猪磷酸二酯酶4B2的原核表达和活性鉴定

使用RT-PCR方法扩增猪磷酸二酯酶4B2基因,将其克隆到表达载体,经PCR和测序鉴定的阳性重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导重组蛋白表达。结果显示,目的基因片段大小为1718 bp,与GenBank公布的猪PDE4B2基因序列同源性为99.7%。表达的重组蛋白以包涵体和可溶性蛋白两种形式存在。Western blotting检测结果表明,蛋白质大小约为66 ku,通过液相检测重组蛋白的cAMP-PDE活性为51.46%。制备的多克隆抗体有良好的特异性,为进一步检测天然蛋白PDE4B2和筛选PDE4B2的特异性抑制剂奠定了基础。

磷酸二酯酶4B在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠肺组织中的表达与作用

目的观察博来霉素诱导的小鼠肺纤维化过程中磷酸二酯酶4B(PDE4B)mRNA和蛋白表达随时间的变化,初步探究PDE4B在小鼠肺纤维化过程中的作用。方法采用气道滴入博来霉素2.5 mg·kg-1制备肺纤维化模型,在造模后第3,7,14,21和28天进行支气管肺泡灌洗并留取肺组织。应用细胞形态学方法计数支气管肺泡灌洗液(BALF)中白细胞总数和分类;ELISA法测定BALF中巨噬细胞炎症蛋白2(MIP2)、白细胞介素6(IL-6)、IL-1β和转化生长因子β1(TGF-β1)含量;胶原试剂盒测定法测定肺组织胶原含量;髓过氧化物酶(MPO)活性测定试剂盒测定组织匀浆液中MPO活性;实时荧光定量PCR方法检测小鼠肺组织中PDE4B mRNA表达;免疫组织化学法检测PDE4B的分布。结果博来霉素气道滴入诱导的肺纤维化随时间持续加重,第28天最明显,可见肺组织明显实质化。BALF中白细胞总数、IL-1β和IL-6在造模后第3天达峰值,分别为正常对照组的22.0,2.0和2.8倍;MPO和TGF-β1在第7天达峰值,分别为正常对照组的1.9和5.5倍;胶原含量、MIP-2和PDE4B mRNA表达从造模后呈持续增长趋势,分别为正常对照组的1.6,2.7和2.6倍。免疫组织化学法检测结果表明,PDE4B分布于炎症细胞和纤维化的肺组织。结论PDE4B在肺纤维化中发挥重要作用,可能是一个特异性的药物作用靶点。

磷酸二酯酶4B与小鼠阿霉素心脏毒性相关性研究

目的探讨磷酸二酯酶4B(PDE4B)与小鼠阿霉素心脏毒性(DIC)的相关性。方法将12只C57BL/6J小鼠随机分入生理盐水组和DIC组,每组各6只。DIC组采用腹腔注射阿霉素(DOX)建立小鼠DIC模型。注射DOX后第15天,超声评价生理盐水组和DIC组小鼠的心功能。采用实时荧光定量聚合酶链式反应和Western blot检测生理盐水组、DIC组PDE4B mRNA及PDE4B蛋白水平。采用DOX刺激HL-1心肌细胞24 h后,实时荧光定量聚合酶链式反应和Western Blot检测对照组(未给予DOX刺激)、DOX组(给予DOX刺激)PDE4B mRNA及PDE4B蛋白水平。结果与生理盐水组比较,DIC组小鼠的左室射血分数和短轴缩短率均显著降低(P<0.05)。与生理盐水组比较,DIC组心肌组织PDE4B mRNA及蛋白水平均明显升高(P<0.05)。在心肌细胞中,与对照组比较,DOX组PDE4B mRNA及蛋白水平均明显升高(P<0.05)。结论PDE4B在DOX刺激后心肌组织和心肌细胞中表达升高。

磷酸二酯酶4B基因多态性与精神分裂症的关联研究

目的探讨磷酸二酯酶4B基因多态性与精神分裂症的相关性。方法运用聚合酶链反应扩增及单核苷酸多态性的分子生物学技术，收集符合精神分裂症诊断标准的98个先证者及其父母组成的核心家系，对其磷酸二酯酶4B基因rs1040716，rs2180335，rs3767311，rs472952多态性分型，进行精神分裂症的磷酸二酯酶4B基因多态性的关联分析和单体型相对风险率分析。结果rs2180335等位基因与精神分裂症相关联（P=0．02131），其中等位基因A是保护因素（Z=-2．184），G为危险因素（Z=2．184），A等位基因频率为0．452，G为0．548；rs1040716，rs3767311，rs472952与精神分裂症无关联。五种单体型rs2180335-rs3767311的A／A、rs3767311-rs472952的A／A、rs2180335-rs3767311-rs472952中的A／A／A、rsl040716-rs2180335-rs3767311-rs472952中的A／G／G／A,T／A／A／A与精神分裂症有关联（P值分别为0．028715，0．034845，0．024177，0．023967，0．010839，基因型频率分别为0．223，0．223，0．127，0．081，0．073）。结论磷酸二酯酶4B基因rs1335042与精神分裂症相关联。

