磷酯酶C抗血小板功能的研究Ⅰ——对血小板聚集率和粘附率的作用

目的 通过研究PLC对家兔血小板粘附率和聚集率的作用 ,以探讨PLC对血小板功能的影响。方法 家兔麻醉后 ,经十二指肠给予阴性对照辅料 ,阳性对照ASA和 6种剂量的PLC ,于给药前及给药后 1、2、4h颈动脉取血测定以ADP、AA、Collagen为诱导剂时的血小板聚集率 ,同时用玻球法测定血小板的粘附率。结果 PLC 10 0、 2 0 0IU·kg-1对家兔血小板粘附率无明显影响。PLC 4 0 0～ 10 0 0IU·kg-1可显著地降低血小板粘附率 ,并呈现一定的剂量效应依赖关系。同一剂量PLC组给药后 1、2、4h时相比P <0 0 5。PLC10 0～ 10 0 0IU·kg-16种剂量组在用ADP、AA、Collagen诱导时 ,均可显著地抑制血小板聚集 ;与阴性对照辅料组相比P <0 0 5 ,与阳性对照组相比 ,在ADP诱导时 ,10 0IU·kg-1组的抑制较弱 (P <0 0 5 ) ,而 80 0、10 0 0IU·kg-1组的抑制较强 (P <0 0 5 ) ,并呈一定的剂量效应和时间效应关系 ;而在AA诱导时 ,PLC各组在给药后 2、4h时的抑制率与ASA的相当 ,无明显剂量效应依赖关系 ,而有一定的时间效应关系 ;在Collagen诱导时 ,PLC各组的抑制作用均弱于ASA(P<0 0 5 ) ,无明显的剂量效应依赖关系 ,而有一定的时间效应关系。结论 ①PLC经十二指肠给药 ,10 0、2 0 0IU·kg-1对家兔血小板粘附性无明显影响 ,而

磷酯酶C对家兔血小板聚集和超微结构的影响

目的 应用电镜研究磷酯酶C(phospholipaseC ,PLC)对家兔血小板聚集和超微结构的影响 ,以探讨用药后PLC抗血小板聚集作用的机制。方法 家兔颈动脉插管取血 ,制备PRP ,将其分为 4组 :①空白对照组 ;②生理盐水组 ;③ 0 5UPLC组 ;④ 2 5UPLC组。 2～ 4组分别用ADP诱导聚集 ,测出其聚集抑制率 ,各组分别制成超薄切片样品进行电镜观察、摄片。结果 0 5、2 5UPLC明显抑制血小板聚集反应 ,聚集抑制率分别为 86 0 3 %± 12 6%和 82 47%±5 49% ;0 5UPLC抑制血小板形成伪足 ,α颗粒和致密颗粒较多 ,OCS管腔较小 ,其超微结构较生理盐水组变化小 ;2 5UPLC处理血小板的形态结构和超微结构与空白对照组无差异 ,血小板呈圆形或椭圆形 ,边缘光滑 ,无伪足样突起 ,α颗粒、致密颗粒、OCS等正常分布于胞质中。结论 PLC明显抑制ADP诱导的血小板聚集反应及其超微结构的改变 。

磷酯酶C对人血小板细胞质游离钙离子浓度的影响

目的 测定磷酯酶C(phospholipaseC ,简称PLC ,下同 )对静息状态和激活状态下人血小板胞质游离钙离子浓度的影响 ,从而进一步阐明PLC抗血小板聚集作用的机制。方法 将健康成人的洗涤血小板用荧光指示剂Fura 2 /AM进行负载 ,分别用生理盐水、ASA和不同剂量的PLC处理荧光负载后的血小板 ,采用双波长荧光分光光度法分别测定经过不同处理后的血小板在静息状态和以ADP为诱导剂时的激活状态下的胞质游离钙离子浓度 [Ca2 + ]i。结果 以健康成人血为样品时 ,经生理盐水、ASA 334μmol·L-1、2 5、3 75、5、10和 2 0UPLC·ml-1处理后的血小板 ,在静息状态下测得的胞质游离 [Ca2 + ]i 浓度 (nmol·L-1)分别为15 2 5 5± 15 0 7,131 6 3± 15 5 8,14 0 2 7± 12 0 3,139 4 8± 1 73,12 1 11± 9 5 8,116 6 2± 15 96和 10 7 2 0± 17 0 7,而以ADP为诱导剂激活血小板后测得的胞质游离 [Ca2 + ]i(nmol·L-1)分别为 90 2 6 2± 94 74 ,6 87 99± 6 2 86 ,810 99± 72 37,70 1 73± 2 1 37,4 2 9 6 7± 71 5 9,342 82± 4 4 86和 2 6 3 2 7± 2 5 4 6。以生理盐水作为对照 ,ASA 334μmol·L-1、2 5、3 75、5、10和 2 0UPLC·ml-1剂量组对激活状态下血小板胞质 [Ca2 + ]i 的抑制率I(% )分别为 2 5

