基于磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶信号通路,浅谈中医药治疗慢传输型便秘的研究进展

慢传输型便秘(Slow Transit Constipation,STC)是一种慢性功能性肠病,其主要特征为结肠传导动力不足,结肠传输速度缓慢,致肠内容物排出时间延长,淤积于肠道,不能顺畅排出体外。STC的病因及发病的机制复杂,目前尚无统一定论,大多数观点认为STC的病因及发病机制与Cajal间质细胞功能异常、水通道蛋白异常表达、肠神经功能病变、胃肠神经递质的异常分泌、肠道微生态紊乱及精神心理障碍等有关。近年来,细胞信号转导通路的异常改变,导致细胞信号转导通路下游的相关分子及蛋白的异常表达导致STC的发病,逐渐引起广大临床学者的关注。基于细胞信号转导通路,探讨STC的研究逐渐增多。大量研究表明,中医药治疗STC具有层次多、靶点丰富且通路广泛的优势,并且临床疗效显著。其中的机制也引起广大临床研究者的好奇。磷脂酰肌醇-3激酶(Phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/内皮型一氧化氮合酶(Endothelial Nitric Oxide Synthase,eNOS)细胞信号转导通路是近年来中医药治疗STC研究的热点通路之一。故文章基于PI3K/Akt/eNOS细胞信号转导通路,探讨中医药治疗STC的研究进展,以期为厘清STC的病因及发病机制提供些许理论支撑,为中医药治疗STC提供现代理论支持,为后期开展更深层次的STC的研究作铺垫。

环磷酸鸟苷/蛋白激酶G信号通路的激活与再灌注损伤挽救激酶信号通路的关系

目的:观察脑钠肽(brain natriuretic peptide,BNP)激活环磷酸鸟苷/蛋白激酶G(cyclic guanosine monophosphate/protein kinase G,cGMP/PKG)信号通路的心肌保护作用是否与细胞外调节蛋白激酶1/2(extracellular regulated protein kinase1/2,ERK1/2)、磷酸酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)蛋白激酶的激活有关。方法:将84只新西兰兔随机分为7组(n=12):假手术组;对照组;BNP组;BNP+LY294002组(LY294002为PI3K抑制剂);LY294002组;BNP+PD98059组(PD98059为ERK1/2抑制剂);PD98059组。除了假手术组只开胸不结扎冠状动脉外,其余6组均于结扎左回旋支45 min后恢复左回旋支血流,进行再灌注180 min。全程观察血流动力学及心电变化;实验终末,各组随机抽取6只兔子心脏做左室梗死面积测定,采用伊文思蓝和氯化三苯基四氮唑双染色法测定心肌梗死面积;每组另外6只兔子心脏取梗死边缘区组织,Western blot方法测定PAkt/Akt、P-ERK1/2/ERK1/2的表达。结果:心率(heart rate,HR)和平均动脉压(mean arterial blood pressure,MABP)在基线水平上无明显差异(P>0.05)。与基线水平相比,HR和MABP在缺血以及再灌注时期有明显下降(P<0.05),而在再灌注时期维持较稳定的水平。各组之间HR、MABP差异无统计学意义(P>0.05);与对照组相比,BNP组心律失常发生率明显减少(P<0.003 125)。与BNP组比较,BNP+LY294002组、LY294002组、BNP+PD98059组及PD98059组心律失常明显增加(P<0.003 125),BNP+LY294002组和LY294002组,BNP+PD98059组和PD98059组差异无统计学意义(P>0.003 125);假手术组无心肌梗死。与对照组比较,BNP组心肌梗死范围明显减少(P<0.05)。与BNP组比较,BNP+LY294002组、LY294002组、BNP+PD98059组及PD98059组梗死面积明显增加(P<0.05)。BNP+LY294002组和LY294002组,BNP+PD98059组和PD98059组差异无统计学意义(P>0.05);与对照组比较,BNP组Akt、ERK1/2的磷酸化水平明显增加(P<0.05)。与BNP组相比,BNP+LY294002组Akt的磷酸化水平及BNP+PD98059组ERK1/2的磷酸化水平分别明显降低(P<0.05)。BNP+LY294002组和LY294002组Akt的磷酸化水平,BNP+PD98059组和PD98059组ERK1/2的磷酸化水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:BNP激活cGMP/PKG信号通路,对心肌缺血再灌注损伤产生保护作用,且该通路的激活与再灌注损伤挽救激酶通路的激活有关。

