磷酰胺氮芥对大鼠卵巢功能损伤的体外实验

目的研究磷酰胺氮芥(glyciphosphoramide,PM)引起体外培养大鼠卵巢结构和内分泌功能损伤的适宜剂量。方法实验分为4组,每组12个卵巢,来源于出生8周的Wistar大鼠。实验1、2、3组培养基中加入浓度分别为10、20、50μg/mL的PM,培养48h后均隔天全量更换不含PM的培养基。正常对照组培养基中不含PM。在PM加入前及加入后2d(48h)、6d时更换的培养基中用放射免疫法测定其雌二醇(E2)浓度。在加入PM6d时取出大鼠卵巢,称湿重,HE染色,显微镜下观察各期卵泡形态并计数总卵泡数量。结果加入PM后2d及6d的3个实验组的E2浓度均低于正常对照组,差异均有统计学意义(P<0.05),且3个实验组间两两比较差异也均有统计学意义。加入PM6d,3个实验组分别与正常对照组比较,卵泡总数差异均有统计学意义;3个实验组间两两比较,卵泡总数差异均有统计学意义。结论PM浓度为10μg/mL时已能引起体外培养大鼠卵巢结构及功能的损伤。

新型含磺酰基的磷酰胺氮芥衍生物的合成

以磷酰胺氮芥为药效基团,对甲苯磺酰胺为载体,通过乙二胺的连接方式,合成了14个新型含磺酰基的磷酰胺氮芥衍生物,其结构经1H NMR,13C NMR,31P NMR和元素分析表征。

左归丸对磷酰胺氮芥体外诱导损伤颗粒细胞自噬与凋亡的影响

目的探讨磷酰胺氮芥(phosphoramide mustard,PM)诱导卵巢颗粒细胞损伤的机制及左归丸含药血清对受损颗粒细胞自噬与凋亡的影响。方法制备左归丸含药血清,体外培养原代大鼠卵巢颗粒细胞,待细胞生长至底壁的75%-80%时随机分为4组:①对照组(Control);②模型组(M);③左归丸含药血清组(10%ZGW);④模型+左归丸含药血清组(M+10%ZGW)、以PM处理②④组24 h建立化疗源性颗粒细胞损伤模型后,①②组中加入10%正常大鼠血清,③④组中加入10%左归丸含药血清,37℃,5%CO2条件下培养24 h。流式细胞术检测各组颗粒细胞凋亡率,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测卵巢自噬启动因子Beclin-1、微管结合蛋白轻链3(LC3B)、自噬受体蛋白P62、凋亡蛋白Bax、Caspase3的表达。结果与对照组相比:模型组细胞凋亡率明显上升,Beclin-1、LC3B、Bax及Caspase3蛋白表达量增高,P62蛋白表达量下降,差异均具有统计学意义(P<0.05)。10%左归丸含药血清可显著降低模型组颗粒细胞凋亡率,下调受损颗粒细胞中Beclin-1、LC3B、Bax及Caspase3蛋白的表达,上调受损颗粒细胞中P62蛋白的表达,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论 PM诱导了卵巢颗粒细胞损伤,促进了颗粒细胞凋亡,激活了颗粒细胞自噬/溶酶体降解途径;10%左归丸含药血清可降低化疗损伤性颗粒细胞凋亡率,与自噬相关蛋白的表达相关。

