,心肌组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS升高(P<0.05);与秋水仙碱组相比,秋水仙碱+LY294002组、秋水仙碱+MK-2206组、秋水仙碱+L-NAME组大鼠LVESD、LVEDD,血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平,心肌匀浆MDA、心肌细胞凋亡率升高,EF、FS水平,心肌匀浆SOD、CAT,心肌组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS降低(P<0.05)。结论:秋水仙碱可能通过激活PI3K/AKT/eNOS信号通路对AMI大鼠发挥心功能保护作用。

当归挥发油对自发性高血压大鼠血管内皮相关信号通路PI3K/Akt/eNOS的影响

目的研究当归挥发油对自发性高血压大鼠血压、胸主动脉血管内皮组织中PI3K、AKT、p-AKT、eNOS、p-eNOS蛋白表达水平的影响,并探讨其相关机制。方法将自发性高血压大鼠随机分为模型组、缬沙坦组、当归挥发油低、中、高剂量组,每组6只;6只同周龄SPF级Wistar大鼠做为正常对照组。缬沙坦组以每日缬沙坦8mg/Kg灌胃,当归低、中、高剂量组每天分别给予当归挥发油0.1ml、0.2ml、0.4ml,与1%、3%、9%的当归挥发油乳剂2.0ml/(kg·d)剂量相当,模型组和正常对照组大鼠分别给予等量蒸馏水灌胃,连续给药4周。采用无创血压检测系统测定给药前及给药后1周、2周、3周、4周各组大鼠的尾动脉收缩压;给药4周后麻醉大鼠,在4℃下分离胸主动脉;通过Western Blot法检测当归挥发油对大鼠胸主动脉血管内皮PI3K、AKT、p-AKT、eNOS、p-eNOS蛋白表达量的变化。结果给药4周后,当归挥发油低剂量组、当归挥发油中剂量组、当归挥发油高剂量组、缬沙坦组大鼠收缩压均低于模型组,差异有统计学意义(P<0.05);Western blot实验结果显示,与模型组比较,当归挥发油低剂量组大鼠AKT、eNOS蛋白表达水平明显上调(P<0.05),PI3K、p-AKT、p-eNOS蛋白表达水平无明显改变(P>0.05);当归挥发油中剂量组大鼠AKT、p-AKT、eNOS、p-eNOS蛋白表达水平明显上调(P<0.05),PI3K蛋白表达水平无明显改变(P>0.05);当归挥发油高剂量组大鼠PI3K、AKT、p-AKT、eNOS、p-eNOS蛋白表达水平明显上调(P<0.05)。结论当归挥发油具有一定的降压作用,其可能是通过调节PI3K/Akt/eNOS信号通路实现降压的。

肾上腺髓质素对肾肿瘤细胞PI3K/Akt/eNOS/VEGF信号通路的作用

目的研究肾上腺髓质素(ADM)对肾肿瘤细胞磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/内皮型一氧化氮合酶(e NOS)/血管内皮生长因子(VEGF)信号通路的影响。方法将肾肿瘤细胞分为对照组、ADM组、VEGF组,ADM+VEGF受体抑制剂组,ADM+ADM shRNA组,每组设置24 h、48 h、72 h 3个时间梯度,western-blot检测对照组和ADM组细胞总蛋白中PI3K、Akt、e NOS、VEGF表达;检测VEGF组,ADM+VEGF受体抑制剂组和ADM+ADM shRNA组细胞总蛋白中PI3K、Akt、e NOS的表达。结果 PI3K、Akt、e NOS、VEGF在ADM组各时间梯度组肾肿瘤细胞中表达明显高于其在对照组细胞的表达(P<0.05)。PI3K、Akt、e NOS在VEGF组和ADM+VEGF受体抑制剂组各时间组肾肿瘤细胞中表达明显高于其在对照组细胞中表达(P<0.05)。PI3K、Akt、e NOS在ADM+ADM shRNA组各时间组肾肿瘤细胞中表达与其在对照组细胞中表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论 ADM可激活PI3K/Akt/e NOS/VEGF信号通路;VEGF受体抑制剂不能阻断ADM激活PI3K/Akt/e NOS信号通路。ADM一方面通过VEGF发挥肾肿瘤血管生成作用,另一方面通过其受体激活PI3K/Akt/e NOS信号通路参与肾肿瘤血管生成作用。ADM可能成为抗血管治疗肾肿瘤新的靶点。