高产磷酯酶C菌株筛选及其抗血小板功能的研究

在湖北省、湖南省、江苏省、山东省、广东省 15 6个点采土样 12 6 8份 ,利用卵黄琼脂的LB培养基初筛获得产生乳白色晕圈的菌株 6 48株 ;再用卵黄琼脂滤纸圆片检测获得产生乳白色晕圈和透明圈菌株 2 6 6株 ;这些菌株用卵黄琼脂杯蝶法筛选出产生大于 13 0mm乳白色晕圈及少量透明圈共 73株 ,经过菌生物量、卵黄杯碟法和抗兔血小板聚集率的测定 ,从 73株菌中筛选出 15株 ,菌号为 :183,198,2 47,42 4,5 87,5 96 ,6 92 ,744 ,75 4 1,791 2 ,779,970 ,998,110 7,1182 ;将此 15菌株经菌生物量、卵黄琼脂杯碟法、NPPC法和抗人血小板聚集率的测定 ,从中选出 75 4 1,779,970 ,110 7四株菌进行分类鉴定和已知菌CW W 90 3菌对照比较的研究。

磷酯酶C抗血小板功能的研究Ⅱ——对血小板释放和代谢的作用

目的 通过检测PLC对家兔血小板释放产物血栓素A2 (TXA2 )、代谢产物前列环素 (PGI2 )以及出血时间的影响 ,以探讨PLC抗血小板聚集的作用。方法 运用放射免疫方法测定以ADP、AA、collagen为诱导剂时 ,PLC对血小板TXB2 、6 Keto PGF1α生成量的影响。常规方法测定PLC对家兔出血时间 (BT)的影响。结果 6种剂量PLC均能延长出血时间 ,但在给PLC 4h时 ,BT恢复至给药前水平 (P >0 0 5)。以ADP、AA、Collagen为诱导剂时 ,6种剂量的PLC能显著降低TXB2 的生成 (P <0 .0 5) ;以AA为诱导剂时 ,PLC 10 0U·kg- 1及以collagen为诱导剂时PLC 10 0U·kg- 1和PLC 2 0 0U·kg- 1其对TXB2 的生成的抑制作用较ASA组弱 (P <0 0 5) ;以ADP为诱导剂时PLC 10 0～ 40 0U·kg- 1,以AA为诱导剂时PLC 2 0 0～ 60 0U·kg- 1和以collagen为诱导剂时PLC 40 0～ 80 0U·kg- 1其对TXB2 的生成的抑制作用与ASA组相当 (P >0 0 5) ;以ADP为诱导剂时PLC 60 0～ 10 0 0U·kg- 1、以AA为诱导剂时PLC 80 0～ 10 0 0U·kg- 1和以collagen为诱导剂时PLC10 0 0U·kg- 1其对TXB2生成的抑制作用强于ASA组 (P <0 0 5)。 6种剂量的PLC组均明显增加 6 酮 PGF1α的生成量 (P <0 0 5) ,其作用强于ASA组 (P <0 0 5) ,并存在剂量效应关系和时间效?

