磷酸化组蛋白H2AX介导的DNA损伤精子受精卵内修复

成熟精子易受外界影响产生DNA损伤,却缺乏DNA损伤修复系统。由于DNA损伤精子仍具有受精能力和发育潜力,其损伤修复可能发生在受精后。遗憾的是,DNA损伤精子受精后的修复机制尚不清楚。研究发现磷酸化组蛋白H2AX(histone H2AX phosphorylation,γH2AX)参与了DNA损伤精子受精后的修复。本综述主要探讨DNA损伤精子受精后受精卵内经由γH2AX介导修复的可能机制。

组蛋白H2AX的磷酸化及其在肿瘤中的应用

组蛋白H2AX磷酸化与DNA损伤及修复密切相关,并在细胞周期检测点调控、基因组稳定的维持和肿瘤抑制中起着重要作用。文章对组蛋白H2AX磷酸化在检测肿瘤致癌物、探讨肿瘤发生机制及指导肿瘤放化疗等方面作一综述。

基于流式细胞术的组蛋白γ-H2AX磷酸化检测方法的建立

目的:建立基于流式细胞术的生物标记物γ-H2AX自动化检测方法,并探讨此方法用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的前景。方法:试验分为不添加体外代谢活化系统(-S9)长时(24 h)处理组和添加体外代谢活化系统(+S9)短时(4 h)处理组,分别采用CCK-8方法选择4个不同浓度的依托泊苷(ETO)和环磷酰胺(CP)处理人成淋巴TK6细胞,24 h后收获细胞,采用连接荧光分子的γ-H2AX抗体和核酸染料SYTOX Green双色标记,使用高通量流式细胞仪分析组蛋白H2AX磷酸化(γ-H2AX)阳性的细胞比例。结果:与溶剂对照组比较,-S9 24 h处理组,不同浓度的依托泊苷诱导产生的γ-H2AX阳性细胞比例显著增加,量效关系明显(r=0.999,P<0.05);+S9 4 h处理组,不同浓度的环磷酰胺诱导产生的γ-H2AX阳性细胞比例亦显著增加,量效关系明显(r=0.988,P<0.05)。结论:流式细胞仪可快速、准确地分析体外培养的TK6细胞中γ-H2AX的变化,本试验初步建立了基于流式细胞术的组蛋白γ-H2AX磷酸化检测方法。

γH2AX磷酸化/去磷酸化的分子机制及检测技术进展

自从γH2AX在1998年首次发现以来,迅速成为多个学科领域的研究热点和研究工具。针对γH2AX建立的多种先进检测方法在生命科学和医学等多个领域内的应用展现了发展潜力。本文从其磷酸化和去磷酸化机制,各种检测分析技术的发展和建立,以及在相关领域里的应用进展等三个方面进行了综述。

DNA损伤修复过程中H2AX磷酸化的调控及其意义

组蛋白2A变异体(histone family 2A variant,H2AX)在DNA双链断裂(double-strand break,DSB)损伤时可以发生不同的翻译后修饰,包括磷酸化、乙酰化、甲基化和泛素化。通过这些修饰,H2AX标记损伤的DNA双链,促进局部DNA修复因子和染色体重塑因子的募集,维持基因组的稳定性。这对于DSB的有效修复及细胞周期从周期检查点的恢复都是十分必要的。另外,H2AX在DSB信号通路必不可少的作用及其在肿瘤发生早期被激活事件,使它成为肿瘤生物学研究中的热点基因蛋白。本文中重点阐述近几年H2AX在DSB损伤修复中的研究进展,同时提出将它作为一个表观遗传标记,在人类肿瘤的早期诊断和治疗中的潜在应用价值。