瑞芬太尼通过激活PI3K/Akt/eNOS通路减轻肾缺血/再灌注损伤

目的探讨术中应用瑞芬太尼对肾缺血/再灌注损伤的作用及机制。方法取雄性C57/BL小鼠50只,随机分为5组:假手术组、缺血/再灌注损伤组(I/R组)、缺血/再灌注损伤+磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂LY294002处理组(I/R+LY294002组)、缺血/再灌注损伤+瑞芬太尼处理组(I/R+RF组)、缺血/再灌注损伤+LY294002处理+瑞芬太尼处理组(I/R+RF+LY294002组),每组10只。各组大鼠分别于手术结束6 h后取静脉血或肾脏组织,采用全自动生化分析仪测定静脉血尿素氮(BUN)、血肌酐(SCr)水平,采用蛋白质印迹法检测肾脏组织PI3K/蛋白激酶B(Akt)/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)通路相关蛋白的表达,H-E染色观察肾脏组织炎症细胞聚集情况,酶联免疫吸附试验测定肾脏组织中肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-10等炎性因子的表达,实时定量PCR测定肾脏组织中抗凋亡因子Bcl2和凋亡因子半胱氨酸蛋白酶3(Caspase-3)的mRNA表达。结果与假手术组相比,I/R组小鼠静脉血BUN、SCr水平均升高,肾脏组织中PI3K表达及磷酸化Akt(p-Akt)/Akt、磷酸化eNOS(p-eNOS)/eNOS均降低,炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10释放均增加,Bcl2 mRNA表达下降而Caspase-3 mRNA表达增高,差异均有统计学意义(P均<0.05),并且肾脏组织中炎症细胞聚集增多。给予瑞芬太尼处理后,I/R+RF组BUN、SCr水平较I/R组降低,肾脏组织中PI3K表达及p-Akt/Akt、p-eNOS/eNOS均增高,TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10释放均减少,Bcl2 mRNA表达上调、Caspase-3 mRNA表达下调,与I/R组相比差异均有统计学意义(P均<0.05),炎症细胞募集也减轻。而使用PI3K抑制剂LY294002处理后,I/R+RF+LY294002组BUN、SCr水平升高,肾脏组织中p-eNOS/eNOS降低,IL-1β、L-6释放增加,Caspase-3 mRNA表达上调,与I/R+RF组相比差异均有统计学意义(P均<0.05),炎症细胞募集也增加。结论肾缺血/再灌注损伤时,瑞芬太尼通过激活PI3K/Akt/eNOS通路减轻肾脏组织炎症反应和细胞凋亡发挥肾脏保护作用。