肠道菌群通过去乙酰化酶3激活单磷酸腺苷活化的蛋白激酶/雷帕霉素信号通路对脓毒症心肌炎和心肌细胞线粒体损伤的影响

目的探讨正常肠道粪菌移植(FMT)对脓毒症心肌炎和心肌细胞线粒体损伤的改善作用与机制。方法将40只SD大鼠随机分为盲肠结扎穿孔术(CLP)建立的脓毒症模型组(CLP组)、假手术对照组(sham组)、FMT治疗组(CLP+FMT组)及FMT联合去乙酰化酶3(SIRT3)抑制剂(3-TYP)治疗组(CLP+FMT+3-TYP组),每组各10只。采用HE染色观察大鼠心肌组织的病理变化,采用ELISA检测大鼠血液中IL-1β、IL-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达水平,采用Western blot检测大鼠心肌组织中IL-1β、NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、去乙酰化酶3(SIRT3)、单磷酸腺苷活化的蛋白激酶(AMPK)、磷酸化AMPK(p-AMPK)、雷帕霉素(mTOR)及p-mTOR表达水平,采用透射电镜观察大鼠心肌细胞线粒体形态,采用流式细胞术分析大鼠心肌细胞的线粒体膜电位变化。结果与sham组比较,CLP组、CLP+FMT组、CLP+FMT+3-TYP组心肌组织SIRT3和p-mTOR表达水平均显著降低,而心肌组织p-AMPK和血液中IL-1β、IL-6及TNF-α的表达水平均显著增加;与CLP组比较,CLP+FMT组心肌组织SIRT3和p-mTOR的表达水平均显著增加,而心肌组织p-AMPK和血液中IL-1β、IL-6及TNF-α的表达水平均显著降低;与CLP+FMT组比较,CLP+FMT+3-TYP组心肌组织SIRT3和p-mTOR的表达水平均显著降低,而心肌组织中p-AMPK和血液中IL-1β、IL-6及TNF-α的表达水平均显著增加;与sham组比较,CLP组线粒体膜电位的红/绿荧光强度比值显著下降;与CLP组比较,CLP+FMT组线粒体膜电位的红/绿荧光强度比值显著增加;与CLP+FMT组比较,CLP+FMT+3-TYP组线粒体膜电位的红/绿荧光强度比值显著下降(P<0.05)。结论肠道菌群通过SIRT3激活AMPK/mTOR信号通路对脓毒症心肌炎和心肌细胞线粒体损伤均有改善作用。

磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/FoxO1信号通路和白细胞介素17在小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎中的表达变化

目的探讨磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/FoxO1和白细胞介素17(IL-17)与自身免疫性脑脊髓炎(EAE)发病的相关机制。方法将C57BL/6小鼠60只随机分为对照组和模型组(EAE),每组30只。采用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG35~55)联合完全弗氏佐剂诱导建立EAE模型。观察各组小鼠的行为学评分,并于评分4分时取各组小鼠的脊髓、脾脏和外周血。HE染色及Luxol fast blue染色观察脊髓炎性细胞浸润及髓鞘脱失情况;脾细胞在体外用a-CD3和MOG35~55分别刺激7 d,收集其上清液,ELISA检测小鼠脾细胞上清液和血清中细胞因子白细胞介素17(IL-17)和干扰素γ(IFN-γ)的含量;流式细胞术检测小鼠脾脏中CD4+IL-17+细胞的百分比;Western blotting检测IL-17及PI3K/Akt/FoxO1在小鼠脊髓中表达。结果与对照组相比,EAE组小鼠行为学评分明显高于对照组(P<0.05);HE染色及Luxol fast blue染色结果显示,EAE组脊髓病理组织表现出炎性浸润和髓鞘脱失显著增多(P<0.05)。ELISA结果显示,EAE组血清中及体外培养脾细胞的上清中IL-17和IFN-γ的含量明显升高。流式结果表明,EAE组小鼠脾细胞中CD4+IL-17+T细胞的百分比明显增加(P<0.05)。Western blotting结果显示,EAE组小鼠脊髓IL-17、磷酸化Akt(p-Akt)蛋白水平明显升高,但磷酸化FoxO1(p-FoxO1)蛋白水平显著降低(P<0.05)。结论 EAE组小鼠脊髓中促炎因子IL-17分泌增加,可能与PI3K/Akt/FoxO1信号通路活化进而激活T细胞功能有关。