菊苣酸对磷酰胺氮芥诱导巨噬细胞免疫抑制的调节作用

用3μmol/L磷酰胺氮芥(phosphoramide mustard,PM)诱导RAW264.7细胞24 h,建立体外细胞免疫抑制模型;给予不同剂量(25、50、100μmol/L)的菊苣酸(chicoric acid,CA)干预细胞24 h,考察CA对免疫抑制的调节作用。利用CCK-8法检测细胞活力,中性红吞噬法检测细胞吞噬能力,ELISA试剂盒测定细胞IL-1β和IL-6表达,NO含量测定试剂盒测定细胞NO水平,实时荧光定量PCR测定IL-1β、IL-6和iNOS mRNA的相对表达量。结果显示,3μmol/L PM诱导RAW264.7细胞24 h后,巨噬细胞活力与吞噬能力显著降低(P<0.05),NO、IL-1β与IL-6的表达以及相应的mRNA相对表达量均显著下降(P<0.05),巨噬细胞免疫抑制模型成功建立;给予不同剂量(25、50、100μmol/L)的CA干预24 h后,巨噬细胞活力与吞噬能力显著增强(P<0.05),巨噬细胞NO、IL-1β与IL-6分泌水平以及相应的mRNA相对表达量明显升高(P<0.05)。结果表明,PM可以有效建立体外巨噬细胞免疫抑制模型,CA可能通过增强巨噬细胞活力与吞噬能力,促进炎症因子表达发挥免疫增强作用,从而提高机体免疫功能。本研究建立体外巨噬细胞免疫抑制模型,探究CA对PM诱导RAW264.7细胞免疫抑制的调节作用,为将CA开发为新型兽用免疫增强剂提供了理论基础。

环状磷酰胺氮芥-喹唑啉偶联物的设计、合成及抗肿瘤活性（英文）

依据多靶点候选药物EMB-3,作者设计了一系列环状磷酰胺氮芥-喹唑啉偶联物并对其肺癌和乳腺癌细胞株的抑制作用进行了评价。其中化合物6d活性最强,对BT474乳腺癌细胞株的抑制活性达到了IC50=0.6μM,是EMB-3活性的8倍。以化合物6d为分子探针对其作用靶点进行确认,结果显示其对表皮生长因子受体-1和表皮生长因子受体-2的酶抑制活性分别为18 n M and 78 n M。初步体内药物代谢实验发现单剂量口服给药化合物6d(10 mg/kg),大鼠的体内代谢半衰期为1.7小时,比先导物EMB-3稳定。以上研究结果表明:化合物6d是一个对乳腺癌肿瘤株BT474具有明显抑制活性的化合物,值得进一步研究。

菊苣酸介导外泌体对巨噬细胞免疫抑制的影响

【目的】建立巨噬细胞免疫抑制模型,探究菊苣酸(cichoric acid,CA)对磷酰胺氮芥(phosphoramide mustard,PM)诱导巨噬细胞免疫抑制的作用及调控机制,为将CA开发为临床防治免疫抑制性疾病的新型药物提供理论依据。【方法】以巨噬细胞源性外泌体为研究对象,采用ExoQuick免疫沉淀试剂盒提取外泌体,用透射电镜(transmission electron microscopy,TEM)、纳米颗粒跟踪分析技术(nanoparticle tracking analysis,NTA)、Western blotting鉴定外泌体形态、粒径大小与浓度,以及表面标志蛋白CD63、HSP90的表达。同时,采用浓度为3μmol/L的PM诱导巨噬细胞24 h,建立免疫抑制模型后,给予低、中、高剂量CA(25、50、100μmol/L)进行干预,通过CCK-8测定细胞活力、中性红检测细胞吞噬能力及NTA测定外泌体粒径大小与浓度,研究CA介导外泌体增强免疫的作用机制。【结果】提取的巨噬细胞源性外泌体杯状形态完整,粒径在30~200 nm之间,标志蛋白表达清晰,具有良好的生物活性。由CCK-8、中性红及NTA测定结果可见,CA在3.12~400μmol/L浓度范围内对巨噬细胞无毒性作用;与PM模型组相比,低、中、高剂量CA可极显著提高免疫抑制巨噬细胞活力及其吞噬能力(P<0.01),极显著促进外泌体的分泌(P<0.01)。【结论】本研究结果表明,CA可能通过调控巨噬细胞源性外泌体分泌,增强其细胞活力与吞噬能力激活巨噬细胞,揭示了CA增强免疫的潜在作用机理。