基于人磷酸二酯酶4B2高通量筛选异香兰酸芳酰胺抑制剂

磷酸二酯酶4B2(PDE4B2)选择性抑制剂是新型抗炎药物研究的热点。合成异香兰酸芳酰胺衍生物的猪磷酸二酯PDE4强效抑制剂,评价其对人PDE4B2的抑制活性,以明确可用于高通量筛选PDE4抑制剂的靶酶。以异香兰素为原料,经烷基化、氧化、酰胺化反应制得目标化合物;大肠杆菌原核重组表达人PDE4B2;偶联碱性磷酸酶的孔雀绿定磷法测定酶活性,96孔板高通量测定化合物的抑制常数。结果显示,结构确认的5个异香兰酸芳酰胺衍生物纯度超过88%,其对人PDE4B2的抑制常数明显高于对猪主动脉PDE4的抑制常数。不同来源PDE4对异香兰酸芳酰胺衍生物敏感性不同,拟用人PDE4B2为靶酶进行抑制剂高通量筛选。

磷酸二酯酶4b抑制剂定量构效关系及分子对接研究

磷酸二酯酶4(PDE4)是第二信使环磷酸腺苷(cAMP)选择性高亲和力的水解酶,影响气道平滑肌、炎性细胞和免疫细胞的功能,选择性PDE4b抑制剂作为抗炎药治疗哮喘和慢性阻塞性肺病(COPD)因为不会引起恶心呕吐等副反应而受到极大的关注。本文使用比较分子场(CoMFA)方法,对系列嘧啶二芳基取代的PDE4b抑制剂构建了合理的三维定量构效关系(3D-QSAR)模型,使用分子对接方法研究了抑制剂与酶的相互作用,发现该系列化合物的嘧啶环2位引入带有较大电负性基团取代的五元环状烃基可提升活性;嘧啶环4位、5位两个碳原子上建议保留小体积取代基;嘧啶环6位引入带有氢键给体或氢键受体取代的芳烃基可增加化合物活性。本研究可为后续合理设计高效的PDE4b抑制剂提供理论指导。

PDE4B专一性抑制剂选择性的起源

采用分子动力学模拟和结合自由能计算研究了PDE4B抑制剂选择性的起源.首先,探索了模拟时间、溶质介电常数、配体的电荷方案和结合自由能的计算方法对结合自由能预测值准确度的影响,确定最佳模拟条件为:模拟时间40~50 ns,溶质介电常数ε=2,采用MM/GBSA方法以及RESP配体电荷计算方案.接着,通过能量分解分析了抑制剂A33与PDE4B/PDE4D的相互作用,发现PDE4B酶上的Ile410、Gln443、Phe446和Phe506对抑制剂的选择性识别贡献较大.最后,通过位点突变方法探索了PDE4B的CR3螺旋上的Leu502残基对A33选择性所起的作用.当前的工作为设计高活性、高选择性的PDE4B抑制剂提供了有价值的结构与活性关系信息.

多药效团组合筛选PD E4B抑制剂研究

本文以17个PDE4B受体-抑制剂复合物为研究对象,应用LigandScout构建17个药效团模型,并以多药效团组合筛选方法开展中药中具有PDE4B亚型选择性抑制活性成分的辨识研究。经过配体再匹配和已知活性化合物数据库筛选两种评价方法,评价并保留了17个药效团模型;以分子被命中频次作为多药效团组合筛选方法的综合性评价指标,结合MDDR数据库筛选结果,确定了PDE4B抑制剂被命中大于或等于8次的分子为多药效团组合筛选目标。比较了最优药效团筛选方法与多药效团组合筛选方法的筛选效率,结果多药效团组合筛选方法的富集度和活性化合物有效命中率都比最优药效团筛选方法高,分别为38.017、47.44%,表明基于受体的多药效团组合筛选方法具有一定的可靠性,有助于开展中药中有效成分的辨识研究。