高产磷酯酶C菌株的诱变选育

在前面进行的高产磷酯酶C(PLC)菌株筛选、分类鉴定及其抗血小板功能研究的基础上,对选育出的高产PLC菌株BacilluscereusShenZhen7541进行了紫外线和Co60γ射线诱变处理,以期提高其产PLC的水平,从而有利于PLC的纯化制备。B.cereus7541经过三次紫外线照射及两次Co60γ射线辐射诱变处理,通过分离与卵黄琼脂杯碟法及NPPC法酶活检验筛选,最终获得了三株高产PLC突变菌株9287、9289和5612,其产PLC酶活水平分别达到14.878±1.428u/mL、16.450±0.793u/mL、16.400±0.967u/mL,较原始出发菌株B.cereus7541产酶水平(5.803±0.793u/mL)分别提高了2.879、3.236和3.226倍。经t值检验,三株菌产PLC水平与7541差异均达极显著(P<0.001)。

蜡状芽孢杆菌深圳菌株754-1产磷酯酶C培养条件的优化研究

通过单因素试验和正交试验,以蜡状芽孢杆菌(Bacilus cereus)深圳菌株754-1产磷酯酶C(PLC)在卵黄平板上形成的乳白色晕圈的直径大小作为考察指标,对影响754-1产PLC的各因素进行了初步研究。结果表明,754-1产PLC的最佳培养条件为:蛋白胨1.0%,牛肉膏0.3%,酵母膏0.2%,NaCl 0.5%,Zn2+0.1 mmol.L-1,卵黄5.0%,接种量0.5%,发酵温度32℃,培养时间12 h。

磷酯酶C抗实验性血栓形成和促纤溶作用

研究磷酯酶C(phospholipaseC ,PLC)对实验性血栓形成和纤溶功能的影响。方法 :运用下腔静脉结扎法制造大鼠血栓形成模型 ,研究PLC对实验性血栓形成的影响并与尿激酶 (UK)比较 ;运用纤维蛋白平板法、双缩脲法、加钙法研究PLC对人和家兔体内、外纤溶功能的影响。结果 :PLC 173U kg与对照组相比可明显降低血栓的重量和长度 (P <0 .0 5 ) ,但对血栓形成率作用不明显 ,其作用比UK 2 2 2U kg稍弱 ;PLC能溶解标准、加热纤维蛋白平板 ,表现出较强的促纤溶活性 ;PLC在体外能显著降低人、家兔血浆纤维蛋白原 (Fg)和血浆优球蛋白溶解时间 (ELT)(P <0 .0 5 ) ;PLC在体内能显著降低家兔Fg和ELT(P <0 .0 5 )。结论 :PLC具有抗实验性血栓形成和促纤溶活性的功能。

佛波酯处理人胃癌MGC80-3细胞过程中磷酯酶C-γ2的意义

目的探讨佛波酯(TPA)处理人胃癌MGC80-3细胞过程中磷酯酶Cγ-2(PLCγ-2)的意义。方法通过DAPI染色,荧光显微镜观察分析TPA对胃癌MGC80-3细胞的影响;借助核浆分离手段获得胃癌细胞核浆蛋白,并通过免疫印迹(Western blotting)检测TPA对PLCγ-2蛋白表达水平影响;通过免疫荧光技术处理,激光扫描共焦显微镜观察胃癌细胞内PLCγ-2蛋白的定位和转运;用PLCγ-2的抑制剂(U73122)预处理细胞,免疫印迹和激光扫描共焦显微镜分别检测其对TPA作用胃癌细胞内PLCγ-2的影响;以及荧光显微镜下观察分析U73122是否影响TPA对胃癌细胞的作用。结果TPA诱导胃癌MGC80-3细胞凋亡;同时TPA提高PLCγ-2蛋白表达水平,并诱导其发生核浆转运;其抑制剂(U73122)可以降低TPA对PLCγ-2蛋白表达水平的作用,但并不能影响TPA诱导胃癌细胞凋亡;而TPA诱导的PLCγ-2核浆转运却没有被PLCγ-2抑制剂(U73122)阻止。结论尽管TPA提高了胃癌MGC80-3细胞中PLCγ-2表达水平,但PLCγ-2表达水平和TPA诱导的胃癌MGC80-3凋亡没有直接关系,而其核浆转运可能与TPA诱导的胃癌细胞凋亡相关。