基于转录组学分析研究左归丸对化疗损伤性颗粒细胞的保护机制

目的:通过RNA-seq技术检测左归丸含药血清治疗磷酰胺氮芥(PM)损伤颗粒细胞(GCs)的基因表达变化,探究左归丸可能的作用机制。方法:对PM损伤后的GCs给予左归丸含药血清干预,采用RNA-seq技术对正常组、模型组、10%左归丸含药血清组进行测序。对获取的基因进行筛选,筛选得到符合标准的差异基因后通过基因本体论(GO)数据库、京都基因与基因组百科全书(KEGG)数据库进行富集分析,通过STRING数据库进行蛋白质相互作用分析,最后对测序结果进行qRT-PCR验证。结果:与正常组比较,模型组GCs总凋亡率明显升高(P<0.05);与模型组比较,10%左归丸含药血清组GCs总凋亡率明显降低(P<0.05);与正常组比较,模型组共筛选得到1 261个差异表达基因,GO富集显示,差异基因在生物过程注释中与染色体分离等相关,细胞组分注释中与浓缩染色体等相关,分子功能注释中与催化活性等相关;KEGG富集显示,差异基因涉及细胞因子-细胞因子受体互作、细胞周期、IL-17通路等。与模型组比较,左归丸含药血清组共筛选得到734个差异表达基因,GO富集显示,差异基因在生物过程注释中与染色体分离等相关,细胞组分注释中与染色体区域等相关,分子功能注释中与DNA催化活性等相关;KEGG富集显示,差异基因涉及细胞周期、细胞因子-细胞因子受体互作、卵母细胞减数分裂、p53信号通路等。结论:左归丸含药血清对PM损伤后的GCs具有一定挽救作用,其机制可能与细胞周期、细胞因子-细胞因子受体互作、卵母细胞减数分裂、p53信号通路等生物学途径相关。

间充质干细胞过表达miR-21对卵巢颗粒细胞凋亡的影响

目的探讨过表达miR-21的骨髓间充质干细胞(BMMSCs)对卵巢颗粒细胞凋亡的影响。方法构建miR-21慢病毒表达载体(LV-miR-21),转染BMMSCs获得稳定表达miR-21的BMMSCs(miR-21-BMMSCs)。培养Wistar大鼠卵巢颗粒细胞,实验分为5组:正常组、磷酰胺氮芥(PM)组、miR-21组、BMMSCs组、miR-21-BMMSCs组。正常组为颗粒细胞不加药,PM组加入30μmol/L的磷酰胺氮芥,miR-21组加入PM诱导颗粒细胞凋亡后转染LV-miR-21,BMMSCs组、miR-21-BMMSCs颗粒细胞培养基中加入PM 24h后分别与BMMSCs、miR-21-BMMSCs以1:1比例共培养。48h后采用流式细胞仪检测颗粒细胞凋亡情况,qRT-PCR法检测miR-21、程序性死亡因子4(PDCD4)、人第10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(PTEN)mRNA的表达量,Western blotting检测PTEN、PDCD4蛋白表达水平。结果正常组、PM组、miR-21组、BMMSCs组、miR-21-BMMSCs组的细胞凋亡率分别为10.4%±1.8%、33.4%±4.2%、27.0%±2.5%、28.0%±2.0%、19.6%±1.5%,5组间比较差异有统计学意义(F=59.35,P=0.00),其中miR-21-BMMSCs组细胞凋亡率明显低于miR-21组、BMMSCs组,但仍高于正常组。miR-21-BMMSCs组miR-21的表达量(4.0310±0.2314)明显升高,而PTEN、PDCD4的mRNA和蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。结论 BMMSCs过表达miR-21可明显减少卵巢颗粒细胞的凋亡,其机制可能与对靶基因PTEN、PDCD4的调控作用有关。