秋水仙碱通过激动PI3K/AKT/eNOS信号通路对急性心肌梗死大鼠心功能的影响

目的:探究秋水仙碱通过调节磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/内皮型一氧化氮合酶(eNOS)信号通路对急性心肌梗死(AMI)大鼠心功能的影响。方法:78只大鼠中随机选取12只作为假手术组,剩余大鼠构建AMI模型,造模成功大鼠分为模型组、秋水仙碱组[4 mg/(kg·d)]、秋水仙碱[4 mg/(kg·d)]+LY294002(20 mg/mL)组、秋水仙碱[4 mg/(kg·d)]+MK-2206(60μg/mL)组、秋水仙碱[4 mg/(kg·d)]+L-NAME(1.6 mg/mL)组,每组12只。超声心动图检测大鼠左心室舒张末期内径(LVEDD)、左心室收缩末期内径(LVESD)、射血分数(EF)及短轴缩短率(FS)。处死大鼠,苏木素-伊红(HE)染色检测大鼠心肌组织石蜡切片病理学变化;末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL)法检测心肌细胞凋亡率;酶联免疫吸附实验(ELISA)测定大鼠血清肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)以及心肌组织匀浆中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)水平;免疫印迹法(Western Blot)测定大鼠心肌组织PI3K/AKT/eNOS通路蛋白表达。结果:与假手术组相比,模型组大鼠LVESD、LVEDD,血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平,心肌匀浆MDA、心肌细胞凋亡率升高,EF、FS水平,心肌匀浆SOD、CAT,心肌组织磷酸化PI3K(p-PI3K)/PI3K、磷酸化AKT(p-AKT)/AKT、磷酸化eNOS(p-eNOS)/eNOS降低(P<0.05);与模型组相比,秋水仙碱组大鼠LVESD、LVEDD,血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平,心肌匀浆MDA、心肌细胞凋亡率降低,EF、FS水平,心肌匀浆SOD、CAT,心肌组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS升高(P<0.05);与秋水仙碱组相比,秋水仙碱+LY294002组、秋水仙碱+MK-2206组、秋水仙碱+L-NAME组大鼠LVESD、LVEDD,血清CK-MB、TNF-α、IL-6水平,心肌匀浆MDA、心肌细胞凋亡率升高,EF、FS水平,心肌匀浆SOD、CAT,心肌组织p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT、p-eNOS/eNOS降低(P<0.05)。结论:秋水仙碱可能通过激活PI3K/AKT/eNOS信号通路对AMI大鼠发挥心功能保护作用。

褪黑素调控下丘脑PI3K/Akt/mTOR信号延缓雌性小鼠青春期启动的机制

目的探讨褪黑素(MLT)对雌性小鼠青春期启动的影响以及对下丘脑磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信号通路表达水平的影响。方法78只20日龄雌性KM小鼠,随机分为褪黑素(MLT)组和生理盐水(NS)组,每组39只。22日龄开始,给予MLT组皮下注射1 mg/kg褪黑素,给予NS组注射等体积的生理盐水。青春期启动前选取32日龄为取材点,两组分别处死13只小鼠,青春期启动后选取37、42日龄为取材点,两组分别处死13只小鼠。观察小鼠阴门开启时间;取卵巢、子宫称重计算器官指数;HE染色观察卵巢黄体数量;ELISA法检测血清黄体生成素(LH)水平;Real-time PCR和Western blotting检测下丘脑PI3K/Akt/mTOR通路mRNA和蛋白表达水平。结果与生理盐水组相比,褪黑素组小鼠阴门开启时间显著推迟(P<0.05);卵巢、子宫的大小和指数明显下降(P<0.05);血清LH水平明显下降(P<0.05);下丘脑PI3K/Akt/mTOR通路mRNA和蛋白的表达水平显著下降(P<0.05)。结论褪黑素可以延缓小鼠青春期启动,机制可能与抑制下丘脑PI3K/Akt/mTOR信号通路相关。