北京鸭红细胞膜G-蛋白与磷酯酶C的偶联及腺苷受体的调节

GDP、GTP和GTPγS激活北京鸭红细胞膜上的磷酯酶C,在10^(-7)～10^(-4)mol/L的范围内,使磷酸肌醇产量增加。其中GTPγS作用最强,分别使IP_2和IP_3增强550％和580％。GTP与GDP的效力相近,使IP_2增加140％和150％;IP_3增加230％和330％。A-嘌呤能受体激动剂6-N-cyclohe-xyladenosine(CHA)对抗ATP通过P-嘌呤能受体激活的磷酯酶C,使其活性下降60％。CHA的这种作用可被其特异拮抗剂8-cyclopentyl-1,3-dimethylxanthine对抗。以上结果表明鸭红细胞是研究受体、G-蛋白及磷酯酶C偶联的良好模型。表明不同嘌呤能受体在调节磷酯酶C中的相反作用。

磷酯酶Cβ亚型和蛋白激酶C在糖尿病胃动力障碍大鼠胃窦平滑肌中的表达

[目的]观察糖尿病胃动力障碍大鼠胃窦平滑肌组织中磷酯酶Cβ亚型(PLCβ)和蛋白激酶C(PKC)的表达情况.[方法]取Wistar大鼠,腹腔注射给予STZ制作糖尿病大鼠模型,利用RM-6240四道生理信号记录仪观察大鼠胃窦环行平滑肌的自发性收缩运动情况,将自发性收缩运动减弱的大鼠确定为糖尿病胃动力障碍模型.通过免疫组织化学方法检测PLCβ和PKC蛋白在糖尿病胃动力障碍大鼠胃窦平滑肌组织中的表达水平.[结果]与正常对照组比较,糖尿病胃动力障碍大鼠胃窦平滑肌组织中PLCβ和PKC蛋白表达水平均明显降低(P<0.05).[结论]糖尿病大鼠发生胃动力障碍原因认为可能与胃窦平滑肌中PLCβ和PKC蛋白表达水平下调有关系.

磷酯酶C纯化的研究

采用硫酸铵分级盐析,DEAE-SephadexA-50离子交换柱层析和SephadexG-75凝胶过滤层析从粘质沙雷氏菌发酵上清液中分离纯化磷脂酶C,纯化倍数为59.28,收率为20.35%.

磷酯酶C(PLC)抗血小板聚集Ⅰ类新药研制的项目介绍

项目前期的研究及立项状况 本项目初始于1989年,在1989年～1996年间,主要从事产PLC菌株的鉴定及PLC的理化性质研究,曾获得湖北省自然科学基金。

磷脂酶C对ADP诱导的兔血小板IP_3水平的影响

目的测定磷酯酶C（PLC）对ADP诱导的兔血小板三磷酸肌醇（IP3）的影响，从而进一步阐明PLC抗血小板聚集作用的机制。方法取家兔血除去红细胞制备血小板，血小板计数后分为8个组。第1组用生理盐水处理，第2组用ADP处理，第3组用ASP处理以ADP诱导激活，第4～8组分别用不同剂量的PLC处理并以ADP诱导激活。采用三氯醋酸法制备血小板IR，再用放射免疫分析法分别测定IR含量。结果家兔血小板经生理盐水处理后的IP3含量为0．29pmol／10。血小板，而经ADP处理后IR含量为0．39pmol/10^8血小板。经ASP668μmol·L^-1、5、10、15、20和25U PLC·ml^-1各组处理，并以ADP激活的血小板，测得的IP3含量分别为0．19、0．08、0．15、0．25、0．04和0．18μmol／10^8血小板）。ADP组比生理盐水组IP3有明显的提高，而ASP组、不同的PLC组比ADP组IR有明显的降低（P〈0.05）。结论PLC使得ADP激活后的兔血小板IP3水平下降，且无剂量依赖性，表明PLC具有降低血小板中IP3水平的作用，这可能是PLC抗血小板聚集作用的重要原因之一。