抗生长分化因子-9抗体对化疗所致大鼠卵巢损伤的保护作用

目的探讨抗生长分化因子-9抗体(Anti-GDF-9)对化疗所致体外培养大鼠卵巢损伤的保护作用。方法实验分3组,每组32个卵巢:(1)正常对照组不加磷酰胺氮芥(PM);(2)PM组加入10μg/mL的PM;(3)抗体组在加入PM前24 h加入Anti-GDF-9(5μg/mL)。加入PM前,加入后2、4、6 d每组分别取出8个卵巢,测雌二醇(E2)浓度,计数卵泡总数。结果加入PM2、4、6 d抗体组E2浓度、卵泡总数均高(多)于PM组,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 Anti-GDF-9能减轻PM所致大鼠卵巢的损伤,有保护作用。

CP节律性化疗对RPMI 8226细胞增殖及其Notch1/NF-κB信号通路的影响

目的:研究持续低剂量磷酰胺氮芥(phosphoramide,PM)联合泼尼松龙(prednisolone)(即CP节律性化疗方案)对骨髓瘤细胞RPMI 8226增殖及凋亡的影响,并探讨其对Notch1/NF-κB信号通路的调控作用。方法:实验分DMSO对照组,磷酰胺氮芥(PM)组,泼尼松龙组,磷酰胺氮芥+泼尼松龙组(即CP组),采用不同组的药物处理骨髓瘤细胞RPMI 8226,用CCK8法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞周期及凋亡,RT-PCR检测Notch1和NF-κB的mRNA表达水平。结果:与DMSO对照组相比,随着时间的延长,PM、泼尼松龙及CP组均使RPMI 8226细胞的增殖抑制率明显提高(r分别为0.994、0.996、0.999,P<0.001),并且在相同作用时间,不同组的药物对细胞的增殖抑制率也明显不同,PM对细胞的抑制率最弱,而CP组对细胞的抑制率最强,泼尼松龙组次之(P<0.01)。用药处理48 h后,与DMSO对照组相比,各用药组G_1/G_0期细胞比例明显增加,S期细胞比例明显减少,尤其在PM和CP组,G2/M期细胞比例在PM增加,而在泼尼松龙和CP组则减少。用药处理48 h后,与DM SO对照组相比,治疗组PM、泼尼松龙、CP组的RPMI 8226细胞凋亡率依次增高(P<0.01)。用药处理48 h后,与DMSO对照组相比,泼尼松龙组、PM组、CP组RPMI 8226细胞的Notch1和NF-κB mRNA表达均依次明显下降(P<0.001)。结论:CP节律性化疗可以显著减少RPMI 8226细胞增殖,促进其凋亡,使RPMI 8226细胞主要阻滞于G_1/G_0期,并能显著降低Notch1和NF-κB的表达水平,显示CP节律性化疗对MM的治疗作用有Notch1/NF-κB信号通路的参与。

抗生长分化因子-9抗体与化疗所致大鼠卵巢损伤的关系的研究

目的:探讨抗生长分化因子-9抗体(Anti-GDF-9)对化疗所致大鼠卵巢损伤是否具有防治作用。方法:将96个大鼠卵巢分为6组:①正常对照组12个;②磷酰胺氮芥(PM)组12个;③生理盐水组12个;④同时加抗体组20个;⑤先加抗体组20个;⑥后加抗体组20个。加入抗体的3组有12个卵巢培养8 d,8个卵巢培养14 d,其余3组均培养8 d,隔天换液;按上述要求取出标本,称湿重,HE染色,计数卵泡总数。结果:培养8 d,正常对照组和同时加抗体组的卵泡总数比较,差异无统计学意义(P>0.05),其余各组两两比较卵泡总数差异均有统计学意义(P<0.05),其中先加抗体组多于正常对照组;培养14 d,加入抗体的3组两两比较卵泡总数差异均有统计学意义,先加抗体组卵泡总数最多。结论:体外实验,在加入PM前或同时加入Anti-GDF-9可能会减轻PM对大鼠卵巢的损伤。