米力农注射液对肾缺血再灌注损伤大鼠PDE3/cAMP/PKA信号通路及肾功能的影响

目的:探究米力农注射液对肾缺血再灌注损伤(IRI)大鼠磷酸二酯酶3(PDE3)/环腺苷酸(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)信号通路及肾功能的影响。方法:SD大鼠随机分为假手术组、模型组、地塞米松(5 mg/kg)组、米力农低(125μg/kg)、中(250μg/kg)、高(500μg/kg)剂量组,每组12只,除假手术组外,其余各组建立IRI大鼠模型,分组处理后,检测大鼠肾功能指标血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)水平;以苏木精-伊红染色(HE)检测大鼠肾组织病理形态;以试剂盒检测大鼠肾组织SOD、MDA及cAMP水平;以酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清TNF-α,IL-6;以蛋白免疫印迹法检测肾组织PDE3、PKA蛋白表达。结果:与假手术组相比,模型组大鼠肾组织球囊黏连,肾小管结构水肿膨胀,肾上皮细胞变性、坏死,形成空泡,显示严重的病理损伤,Scr、BUN、血清TNF-α、IL-6水平、肾组织MDA水平及PDE3蛋白表达升高(P<0.05),肾组织cAMP、SOD水平及PKA蛋白表达明显降低(P<0.05)。与模型组相比,米力农低、中、高剂量组及地塞米松组大鼠肾组织病理损伤减轻,Scr、BUN、血清TNF-α、IL-6水平、肾组织MDA水平及PDE3蛋白表达降低(P<0.05),cAMP、SOD水平及PKA蛋白表达升高,且米力农各组呈剂量依赖性(P<0.05)。结论:米力农注射液可下调PKA表达激活cAMP/PKA信号,从而抑制炎症反应,降低氧化应激,加快肾组织缺血再灌注损伤的修复。

P38MAPK信号通路对缺血预处理减轻神经元凋亡作用机制的研究

目的探讨通过缺血预处理抑制P38丝裂素活化蛋白激酶(P38MAPK)信号通路以减轻神经元凋亡的机制.方法将原代培养的神经元及星形胶质细胞进行缺血预处理,将常规条件下培养的星形胶质细胞培养基作为条件培养基1(ACM1);在分泌GDNF最多时,将星形胶质细胞培养基制备成条件培养基2(ACM2);GDNF基因经转染质粒沉默后提取其培养基,作为条件培养基3(ACM3),将P38MAPK的抑制剂SB203580加入ACM3中,制备成ACM4.将对照组、预处理组、预处理+缺血组、缺血组神经元孵育在不同条件培养基中,AO/EB荧光染色检测神经元凋亡情况,Western blot法检测神经元p-P38MAPK及Caspase-3的表达.结果预处理+缺血组和缺血组神经元凋亡率明显增高(P<0.05),加入ACM2后神经元凋亡较ACM1和ACM3两组均减少(P<0.05).预处理+缺血组和缺血组凋亡的神经元明显多于另外两组(P<0.05),加入ACM1和ACM3两种培养基后凋亡率高于ACM2组(P<0.05).预处理+缺血组及缺血组p-P38MAPK及Caspase-3的蛋白表达均明显高于对照组和预处理组(P<0.05),预处理+缺血组p-P38MAPK及Caspase-3的蛋白表达均较缺血组低(P<0.05),加入ACM2组的p-P38MAPK及Caspase-3蛋白表达低于另外两组(P<0.05).结论星形胶质细胞经过缺血预处理后GDNF分泌增多,通过抑制P38MAPK信号通路及Caspase-3的表达减少神经元凋亡,进而发挥内源性神经保护机制.