鞘内注射PDE4B-siRNA对L5脊神经结扎大鼠痛觉高敏的影响

目的观察鞘内注射针对磷酸二酯酶4B(PDE4B)基因的小干扰RNA(siRNA)对L5脊神经结扎(SNL)大鼠的热痛觉及机械痛觉高敏的影响。方法雄性SD大鼠70只,随机均分为假手术组(Sham组)、生理盐水组(NS组)、单纯载体组(V组)、错配siRNA组(siRNA-M组)和PDE4B-siRNA组(siRNA-B组),分别于神经结扎术后即刻以及术后1、3、5、7d鞘内注射生理盐水、生理盐水、LipofectamineRNAiMAX、错配siRNA 2μg和PDE4B-siRNA 2μg,容量均为10μl。PDE4B-siRNA、错配siRNA与载体均在注射前30min混匀。于术前1d及术后2、4、6、8d分别测定五组大鼠的机械缩足阈值(MWT)和热缩足潜伏期(TWL);术后4、8d行为学测试结束后每组各处死6只大鼠,取腰段脊髓,采用实时定量PCR(real-time PCR,RT-PCR)和western bolt分别测定PDE4B的mRNA和蛋白表达。结果与术前1d比较,术后2、4、6、8dNS组、V组、siRNA-M组和siRNA-B组大鼠MWT明显缩短、TWL明显减小(P<0.05)。与NS组比较,术后2、4、6、8dsiRNA-B组大鼠MWT明显延长、TWL明显增加(P<0.05)。与Sham组比较,术后4、8dNS组、V组、siRNA-M组、siRNA-B组大鼠脊髓组织的PDE4B mRNA、PDE4B蛋白表达升高(P<0.05)。与NS组比较,术后4、8dB组大鼠脊髓PDE4B mRNA、PDE4B蛋白表达明显降低(P<0.05)。结论鞘内注射PDE4B-siRNA可显著抑制L5SNL大鼠腰段脊髓PDE4B的mRNA和蛋白表达,有效缓解机械和热痛觉高敏。

弥漫大B细胞淋巴瘤内TNFAIP3、PDE4B对肿瘤细胞凋亡、侵袭的影响

目的:研究弥漫大B细胞淋巴瘤(DLBCL)内肿瘤坏死因子诱导蛋白3基因(TNFAIP3)、磷酸二酯酶4B(PDE4B)对肿瘤细胞凋亡、侵袭的影响。方法:选择2014年8月~2017年7月期间在广州四二一医院诊断为弥漫大B细胞淋巴瘤的68例患者作为研究的DLBCL组,选择同期因淋巴结肿大在广州四二一医院接受淋巴结穿刺活检且诊断为反应性淋巴结增生的34例患者作为对照组。测定淋巴结组织中TNFAIP3、PDE4B以及凋亡基因、侵袭基因的表达量。结果:DLBCL组病灶组织中TNFAIP3、PTEN、PTPL1、Bax的蛋白表达量显著低于对照组(P<0.05),PDE4B、c-myc、AURKA、AURKB、PLK1、Ets-1、β-catenin、MMP7、MMP9、CD44的蛋白表达量显著高于对照组(P<0.05);DLBCL病灶组织中PTEN、PTPL1、Bax的蛋白表达与TNFAIP3的蛋白表达量呈正相关,与PDE4B的蛋白表达量呈负相关;c-myc、AURKA、AURKB、PLK1、Ets-1、β-catenin、MMP7、MMP9、CD44的蛋白表达量与TNFAIP3的蛋白表达量呈负相关,与PDE4B的蛋白表达量呈正相关。结论:弥漫大B细胞淋巴瘤内TNFAIP3的低表达以及PDE4B的高表达能够拮抗肿瘤细胞凋亡、促进肿瘤细胞侵袭。