磷酸化组蛋白H3--检测心肌细胞有丝分裂指数的可靠指标

目的采用磷酸化组蛋白H3鉴定心肌细胞有丝分裂,为研究心肌细胞增殖机制奠定形态学基础。方法对H9c2(2-1)大鼠心肌细胞进行培养,利用免疫荧光双重染色技术,用横纹肌肌动蛋白IgM单克隆抗体标记心肌细胞,用磷酸化组蛋白H3 IgG单克隆抗体标记有丝分裂的染色体,同时用Hochest 33342显示细胞核,荧光显微镜观察并摄片。结果心肌细胞胞质呈红色荧光,有丝分裂的染色体呈现不同形状的绿色荧光,胞核为蓝色。结论磷酸化组蛋白H3是观察和鉴别心肌细胞有丝分裂的可靠指标。

DNA-PKcs在DNA双链断裂应答过程中对H2AX磷酸化起主导作用

目的研究在DNA双链断裂(double strand break,DSB)情况下,DNA-PKcs和ATM在磷酸化H2AX中所发挥的作用。方法在He La细胞中,以高效的DNA双链断裂诱导剂新制癌菌素(neocarzinostatin,Ncs)诱导DSB形成,Western blot分析H2AX磷酸化的时间,剂量依赖及其去磷酸化的动态变化。DNA-PKcs抑制剂NU7026及ATM抑制剂Ku55933分别作用细胞,Western blot检测其对H2AX磷酸化的影响。以α-satellite序列为对象,γ-H2AX CHIP检测DNA-PKcs或ATM抑制前后H2AX磷酸化情况,得出定量数据。结果γ-H2AX生成呈Ncs作用时间及剂量依赖过程。Ncs短时间作用后,γ-H2AX能够去磷酸化恢复。抑制DNA-PKcs明显影响γ-H2AX生成,而抑制ATM使得γ-H2AX生成高峰延迟。CHIP显示抑制DNA-PKcs后其DNA富集倍数仅为抑制前的27%,而抑制ATM后其富集倍数为抑制前的63%。结论 DNA-PKcs可能在DNA双链断裂应答过程中对H2AX磷酸化起主导作用。

γH2AX和53BP1蛋白在肺正常上皮细胞DNA氧化损伤反应中的表达

目的探讨肺正常上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBE)中磷酸化组蛋白H2AX(phosphorylated H2AX,γH2AX)和p53结合蛋白1(p53-Binding protein 1,53BP1)在DNA氧化损伤反应中的表达。方法用0、25、50、100、200、400μmol/L过氧化氢(H2O2)处理HBE细胞1 h,对其造成氧化损伤引起DNA双链断裂(double strand breaks,DSBs);CCK-8比色法检测H2O2对HBE细胞活性的影响,流式细胞术检测细胞凋亡情况,荧光显微镜检测HBE细胞核内γH2AX和53BP1蛋白的聚集情况,western blot检测γH2AX、53BP1、BRCA1蛋白的表达水平。结果与对照组比较,25μmol/L H2O2处理组细胞活性(1.07±0.01)升高,50、100、200、400μmol/L H2O2处理组细胞活性(分别为0.97±0.01,0.96±0.01,0.95±0.01和0.94±0.01)降低,差异具有统计学意义(F=50.35,P<0.01)。细胞凋亡检测结果显示,与对照组[(4.65±0.32)%]比较,50、100、200、400μmol/L H2O2处理组细胞凋亡率[分别为(7.54±0.57)%、(7.84±0.68)%、(8.40±0.50)%和(14.03±1.03)%]升高(F=35.879,P<0.01)。与对照组比较,经25、50、100、200、400μmol/L H2O2处理后γH2AX的平均荧光强度升高(F=223.97,P<0.01),而经50、100、200、400μmol/L H2O2处理后53BP1的平均荧光强度降低(F=117.78,P<0.01);western blot结果显示,随着H2O2浓度升高,γH2AX蛋白表达水平升高,BRCA1和53BP1的表达水平下降,差异均具有统计学意义(F分别为96.20,11.55,21.92,P均<0.01)。结论在H2O2导致HBE细胞的氧化损伤中,γH2AX可作为DNA氧化损伤标志物,但53BP1的表达下降提示HBE细胞可能通过其他途径进行DNA氧化损伤的修复。

幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白不同片段对胃癌细胞γH2AX表达的影响

目的探讨幽门螺杆菌(H.pylori)细胞毒素相关基因A(CagA)蛋白不同片段对胃癌细胞磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)表达的影响。方法取前期分离的H.pylori东亚株GZ7及其CagA敲除株H.pylori GZ7ΔCagA感染的癌细胞株AGS,采用免疫荧光方法检测DNA双链断裂标志物γH2AX的表达;构建不同序列的CagA表达载体(载体a、b、c、d、e),转化大肠杆菌,提取质粒后测序鉴定,将鉴定后的载体转染AGS,采用免疫荧光方法检测γH2AX的表达,并通过流式细胞术检测细胞周期。结果成功鉴定了含不同片段的CagA载体;H.pylori GZ7感染的胃癌细胞AGS核内γH2AX的表达高于H.pylori GZ7ΔCagA感染的细胞(P<0.05);与NC组比较,不同序列CagA载体转染后胃癌细胞AGS中γH2AX表达均有增加(P<0.05或P<0.01),且载体b、c及d表达增加较明显(P<0.01);载体a和c转染后的胃癌细胞AGS的G0/G1期细胞比例升高(P<0.05),载体b、c、d及e转染后胃癌细胞AGS的G2/M期比例明显升高(P<0.01)。结论CagA是H.pylori感染诱导胃癌细胞DNA双链断裂的重要因素,CagA中的EPYIA基序是这种DNA损伤的重要结构。

γH2AX、53BP1及RAD51焦点用于分析DNA双链断裂损伤

γH2AX、53BP1及RAD51焦点(foci)是DNA双链断裂(DSBs)损伤修复的评价指标。其中,γH2AX分析应用最为广泛,但最新有研究发现其并不完全与DSBs损伤一致。系统分析了DNA损伤时γH2AX、53BP1及RAD51 foci的动力性变化及其在DSBs损伤评估中的合理应用。结果表明,在电离辐射处理时,γH2AX和53BP1 foci具有高度一致性,均可反映DSBs损伤及修复的动力性变化,而RAD51 foci仅出现在部分损伤细胞中,与其主要参与同源重组修复一致。在喜树碱(CPT)处理时,γH2AX呈现两种染色类型(亮而离散的foci和泛核磷酸化),53BP1 foci仅出现在亮而离散的γH2AX foci阳性细胞且与其高度一致。结果提示,单独γH2AX染色阳性并不能准确代表DSBs损伤,而应结合53BP1等染色来综合分析DSBs损伤程度;RAD51 foci分析仅能反映部分细胞的DSBs损伤修复(主要是同源重组)情况。

γH2AX与男性不育患者精子DNA损伤的关系及意义

目的研究γH2AX在男性不育患者精液中的表达水平,探讨γH2AX用于评价男性不育患者精子DNA双链断裂(DSBs)损伤程度的可行性。方法选取就诊于广西医科大学第一附属医院生殖医学研究中心、男性科门诊并确诊为男性不育患者27例(男性不育组),另外选取23例确认有生育能力的健康男性的精液样本作为对照组。通过PureSperm密度梯度离心法(DGC)优选精子,运用单向凝胶电泳技术(SCGE)和流式细胞术方法对健康男性、男性不育组患者的精液进行精子双链DNA损伤和γH2AX含量的测定和比较。结果男性不育组患者精子DSBs损伤程度和γH2AX表达含量均高于对照组(P<0.01),而经密度梯度离心法优选精子后,两组男性精子的DSBs损伤程度和γH2AX表达含量均显著下降(P<0.01)。结论γH2AX在男性不育患者精子中的含量明显高于健康男性,可作为检测精子DNA双链断裂损伤程度的一个新的标志物。

