PCR法筛选日本血吸虫cDNA文库中磷酸丙糖转移酶基因

目的 用PCR法自日本血吸虫童虫cDNA文库筛选磷酸丙糖转移酶 (TPM )基因 ,为进一步亚克隆和表达奠定基础。方法 根据GeneBank中的日本血吸虫TPM基因开放阅读框设计合成一对引物 ,应用PCR测定cDNA文库中该基因的频率。根据测得的频率 ,将适量的噬菌体接种于96孔细胞培养板上进行细菌培养扩增。再利用PCR鉴定阳性克隆所在位置 ,经过选择性扩增 ,筛选出阳性克隆 ,并环化成质粒 ,经测序验证后构建pGEM T/TPM克隆载体。结果 经过 3轮筛选 ,所得阳性克隆经过测序 ,用GenebankBLAST进行序列比较 ,证实为日本血吸虫磷酸丙糖转移酶基因。重组质粒 pGEM T经双酶切证实有约 76 0bp的插入片段。结论 从日本血吸虫cDNA文库中筛选出TPM基因 ,并成功地构建该基因的克隆载体 。

血吸虫磷酸丙糖转移酶基因的克隆及表达

目的 对血吸虫磷酸丙糖转移酶基因进行克隆及原核表达 ,以寻找新的预防日本血吸虫感染的疫苗候选分子。方法 用血吸虫病人阳性混合血清经大肠杆菌预吸收后对日本血吸虫童虫cDNA文库进行免疫学筛选 ,所获阳性克隆测序后 ,送GenBankBLAST进行蛋白质序列同源性比较 ,证实与其它物种的磷酸丙糖转移酶有很高的同源性。将其克隆入 pGEM-T载体质粒 ,再定向亚克隆入pBK -CMV表达质粒载体上经IPTG诱导表达后 ,用SDS -PAGE和Western -blot分析和鉴定表达产物。结果 用PCR和EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切鉴定均证实TPM基因的重组成功 ,表达产物为 32kD的融合蛋白 ,表达产物可被免疫阳性血清识别。结论 首次成功构建编码日本血吸虫磷酸丙糖转移酶基因表达载体克隆 。

重组日本血吸虫磷酸丙糖转移酶免疫保护性的研究

目的观察重组日本血吸虫磷酸丙糖转移酶(rSj-TPM)在小鼠抗血吸虫感染中的免疫保护作用,寻找新的血吸虫疫苗候选分子。方法以rSj-TPM每鼠50μg/100μl、100μg/100μl和200μg/100μl分别免疫BALB/c小鼠,同时设生理盐水对照组,尾蚴攻击模型小鼠,计算减虫率、减卵率,观察它们的抗血吸虫感染作用;病例切片观察肝脏组织中肉芽肿的变化。结果用重组Sj-TPM免疫BALB/c小鼠,1、2及3组诱导的减虫率分别为27.1%、32.1%和35.2%;1、2及3组诱导的肝组织减卵率分别为34.2%、39.29%和43.66%,各实验组与对照组比较,经t检验差别有显著意义(P<0.05);各实验组间两两比较,经X^2检验差别无显著意义(P>0.05)。病理可见重组Sj-TPM组小鼠肝脏表面较光滑,质地较软,色泽略带暗红色,隐约可见少量灰白色小点,虫卵结节较少;生理盐水组小鼠肝组织中可见大量的虫卵肉芽肿形成,肉芽肿体积较大,周围有大量炎细胞浸润,较多的肝细胞变性坏死。结论日本血吸虫磷酸丙糖转移酶可能是一种潜在的血吸虫病疫苗候选分子。