黄芪甲苷调节PI3K/AKT/eNOS信号通路对糖尿病大鼠皮肤缺损的影响

目的:探究黄芪甲苷通过调控3-磷酸肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路对糖尿病大鼠皮肤损伤的影响。方法:36只雄性SD大鼠随机分为糖尿病组、皮肤损伤组、护理软膏组、黄芪甲苷高剂量组、黄芪甲苷低剂量组、黄芪甲苷+PI3K抑制剂组,每组6只。除糖尿病组外,其余各组均建立糖尿病大鼠皮肤损伤模型,各给药组分别给予相应干预,糖尿病组和皮肤损伤组不做处理。1次/d,持续用药21 d,记录各时间点(术后7、14、21 d)创面愈合情况;图片记录大鼠术后21 d创面血管生成情况,分析各组大鼠血管化面积比;HE染色和Masson染色观察皮肤病理学变化;检测PI3K/AKT/eNOS信号通路及VEGF/VEGFR信号通路相关基因的mRNA及蛋白的表达情况。结果:术后各时间点大鼠创面愈合率比较,差异有统计学意义(P<0.05),存在时间效应。5组大鼠创面愈合率总体比较,差异有统计学意义(P<0.05),存在分组效应。时间因素与分组因素对大鼠创面愈合率的影响存在交互作用(P<0.05)。与糖尿病组比较,皮肤损伤组大鼠创面组织坏死严重,创面血管化面积比明显降低(P<0.05),PI3K/AKT/eNOS通路相关基因mRNA、蛋白磷酸化表达及VEGF、VEGFR2蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);与皮肤损伤组比较,黄芪甲苷高剂量组、黄芪甲苷低剂量组、护理软膏组大鼠创面组织逐渐恢复,创面血管化面积比明显升高(P<0.05),PI3K/AKT/eNOS通路相关基因mRNA、蛋白磷酸化表达及VEGF、VEGFR2蛋白表达水平均明显升高(P<0.05);与黄芪甲苷高剂量组比较,黄芪甲苷低剂量组、黄芪甲苷+PI3K抑制剂组大鼠创面组织恢复缓慢,创面血管化面积比明显降低(P<0.05),PI3K/AKT/eNOS信号蛋白磷酸化水平及VEGF、VEGFR2蛋白表达均明显降低(P<0.05);黄芪甲苷高剂量组各项指标与护理软膏组比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:黄芪甲苷可增强糖尿病皮肤缺损模型大鼠PI3K/AKT/eNOS通路激活水平,提高VEGF、VEGFR2蛋白的表达,加速创面组织的恢复和血管生成,缓解皮肤缺损。

罗格列酮对高胰岛素培养的内皮细胞一氧化氮的影响及其机制研究

目的观察罗格列酮(RGZ)对高胰岛素培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)NO浓度和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、磷酯酰肌醇3激酶(PI3K)和蛋白激酶B(PKB)表达的影响,探讨RGZ改善高胰岛素状态下内皮功能障碍的信号转导机制。方法高浓度胰岛素培养HUVEC 72h,并用不同浓度的RGZ进行干预。检测NO浓度,PI3K mRNA的表达,PKB、eNOS总蛋白和PKB丝氨酸473(PKB-Ser473)、eNOS丝氨酸1177(eNOS-Ser1177)的磷酸化表达。结果高浓度胰岛素培养HUVEC能呈剂量和时间依赖性地降低NO的浓度,抑制内皮细胞PI3K mRNA表达和PKB-Ser473、eNOS-Ser1177的磷酸化。用RGZ干预能显著升高高胰岛素培养的内皮细胞NO的浓度和PKB、eNOS的磷酸化,增强PI3K mRNA表达;eNOS和PI3K阻断剂均能阻断RGZ对高胰岛素培养的内皮细胞中NO浓度的升高,PI3K阻断剂还能阻断RGZ对高胰岛素培养内皮细胞PKB、eNOS的磷酸化。结论高胰岛素能下调PI3K/PKB/eNOS信号通路而抑制内皮细胞NO的产生,RGZ能通过上调PI3K/PKB通路而增强高胰岛素培养的内皮细胞eNOS的活性和NO的产生。

祖卡木颗粒对低氧性肺动脉高压的药效及机制研究

目的探究祖卡木颗粒对单纯低氧及低氧+Su5416诱导的低氧性肺动脉高压(HPH)小鼠的防治作用及其可能的作用机制。方法利用多种数据库及相关文献搜集祖卡木颗粒中10种单味药的活性成分,预测药物靶点并获得HPH相关靶点,进行网络构建及富集分析。通过单纯二周低氧及四周低氧+Su5416诱导建立HPH小鼠模型,观察小鼠右心室压力等主要药效学指标,Masson染色观察肺组织病理变化,Western blotting检测肺组织中Bcl-2-相关X蛋白质(Bcl-Associated X,Bax)、B淋巴细胞瘤-2基因(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)、p-PI3K、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxidase synthase,eNOS)、低氧诱导因子-1α亚基(hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α)蛋白表达水平。结果筛选得到祖卡木颗粒共167种活性成分,与HPH有179个交集靶点,涉及PIK3CA、HIF1等靶点。验证结果显示,祖卡木颗粒可以显著降低HPH小鼠的右心室压力,减轻右心室肥厚,下调小鼠肺组织中Bcl-2、HIF-1α蛋白的表达,上调Bax、PI3K、p-PI3K、eNOS蛋白的表达。结论祖卡木颗粒可能通过调节Bax/Bcl及PI3K-eNOS/HIF-1α信号通路对HPH起到防治作用。