HDAC9通过下调PDE4b表达参与调控小鼠心肌肥厚

目的探讨心肌肥厚性重构可能分子机制。方法选取8周龄清洁级雄性C57小鼠18只,随机分为升主动脉缩窄术(TAC)组和对照组(SHAM组),每组9只。TAC组给予升主动脉缩窄术(TAC术)构建心肌肥厚模型。SHAM组给予假手术。术后4周,利用二氧化碳窒息处死实验小鼠,剖开胸腔后分离心脏组织,用于后续实验。H&E染色观察心脏组织结构;心室/体质量指数评估心室重构情况;荧光测定法测定心脏组织中组蛋白去乙酰化酶(HDACs)活性;qPCR检测MYH7、PDE4b、HDAC4、HDAC5及HDAC9的表达水平,Western blot检测PDE4b及HDAC9蛋白表达水平,ChIP-qPCR检测HDAC9与PDE4b启动子结合水平。结果与SHAM组相比,TAC组小鼠室间隔及左室壁明显增厚,心室/体质量指数明显升高(4.48±0.18 vs 5.50±0.23)(P<0.05),心肌肥厚标志物MYH7表达明显升高(0.91±0.04 vs 1.44±0.07)(P<0.05);PDE4b表达明显降低(mRNA水平0.75±0.09 vs 0.27±0.06;蛋白水平0.67±0.11 vs 0.34±0.05)(P<0.05);肥厚心肌组织中组蛋白去乙酰化酶活性显著增加(3.24±0.32 vs 5.03±0.58)(P<0.05),HDAC9表达显著升高(mRNA水平0.85±0.08 vs 1.35±0.07;蛋白水平0.77±0.10 vs 1.25±0.05)(P<0.05),而HDAC4、HDAC5表达与SHAM组无明显差异(P>0.05);HDAC9与PDE4b启动子结合水平明显升高(1.67±0.10 vs 2.47±0.20)(P<0.05)。结论心肌肥厚中HDAC9可能参与下调PDE4b表达,进而参与心室肌肥厚性重构。

人PDE4B2全长与截短突变体的重组表达及表征

目的:比较6His-SUMO融合的人全长环核苷酸磷酸二酯酶4B2(SF-h PDE4B2)及152-528aa截短突变体(STh PDE4B2)在大肠杆菌融合表达、亲和纯化及酶学特征,以明确ST-h PDE4B2用于筛选抗炎活性h PDE4B2抑制剂的优势。方法:分别将6His-SUMO融合到人全长PDE4B2基因编码区的N端和152-528aa截短突变体N端得到SF-h PDE4B2和STh PDE4B2;大肠杆菌BL21(DE3)诱导表达,Ni2+-NTA亲和层析纯化,用偶联碱性磷酸酶的孔雀绿定磷法测定酶活性。结果:纯化后ST-h PDE4B2比活性接近SF-h PDE4B2的40倍,活性收率超过100倍;SDS-PAGE和6His标签免疫印迹发现纯化后2种融合蛋白都有多种带6His标签的降解片段;测定咯利普兰[(R)-Rolipram]和罂粟碱的抑制常数表明,SF-h PDE4B2对(R)-Rolipram主要为高亲和力结合构象,而ST-h PDE4B2主要为低亲和力结合构象。结论:与SF-h PDE4B2相比,ST-h PDE4B2用于筛选抗炎活性h PDE4B2抑制剂可能更有优势。

阿魏酸对脂多糖损伤的PC12细胞和大鼠海马神经元细胞的保护作用

目的探讨阿魏酸（FA）对脂多糖（LPS）诱导的PC12细胞和大鼠海马神经元损伤的保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法体外实验：FA 2.5～40μmol·L-1与PC12细胞预处理12 h,加入LPS 0.15 g·L-1继续培养8 h,采用CCK-8法检测细胞活力;ELISA法检测细胞培养上清中肿瘤坏死因子α（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）的释放;激光共聚焦显微镜检测细胞骨架蛋白F肌动蛋白的表达。体内实验：FA25,50和100 mg·kg-1ip给予SD大鼠,每天1次,连续35 d。给药第29天时ip给予LPS 0.2 mg·kg-1,每天1次,连续7d,运用免疫组织化学法观察大鼠海马神经元磷酸二酯酶4B（PDE4B）蛋白表达的变化;Western蛋白质印迹法检测cAMP反应元件结合蛋白（CREB）和磷酸化CREB（p-CREB）表达。结果体内实验：与LPS组细胞比较,FA 10,20和40μmol·L-1预处理组细胞活力明显升高（P〈0.05）,炎性因子TNF-α和IL-1β的释放显著减少（P〈0.05）,细胞骨架蛋白F肌动蛋白的分布和结构明显改善。体内实验：HE染色结果显示,预先给予FA 50和100 mg·kg-1可以减轻LPS诱导的大鼠海马神经元损伤;免疫组织化学实验结果显示,FA 50和100 mg·kg-1能够显著降低LPS诱导的大鼠海马神经元PDE4B蛋白表达水平的升高（P〈0.05）;Western蛋白印迹实验结果表明,FA 50和100 mg·kg-1可逆转LPS对CREB和p-CREB蛋白表达的抑制作用（P〈0.05）。结论 FA对LPS诱导的PC12细胞和大鼠海马神经元细胞损伤有保护作用,FA抗神经炎症的作用可能与抑制PDE4表达、激活c AMP/CREB信号通路相关。