橘红素通过调控AMPK/SIRT3信号轴影响胃癌AGS细胞自噬的机制

目的探讨橘红素(tangeretin,Tan)通过腺苷酸活化的蛋白激酶(AMP activated proteinkinase,AMPK)/沉默信息调节因子2相关酶3(silent information regulator factor 2related enzyme 3,SIRT3)信号轴对人胃癌AGS细胞自噬的影响及机制。方法用不同浓度(5、10、30、60、120μmol·L^(-1))Tan分别作用于AGS细胞24、48、72 h,用MTT法检测Tan对细胞的抑制作用,计算半抑制浓度(50% inhibitory concentration,IC_(50)),观察细胞形态变化情况;将细胞随机分为对照组、Tan组、激动剂组,其中Tan组、激动剂组分别用IC_(50)的Tan、AMPK激动剂A-769662处理细胞,对照组不做处理,培养48 h后,用透射电镜观察自噬泡,用MDC染色法观察细胞自噬情况,用qRT-PCR法检测AMPK以及SIRT3基因诱导量的变化,用Western blot检测细胞中相关蛋白AMPK、p-AMPK、SIRT3、LC3II、p62的表达水平。结果培养24、48、72 h后,AGS细胞对Tan的IC_(50)值分别为(46.42±5.62)、(59.76±7.01)、(83.56±8.86)μmol·L^(-1),不同浓度的Tan作用于细胞,细胞形态发生改变,随着Tan浓度的升高,细胞形态变化程度加剧;透射电镜下对照组有少量自噬泡形成,Tan组无自噬泡形成,激动剂组有大量自噬泡形成;MDC染色结果显示,与对照组比较,Tan组的荧光强度较弱,激动剂组的荧光强度较强;与对照组比较,Tan组SIRT3 mRNA的相对表达量降低,激动剂组SIRT3 mRNA的相对表达量升高(P<0.05)。与Tan组比较,激动剂组SIRT3 mRNA的相对表达量升高(P<0.05)。与对照组比较,Tan组细胞中p-AMPK、SIRT3、LC3II蛋白的相对表达量降低,p62蛋白的相对表达量升高,激动剂组p-AMPK、SIRT3、LC3II蛋白的相对表达量升高,p62蛋白的相对表达量降低(P<0.05)。与Tan组比较,激动剂组细胞中p-AMPK、SIRT3、LC3II蛋白的相对表达量升高,p62蛋白的相对表达量降低(P<0.05)。各组细胞中AMPK mRNA和蛋白的相对表达量比较,差异无统计学意义。结论Tan可抑制人胃癌AGS细胞发生自噬,可能是通过调控AMPK/SIRT3信号通路发挥作用。

化瘀通便汤对慢传输型便秘大鼠PI3K/Akt/eNOS信号通路及血管活性肽的影响

目的:研究化瘀通便汤对磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B/内皮型一氧化氮合酶(PI3K/Akt/eNOS)信号通路及血管活性肽(VIP)的影响,探讨该方药对慢传输型便秘大鼠的治疗机制。方法:90只大鼠随机抽取15只为正常组,其余75只按复方地芬诺酯灌胃造模法制造慢传输型便秘模型,根据简单随机抽样方法分为5组(模型组、化瘀通便汤低剂量组、化瘀通便汤中剂量组、化瘀通便汤高剂量组、麻仁软胶囊组),每组15只。化瘀通便汤低、中、高剂量组分别予化瘀通便汤24 g/(kg·d)、48 g/(kg·d)、96 g/(kg·d)灌胃。麻仁软胶囊组用常温蒸馏水调配麻仁软胶囊至2.4 g/mL,灌胃量为20 mL/(kg·d)。模型组与正常组均与等量常温蒸馏水进行灌胃,日1次。各组干预2周后,检测大鼠首次排黑便时间、粪便含水率及结肠组织磷酸化蛋白激酶B(P-Akt)阳性细胞、VIP、一氧化氮(NO)、内皮型一氧化氮合酶(eNOS)水平。结果:与模型组比较,化瘀通便汤各组及麻仁软胶囊组均能缩短大鼠首次排黑便时间,增加大鼠粪便含水率,提高大鼠结肠组织P-Akt含量、P-Akt阳性细胞水平,降低VIP的表达,降低结肠组织中NO及eNOS的含量(P<0.05);与麻仁软胶囊组比较,化瘀通便汤低剂量组与麻仁软胶囊组相近(P>0.05),化瘀通便汤中、高剂量组明显优于麻仁软胶囊组(P<0.05)。结论:化瘀通便汤可通过调控PI3K/Akt/eNOS信号通路及VIP表达,对慢传输型便秘大鼠起治疗作用。