N-乙酰半胱氨酸对COPD肺动脉高压大鼠肺组织PI3K-Akt-eNOS-NO信号通路的影响

【目的】探讨N-乙酰半胱氨酸对慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)肺动脉高压大鼠肺组织PI3K-Akt-eNOS-NO信号通路的影响。【方法】以烟熏、低氧、气道内滴注脂多糖法制备COPD肺动脉高压大鼠模型,随机分为模型组、N-乙酰半胱氨酸低剂量(50 mg/kg)组、N-乙酰半胱氨酸中剂量(100 mg/kg)组、N-乙酰半胱氨酸高剂量(200 mg/kg)组、波生坦(100 mg/kg)组,每组12只,另取12只设为对照组,检测各组大鼠肺平均动脉压;HE染色检测各组大鼠肺组织病理形态变化;酶联免疫吸附实验试剂盒检测各组大鼠血清中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、内皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)、NO水平;蛋白免疫印迹法检测各组大鼠肺组织PI3K/Akt/eNOS通路相关蛋白表达。【结果】与对照组比较,模型组大鼠肺小动脉呈现管壁增生且明显增厚,管腔变窄甚至闭塞等病理损伤,肺平均动脉压、大鼠血清中TNF-α及IL-6水平升高(P<0.05),大鼠血清中eNOS及NO水平、大鼠肺组织磷酸化磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphorylated phosphatidylinositol 3-kinases,p-PI3K)/磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)/蛋白激酶B(protein kinase B,PKB/Akt)及p-eNOS/eNOS降低(P<0.05);与模型组比较,N-乙酰半胱氨酸低、中、高剂量组及波生坦组大鼠肺小动脉病理损伤减轻,肺平均动脉压、大鼠血清中TNF-α及IL-6水平降低(P<0.05),大鼠血清中eNOS及NO水平、大鼠肺组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/Akt及peNOS/eNOS升高且N-乙酰半胱氨酸各组呈剂量依赖性(P<0.05);N-乙酰半胱氨酸高剂量组与波生坦组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。【结论】N-乙酰半胱氨酸可改善COPD肺动脉高压大鼠临床症状,可能是通过激活PI3K-Akt-eNOS-NO通路实现的。

PI3K-Akt-eNOS信号通路在SDG抑制去卵巢大鼠心肌缺血再灌注损伤中的调控作用

目的:通过研究开环异落叶松树酯酚二葡萄糖苷(SDG)对心肌缺血再灌注去卵巢大鼠心脏组织磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(PI3K-Akt-eNOS)的影响,探讨SDG对心肌缺血再灌注损伤的保护机制。方法:100只SD雌性大鼠随机分为去卵巢组、缺血再灌注假手术组、缺血再灌注组、雌二醇干预组和SDG干预组。SDG干预组以50mg·kg^(-1)·d^(-1)剂量灌胃,雌二醇干预组以0.8mg·kg^(-1)·d^(-1)剂量灌胃,其余组均以等量蒸馏水灌胃。伊文氏蓝和2,3,5-氯化三苯基四氮唑双染色法测定心肌梗死面积,ELISA双抗体夹心法检测雌激素水平变化,Western blot法测定PI3K、Akt、eNOS以及三者磷酸化蛋白以及雌激素受体α(ERα)蛋白的表达。结果:SDG干预60d后,雌二醇干预组和SDG干预组雌激素水平显著高于缺血再灌注组,而心肌梗死区面积百分比显著低于缺血再灌注组(P<0.05)。此外,雌二醇干预组和SDG干预组中p-PI3K、p-Akt、peNOS和ERα4种蛋白的表达均显著高于缺血再灌注组(P<0.05)。结论:SDG可能通过激活雌激素受体α,活化PI3K-Akt-eNOS信号通路,从而对去卵巢大鼠心肌缺血再灌注损伤发挥保护作用。