不同方式加热联合甲基莲心碱对耐药乳腺癌MCF-7/Adr细胞γH2AX及mdr-1/P-gp表达的影响

目的:检测不同模式加热联合甲基莲心碱(neferine,Nef)对耐药乳腺癌MCF-7/Adr细胞的增殖抑制及γH2AX和mdr-1/P-gp表达的影响。方法:采用MTT法检测金属模块加热、培养基加热、烤箱加热及水浴加热等不同模式加热联合10μg/mL Nef对经阿霉素培养的MCF-7/Adr细胞的增殖抑制,实时定量PCR检测mdr-1mRNA的表达,Western印迹法检测γH2AX及P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达。结果:42℃及45℃不同模式加热组较37℃培养组MCF-7/Adr细胞吸光度值明显下降,mdr-1/P-gp表达下降,γH2AX表达上调(均P<0.01)。加热联合10μg/mLNef组较单纯热疗组及单纯10μg/mLNef组MCF-7/Adr细胞吸光度值明显下降(均P<0.01),mdr-1/P-gp表达下降,γH2AX表达上调(均P<0.05)。42℃及45℃不同模式加热组比较,水浴加热组P-gp表达下降及γH2AX表达上调最为明显(P<0.05)。结论:加热能增加阿霉素对MCF-7/Adr细胞的细胞毒性反应,能明显增加MCF-7/Adr细胞DNA损伤且随温度升高而加剧;MCF-7/Adr细胞对不同模式的加热反应可能不同;热疗联合Nef能增敏阿霉素的化学治疗效果。

重离子所致DNA双链断裂损伤修复的γH2AX焦点响应

DNA双链断裂(DSB)是电离辐射所致基因组DNA的主要和最严重的损伤类型,磷酸化组蛋白γH2AX能比较特异地在DSB处形成焦点,是DSB的分子标志物之一。比较了重离子~7Li、^(12)C与γ射线辐照小鼠MEF细胞诱发γH2AX焦点的规律特征。结果显示,诱发形成的平均每个细胞的γH2AX焦点数目与照后时间相关,表达峰值出现在照后2 h,但不同类型辐射高表达的持续时间不同。在相同剂量下,致焦点形成率与辐射的LET值相关,LET值越高,形成率越大。γ射线诱发的γH2AX焦点尺寸随照后时间无明显变化,高LET重离子诱发的γH2AX焦点尺寸随时间变化先增加后减小;与低LET的γ射线相比,高LET辐射诱发的焦点平均尺寸明显变大,LET越高焦点尺寸越大且保持时间越长。

γH2AX预测肺癌患者化疗敏感性的研究

目的:探讨应用磷酸化组蛋白(γH2AX)预测肺癌患者对顺铂、卡铂、吉西他滨、阿霉素等化疗药物敏感性的可行性和可靠性。方法:原代培养肺癌患者肿瘤细胞,分别予不同浓度的化疗药作用后,采用流式细胞术(FCM)、免疫细胞化学法(ICC)、MTT比色法,比较并分析各不同浓度药物作用下肿瘤细胞中γH2AX灶点数、γH2AX阳性细胞百分数及细胞增殖抑制率的差异。结果:在同种药物不同浓度作用下,肿瘤细胞内γH2AX灶点数、γH2AX阳性细胞百分数及细胞增殖抑制率之间的差异具有统计学意义(P均<0.05),并相互之间具有相关性(P均<0.05),不同药物之间γH2AX的表达差异有统计学意义(P均<0.05),并与细胞增殖抑制率间具有相关性(P均<0.05)。结论:肿瘤细胞内γH2AX的表达能在一定程度上预测其对化疗药物的敏感性并对指导肿瘤患者的个体化治疗有重要意义。

低剂量辐射诱导小鼠骨髓单个核细胞γH2AX形成的时间剂量效应

目的探讨正常造血组织在全身低剂量照射后的放射生物学效应。方法将96只雌性昆明小鼠随机分为8组,暴露于0～800mGyγ射线下。分别于照射后24、48、72h处死,制备单个核细胞悬液。加γH2AX抗体染色后应用流式细胞仪检测其荧光强度。结果单染及双染法结果均显示γH2AX表达呈J型曲线,所有时间剂量组中,100mGyγ射线在48h时诱发的DSB数量最少。结论γH2AX的表达水平可以反映DNA双链断裂及修复情况。造血组织低剂量照射后可以产生兴奋效应。