G6PD调控PI3K/Akt信号通路诱导肝癌细胞索拉非尼耐药的机制研究

目的 基于磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路研究葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD)诱导肝癌细胞索拉非尼耐药的机制。方法 以肝癌细胞Huh7、索拉非尼耐药肝癌细胞Huh7-SR、G6PD稳定过表达的肝癌细胞Huh7-G6PD及其对照细胞Huh7-CT为研究对象,以索拉非尼或G6PD抑制剂(6-氨基烟酰胺)为干预药物,采用CCK-8法检测细胞活力,采用Western blot法检测G6PD蛋白表达水平及PI3K/Akt信号通路相关蛋白的磷酸化水平,采用流式细胞术检测细胞凋亡水平。结果 与Huh7细胞比较,Huh7-SR细胞中G6PD的表达水平显著升高(P<0.05)。经6-氨基烟酰胺和索拉非尼联合干预后,Huh7-SR细胞存活率显著降低(P<0.01)。经索拉非尼干预后,与Huh7-CT细胞比较,Huh7-G6PD细胞存活率显著升高(P<0.01),凋亡率显著降低(P<0.01)。经6-氨基烟酰胺干预后,Huh7-SR细胞中PI3K、Akt蛋白的磷酸化水平均显著降低(P<0.05)。不加药物干预时,与Huh7-CT细胞比较,Huh7-G6PD细胞中PI3K、Akt蛋白的磷酸化水平均显著升高(P<0.01)。结论 G6PD可通过激活PI3K/Akt信号通路诱导肝癌细胞索拉非尼耐药。

PI3K/Akt-eNOS-NO信号通路与脑缺血后适应的研究进展

缺血后适应对缺血性脑卒中具有内源性保护作用,其机制尚未完全阐明。PI3K/Akt信号通路作为细胞内重要信号转导通路之一,通过影响下游多种效应分子的活化状态,达到对缺血性脑卒中的神经保护作用。缺血后适应通过激活PI3K/Akt信号通路,从而激活下游内源性eNOS-NO系统,实现多条途径保护缺血脑组织。

葛根素激活AMPK/Akt/GSK-3β信号通路减轻高糖诱导的H9c2心肌细胞肥大作用研究

[目的]探讨葛根素对高糖诱导的H9c2心肌细胞的保护作用及机制。[方法]采用高糖损伤H9c2心肌细胞48 h,建立体外糖尿病心肌损伤细胞模型;罗丹明标记的鬼笔环肽标记细胞骨架,测定细胞表面积;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测细胞中心肌肥大相关蛋白β-肌球蛋白重链(β-MHC)的水平、AMP活化蛋白激酶α(AMPKα)、丝氨酸/苏氨酸激酶(Akt)和糖原合成激酶3β(GSK-3β)蛋白的磷酸化水平、以及1,4,5-三磷酸2型受体(IP3R2)和Sigma-1受体(Sig-1R)的蛋白水平。[结果]葛根素(20μmol/L)能显著抑制高糖诱导的心肌细胞表面积增大;Western Blot分析结果显示,高糖能上调β-MHC蛋白水平、抑制AMPK和Akt磷酸化,葛根素能下调β-MHC、IP3R2蛋白水平同时促进AMPK、Akt和GSK-3β的磷酸化。[结论]葛根素可能通过激活AMPK/Akt/GSK-3β信号通路减轻高糖诱导的心肌肥大。

维泰醇对人骨肉瘤移植荷瘤裸鼠肿瘤生长的抑制作用及对Akt/GSK3信号通路的影响

目的:探讨维泰醇对人骨肉瘤移植荷瘤裸鼠肿瘤生长的抑制作用及对丝苏氨酸蛋白激酶(Akt)/糖原合酶激酶3(GSK3)信号通路的影响。方法:将30只BALB/c-nu品系裸鼠分为3组:正常对照组、环磷酰胺组(25 mg·kg^(-1))和维泰醇组(150 mg·kg^(-1)),每组10只。用培养的U-2OS细胞注射到裸鼠右胫骨骨髓腔内制备U-2OS荷瘤裸鼠模型,造模成功后环磷酰胺组和维泰醇组灌胃给予相应药物,正常对照组给予等量生理盐水,1次/d,给药周期为4周。末次给药次日,处死裸鼠,完整剥离出原位瘤块,计算抑瘤率,检测瘤块组织中相关蛋白表达水平及细胞凋亡情况。结果:与正常对照组比较,环磷酰胺组和维泰醇组瘤块重量、N-钙黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(vimentin)、纤维连接蛋白(fibronectin)、p-Akt、磷酸化糖原合酶激酶3(p-GSK3)和锌指转录因子(Snail)蛋白表达水平降低,抑瘤率、上皮细胞钙黏蛋白(E-cadherin)蛋白表达水平和细胞凋亡率增加(P<0.05);与环磷酰胺组比较,维泰醇组瘤块重量、N-cadherin、vimentin、fibronectin、p-Akt、p-GSK3和Snail蛋白表达水平增加,抑瘤率、E-cadherin蛋白表达水平和细胞凋亡率降低(P<0.05);各组Akt和GSK3蛋白表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结论:维泰醇可能通过Akt/GSK3信号通路抑制上皮-间质转化(EMT)并降低骨肉瘤细胞的侵袭能力,促进骨肉瘤细胞凋亡。