TRPA1通过PLC/PKC信号通路对偏头痛大鼠的行为学和疼痛敏感性的影响

目的 探讨瞬时受体电位锚蛋白1(TRPA1)通过磷酯酶C(PLC)/蛋白激酶C(PKC)信号通路对偏头痛大鼠的行为学和疼痛敏感性的影响。方法 将SD大鼠随机分为对照组、模型组、TRPA1敲低组(腺病毒包装的TRPA1 siRNA载体)、TRPA1空载组(空慢病毒载体)、TRPA1敲低+PMA(PKC激活剂)组,每组12只,分组以腺病毒包装的TRPA1 siRNA载体、空慢病毒载体及PMA干预处理24 h后,模型组与给药干预组皮下注射10 mg/kg硝酸甘油以制备偏头痛大鼠模型,对照大鼠组皮下注射等剂量0.9%氯化钠溶液,然后以qRT-PCR实验检测除TRPA1敲低+PMA组外其余5组大鼠脑组织及血液中TRPA1 mRNA的表达;观察5组大鼠行为,记录其耳红消失时间及一段时间内挠头次数、爬笼次数;检测5组大鼠机械性疼痛及温度痛阈;酶标仪检测5组大鼠血清促炎因子前列腺素E2(PGE2)、白介素(IL)-6及抗炎因子IL-10水平;免疫印迹实验检测5组大鼠脑组织PLC/PKC通路相关蛋白表达。结果 与对照组比较,模型组、TRPA1空载组大鼠缩头阈值、热刺激潜伏期、血清IL-10水平显著降低(P<0.05),脑组织及外周血中TRPA1表达、耳红消失时间、挠头次数、爬笼次数、动态痛觉超敏评分、血清PGE2、IL-6水平、脑组织PLC/PKC通路蛋白p-PLC/PLC、p-PKC/PKC显著升高(P<0.05)。与模型组比较,TRPA1敲低组大鼠缩头阈值、热刺激潜伏期、血清IL-10水平升高(P<0.05),脑组织及外周血中TRPA1表达、耳红消失时间、挠头次数、爬笼次数、动态痛觉超敏评分、血清PGE2、IL-6水平、脑组织PLC/PKC通路蛋白p-PLC/PLC、p-PKC/PKC降低(P<0.05);TRPA1空载组大鼠各指标无显著变化(P>0.05)。与TRPA1敲低组比较,TRPA1敲低+PMA组大鼠缩头阈值、热刺激潜伏期、血清IL-10水平降低(P<0.05),耳红消失时间、挠头次数、爬笼次数、动态痛觉超敏评分、血清PGE2、IL-6水平、脑组织PLC/PKC通路蛋白p-PKC/PKC升高(P<0.05)。结论 TRPA1可通过调控PLC/PKC信号通路介导大鼠偏头痛的发生,下调TRPA1表达可通过抑制PLC/PKC信号通路激活减轻炎症,以降低大鼠疼痛敏感性,最终改善头疼症状。

PLC对人血小板GPIb的作用

目的 应用竞争性酶联免疫定量检测磷酯酶C(PLC)对人血小板膜糖蛋白Ib(GPIb)量的变化,探讨用药后抑制血小板粘附作用的机制。方法 用竞争性酶联免疫药盒测定并绘制标准曲线图;取健康人血制备洗涤血小板,将其分为4组:①生理盐水组;②PLC 0.5 U组;③PLC 1.0U组;④PLC 2.0 U组,分别替代药盒中标准IgG(IgG-ST)进行实验,酶标仪上测OD_(492)值,共实验6人次,依据OD_(492)值在标准曲线图和Eocel软件求出GPIb的量及 用t值检测它们之间的相关性。结果 用生理盐水、PLC0.5 U、1.0 U和 2.0 U组的OD_(492)值和GPIb数量(ng)分别为0.768±0.078、1.103±0.118、1.367±0.102、2.055±0.453和134.669±13.144、101.838±9.879、82.632±5.354、73.183±14.740。PLC 1.0 U和2.0 U组与生理盐水组比差异有显著性(P<0.01),而其它各组之间比差异无显著性(P>0.05)。结论 PLC减少GPIb的量,从而抑制血小板粘附性,这也可能是PLC抗血小板聚集作用的重要原因之一。

新生儿脐血淋巴细胞PLCγ1的表达和意义

目的 :探讨新生儿出生时淋巴细胞功能障碍的可能环节。方法 :给予新生儿脐血和成人外周血淋巴细胞抗CD3单克隆抗体、PMA和IM刺激后 ,应用3H TdR掺入法检测淋巴细胞的增殖反应 ;Westernblot法检测淋巴细胞PLCγ1的表达。结果 :抗CD3单克隆抗体刺激 ,脐血淋巴细胞增殖反应明显低于成人 ;PMA协同IM刺激后 ,脐血淋巴细胞的增殖反应明显高于应用抗CD3单抗刺激后的 ;脐血淋巴细胞PLCγ1的表达明显弱于成人。结论 :脐血淋巴细胞功能障碍可能与细胞活化的上游信号转导缺陷有关。