H2AX参与白血病细胞诱导NK细胞凋亡的研究

目的初步探讨H2AX磷酸化水平是否参与白血病细胞系诱导自然杀伤(NK)细胞凋亡。方法体外培养NK92细胞,利用Fas激活性抗体CH11作用于NK92细胞,用流式细胞术检测NK92细胞的凋亡情况;检测NK92细胞凋亡的同时用流式细胞学技术检测H2AX磷酸化的水平。结果随着CH11浓度(0、2.5、5、10、20μg/ml)的升高,NK92细胞凋亡现象明显增加,并呈剂量依赖性,表明NK细胞凋亡随着CH11浓度的升高而增加;同时H2AX的磷酸化水平也随CH11浓度(0、5、10、40、80μg/ml)逐步增高,并呈剂量依赖性,提示H2AX的磷酸化作用参与细胞凋亡过程,并且随浓度的增加而增加。结论 H2AX的磷酸化作用参与白血病细胞诱导NK细胞的凋亡过程。

γ-H2AX与肿瘤治疗

DNA双链断裂后可诱导位于丝氨酸-139位C端保守区域内的H2AX磷酸化形成γ-H2AX，组蛋白H2AX在DNA损伤修复、细胞周期检查点调控、基因组稳定的维持和肿瘤抑制中起着重要作用。随着研究的不断深入，其在医学中的应用将越来越广泛。

DNA损伤标志物γ-H2AX及其在毒性测试应用中的研究进展

当DNA受到攻击尤其是发生DNA双链断裂(DSB)后,组蛋白H2AX的139位丝氨酸迅速磷酸化,生成磷酸化H2AX即γ-H2AX。γ-H2AX在DSB位点大量聚集并形成焦点,参与DNA的损伤修复,且γ-H2AX焦点数与DSB数量成正比。目前研究表明,γ-H2AX是表征DNA损伤的特异性生物标志物,可作为基因毒性的特异性效应指标。旨在检测γ-H2AX的试验(简称γ-H2AX试验)已被应用于众多与DNA损伤相关的基础研究和医学诊断中。本文介绍γ-H2AX的生成及生物学意义,论述基于免疫化学技术及质谱技术的γ-H2AX试验在体外基因毒性评价中的应用、γ-H2AX试验与其他基因毒性试验的性能对比及γ-H2AX与其他毒性终点标志物的互补性,并对γ-H2AX试验在基因毒性风险评估中的应用前景予以展望。

DNA修复蛋白磷酸化组蛋白H2AX在胃癌中的表达及其意义

DNA双链断裂（DSBs）是真核生物后果最严重的DNA损伤之一。如果DSBs不能及时而准确地修复，可能导致基因突变、基因组不稳定、

^(56)Fe^(17+)重离子束对人淋巴细胞磷酸化组蛋白H2AX表达影响研究

目的探讨^(56)Fe^(17+)重离子束对人淋巴细胞磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)表达的影响。方法取非洲淋巴细胞瘤病毒转化正常人B淋巴细胞(Peng-EBV细胞),分别予照射剂量为0.0(对照组)、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0Gy的^(56)Fe^(17+)重离子照射,照射剂量率为0.23~0.55 Gy/min,分别于照射后0、2、4、8、48及72 h采用流式细胞术检测细胞γH2AX的表达量。结果γH2AX表达水平在56Fe12+重离子照射剂量与照射后处理时间之间存在交互效应(P<0.01)。照射后2~72 h,γH2AX的表达水平在照射剂量为0.3~2.0 Gy时均高于同时间点对照组(P<0.05)。在0.3~2.0 Gy范围内,γH2AX的表达水平在照射后8~72 h均低于同组照射后2和4 h时间点的表达水平(P<0.05)。当照射剂量为0.5、1.0或2.0 Gy时,γH2AX的表达水平照射后72 h内呈随着照射后时间的延长而下降的趋势(P<0.05)。在照射后2~4 h,当照射剂量为0.0~1.0 Gy时,γH2AX表达水平随照射剂量增加而增加(P<0.01)。结论在照射剂量为0.0~1.0时,^(56)Fe^(17+)重离子诱导的Peng-EBV细胞γH2AX表达水平于照射后2~4 h内存在剂量-响应关系。