奥氮平对精神分裂症大鼠认知功能和神经元损伤影响中PI3K/Akt信号通路的作用

目的 探讨奥氮平对老年精神分裂大鼠认知功能和神经元损伤的影响中PI3K/Akt信号通路的作用。方法 10周龄SD大鼠随机分为空白对照组(n=12)和老年精神分裂模型组(n=48)。老年精神分裂模型组动物经腹腔注射地卓西平马来酸盐(MK-801)0.2 mg/(kg·d),连续14 d后,进行一般行为学评价以观察模型是否制作成功。将模型制作成功大鼠随机分为模型组和奥氮平低、中、高剂量组[10、20、40 mg/(kg·d)],每组12只,连续给药21 d。采用Sams Dodd和Hoffman标准对刻板行为进行评分,Morris水迷宫对大鼠进行认知评价,采用ELISA测定血清中白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)水平。利用乙酰胆碱酯酶(AchE)活性测定试剂盒检测脑组织中乙酰胆碱(Ach)、AchE的活性。Real-time PCR检测大鼠脑组织PI3K、Akt、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR) mRNA的表达水平。结果 与模型组相比,奥氮平低、中、高剂量组大鼠的刻板行为及共济失调评分、逃避潜伏期、跨越平台次数、血清中IL-6、TNF-α水平、脑组织AchE、、磷酸化Akt (p-Akt)蛋白表达减少(P<0.05,P<0.01);而脑组织Ach、PI3K、mTOR及磷酸化mTOR (p-mTOR)和磷酸化PI3K(p-PI3K)表达量增加(P<0.05,P<0.01),奥氮平低剂量组Akt含量增加;与模型组相比,奥氮平低、中、高剂量组大鼠脑组织中Akt和mTOR mRNA表达水平下调(P<0.05,P<0.01),奥氮平中、高剂量组大鼠脑组织中PI3K表达水平下调(P<0.05,P<0.01)。结论 奥氮平可降低刻板行为及共济失调评分、逃避潜伏期、跨越平台次数、血清IL-6、TNF-α水平和脑组织AchE,增加Ach含量,通过调节PI3K/Akt信号通路对老年精神分裂症起到治疗作用。

miR-221靶向PTEN介导PI3K/AKT信号通路调节细胞自噬参与帕金森病的机制研究

目的探讨微小RNA-221(miR-221)靶向磷酸脂酶与张力蛋白同源物基因(PTEN)介导磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(PKB也称AKT)信号通路调节细胞自噬参与帕金森病(PD)进展的机制研究。方法采用6-羟基多巴胺(6-OHDA)作用于肾上腺嗜铬细胞瘤(PC12)细胞建立PD模型;转染miR-221模拟物或抑制剂来调节miR-221的表达;细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测PC12细胞存活率;电镜观察自噬体;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析确定miR-221的表达;蛋白印迹法(Western blot)检测自噬蛋白标志物(LC3-II)和PTEN/PI3K/AKT信号蛋白的表达。结果在PD细胞模型中,miR-221的表达水平下降(P<0.01),LC3-II蛋白表达水平上调(P<0.01),自噬体增加;与6-OHDA组相比,过表达miR-221降低了LC3-II蛋白的表达水平(P<0.05),并增加了细胞存活率(P<0.001),而沉默miR-221增加了LC3-II蛋白的表达水平(P<0.05),并降低了细胞存活率(P<0.001);此外,与6-OHDA组相比,过表达miR-221降低了PTEN蛋白的表达(P<0.01),增加了PI3K蛋白的表达(P<0.001)以及AKT蛋白磷酸化程度(P<0.01),而沉默miR-221增加了PTEN蛋白的表达(P<0.01),降低了PI3K蛋白的表达(P<0.05)以及AKT蛋白磷酸化程度(P<0.05)。结论 miR-221在6-OHDA诱导的PC12细胞中表达降低,上调miR-221可靶向PTEN介导PI3K/AKT信号通路来调节自噬,从而发挥对PD细胞模型的保护作用。