THE REGULATORY EFFECT OF NUCLEOSIDE DIPHOSPHATE KINASE ON G－PROTEIN AND G－PROTEIN MEDIATED PHOSPHOLIPASE C

ＴＨＥＲＥＧＵＬＡＴＯＲＹＥＦＦＥＣＴＯＦＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥＤＩＰＨＯＳＰＨＡＴＥＫＩＮＡＳＥＯＮＧ－ＰＲＯＴＥＩＮＡＮＤＧ－ＰＲＯＴＥＩＮＭＥＤＩＡＴＥＤＰＨＯＳＰＨＯＬＩＰＡＳＥＣＺｈａｎｇＤｅｃｈａｎｇ（张德昌）ａｎｄＣｈａｎｇＫｅｗｎｊｅｎ...

基于OX1R/PLCβ-1/PKCα/ERK1/2信号通路探讨安寐丹对失眠模型大鼠肝脏神经递质和昼夜节律的影响及机制

目的:基于食欲素受体1(OX1R)/磷脂酰肌醇特异性磷酯酶Cβ-1(PLCβ-1)/蛋白激酶Cα(PKCα)/细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)信号通路探讨安寐丹对失眠大鼠肝脏神经递质及昼夜节律的影响及机制。方法:SPF级SD大鼠60只,随机分为空白组、模型组、苏沃雷生组、安寐丹低、中、高剂量组,各10只;除空白组外,其余各组通过腹腔注射对氯苯丙氨酸(PCPA)进行造模,空白组给予等容生理盐水、苏沃雷生组给予苏沃雷生溶液30 mg·kg^(-1)·d^(-1)灌胃、安寐丹低、中、高剂量组分别给予安寐丹水煎液(4.55、9.09、18.18 g·kg^(-1)·d^(-1));观察各组一般情况、体质量和24 h自主活动情况;采用苏木素-伊红(HE)和马松(Masson)染色观察肝脏病理学改变,酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测肝脏神经递质γ-氨基丁酸(GABA)、5-羟色胺(5-HT)、肾上腺素(EPI)、去甲肾上腺素(NE)和乙酰胆碱(ACh)的表达,生化检测肝脏谷氨酸(Glu)的表达,实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)检测肝脏生物钟基因Per1、Per2、Cry1、Cry2、Bmal1、Bmal2的m RNA表达,蛋白免疫印迹法(Western blot)、Real-time PCR检测肝脏OX1R/PLCβ-1/PKCα/ERK1/2信号通路蛋白及m RNA表达。结果:与空白组比较,模型组体质量下降(P<0.05,P<0.01),狂躁、静止节律紊乱(P<0.01),肝脏肌纤维断裂、水肿伴炎性细胞浸润,GABA、5-HT、EPI、NE和ACh含量降低、Glu含量升高(P<0.01),Per1、Per2、Cry1和Cry2 m RNA表达降低(P<0.01),Bmal1和Bmal2 m RNA表达升高(P<0.01),OX1R、PLCβ-1、PKCα、ERK1/2蛋白及m RNA基因表达均增高(P<0.01);与模型组比较,苏沃雷生和安寐丹低、中、高剂量组可增加失眠大鼠体质量(P<0.05,P<0.01),减少狂躁状态、增加其静止时间和频率(P<0.05,P<0.01),并可上调神经递质GABA、5-HT、EPI、NE、ACh和节律基因Per1、Per2、Cry1、Cry2 m RNA表达(P<0.05,P<0.01),抑制Glu及Bmal1、Bmal2、OX1R、PLCβ-1、PKCα、ERK1/2 m RNA和OX1R、PLCβ-1、PKCα、ERK1/2蛋白表达(P<0.05,P<0.01)。结论:安寐丹可通过抑制OX1R/PLCβ-1/PKCα/ERK1/2信号通路调节失眠大鼠肝脏神经递质表达,改善昼夜节律紊乱,且安寐丹高剂量组效果最佳。