槐定碱调控磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B信号通路对局灶性脑缺血损伤大鼠的保护作用

目的观察磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)信号通路在槐定碱发挥抗炎保护大鼠脑缺血损伤中的作用。方法将70只SD大鼠随机分成假手术组、模型组和低、中、高剂量实验组,每组14只。低、中、高剂量实验组均按1.0 mL·kg^(-1)的剂量腹腔注射浓度分别为2.5,5.0和10.0 mg·mL^(-1)的槐定碱溶液;假手术组和模型组均给予腹腔注射等体积0.9%NaCl。5组大鼠每天给药1次,连续给药5 d。模型组和实验组在第5天给药后立即构建永久性大脑中动脉栓塞(pMCAO)模型。用比色法检测大鼠脑组织髓过氧化物酶(MPO)的含量,用酶联免疫吸附法检测脑组织肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL^(-1)β)和IL-6的含量,用蛋白质印迹法检测缺血皮质磷酸化PI3K(p-PI3K)和磷酸化Akt(p-Akt)的表达水平。结果假手术组、模型组和低、高剂量实验组的MPO含量分别为(0.15±0.03),(0.45±0.09),(0.37±0.12)和(0.21±0.09)U·g^(-1) Pro, TNF-α分别为(131.92±19.83),(246.95±41.42),(212.07±33.90)和(157.53±34.11)pg·mL^(-1),IL-1β分别为(87.91±13.91),(145.33±16.88),(126.01±23.36)和(103.57±17.78)pg·mL^(-1),IL-6分别为(65.40±9.80),(137.11±19.48),(126.87±19.03)和(81.46±19.19)pg·mL^(-1),p-PI3K蛋白表达水平分别为0.50±0.08,0.26±0.12,0.46±0.06和0.55±0.09,p-Akt蛋白表达水平分别为0.92±0.09,0.49±0.13,0.63±0.13和0.90±0.16。高剂量实验组的MPO、IL-6、TNF-α、IL^(-1)β、p-PI3K和p-Akt与模型组相比,差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论槐定碱可能通过PI3K/Akt信号通路抑制炎症反应,进而对大鼠局灶性脑缺血发挥神经保护作用。

cAMP信号通路对根尖乳头干细胞增殖的影响

目的探讨c AMP信号通路对根尖乳头干细胞(SCAP)增殖、迁移的影响。方法酶消化法培养细胞;矿化诱导液和成脂诱导液诱导细胞后,茜素红和油红O染色鉴定细胞多分化潜能;分别用不同浓度的c AMP信号通路激活剂Forskolin和抑制剂H-89处理细胞;MTT和划痕实验检测各组细胞的增殖能力及迁移能力。结果矿化和成脂诱导液分别诱导SCAP后,茜素红和油红O染色显示有钙盐沉积及脂滴形成。低浓度的Forskolin(2.5μmol·L^(-1))促进细胞增殖,高浓度的Forskolin(10μmol·L^(-1),20μmol·L^(-1))则发挥相反作用。用低浓度H-89(5μmol·L^(-1),10μmol·L^(-1))抑制c AMP信号后,SCAP的增殖能力增加,而高浓度H-89(20μmol·L^(-1))在MTT第3天时促进细胞增殖,第5天和第7天时抑制该细胞增殖。迁移结果显示高浓度Forskolin(10μmol·L^(-1),20μmol·L^(-1))抑制SCAP的迁移,而H-89(5μmol·L^(-1),10μmol·L^(-1))促进该细胞的迁移。结论 c AMP信号通路对根尖乳头干细胞增殖、迁移有一定的调节作用。

Tec真核表达载体构建及其对细胞信号的影响

目的构建人Tec酪氨酸蛋白激酶真核表达载体;研究Tec参与肝细胞再生的可能信号途径。方法经PCR扩增、酶切、连接等基因重组技术将人Tec插入pCDNA3.1(hismycTec)真核表达载体中,并经酶切、PCR、测序鉴定;用脂质体法将构建的真核表达载体瞬时转染Hela细胞,用Western方法检测Tec蛋白是否表达。用荧光素酶报告基因系统,检测Tec是否参与HGF刺激信号途径的活化。结果构建的Tec真核表达载体使Hela细胞高表达Tec蛋白;并发现Tec在HGF介导下,对Elk信号分子活化的报告质粒中荧光素酶的表达有明显增强作用。结论构建了Tec真核表达载体,并能使HGF介导的MAPK途径活化,提示Tec可能参与HGF介导肝细胞增殖的信号调控。