基于流式细胞术的组蛋白γ-H2AX磷酸化检测方法的建立

目的:建立基于流式细胞术的生物标记物γ-H2AX自动化检测方法,并探讨此方法用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的前景。方法:试验分为不添加体外代谢活化系统(-S9)长时(24 h)处理组和添加体外代谢活化系统(+S9)短时(4 h)处理组,分别采用CCK-8方法选择4个不同浓度的依托泊苷(ETO)和环磷酰胺(CP)处理人成淋巴TK6细胞,24 h后收获细胞,采用连接荧光分子的γ-H2AX抗体和核酸染料SYTOX Green双色标记,使用高通量流式细胞仪分析组蛋白H2AX磷酸化(γ-H2AX)阳性的细胞比例。结果:与溶剂对照组比较,-S9 24 h处理组,不同浓度的依托泊苷诱导产生的γ-H2AX阳性细胞比例显著增加,量效关系明显(r=0.999,P<0.05);+S9 4 h处理组,不同浓度的环磷酰胺诱导产生的γ-H2AX阳性细胞比例亦显著增加,量效关系明显(r=0.988,P<0.05)。结论:流式细胞仪可快速、准确地分析体外培养的TK6细胞中γ-H2AX的变化,本试验初步建立了基于流式细胞术的组蛋白γ-H2AX磷酸化检测方法。

磷酸化组蛋白H2AX介导的DNA损伤精子受精卵内修复

成熟精子易受外界影响产生DNA损伤,却缺乏DNA损伤修复系统。由于DNA损伤精子仍具有受精能力和发育潜力,其损伤修复可能发生在受精后。遗憾的是,DNA损伤精子受精后的修复机制尚不清楚。研究发现磷酸化组蛋白H2AX(histone H2AX phosphorylation,γH2AX)参与了DNA损伤精子受精后的修复。本综述主要探讨DNA损伤精子受精后受精卵内经由γH2AX介导修复的可能机制。

γH2AX和53BP1蛋白在肺正常上皮细胞DNA氧化损伤反应中的表达

目的探讨肺正常上皮细胞(human bronchial epithelial cells,HBE)中磷酸化组蛋白H2AX(phosphorylated H2AX,γH2AX)和p53结合蛋白1(p53-Binding protein 1,53BP1)在DNA氧化损伤反应中的表达。方法用0、25、50、100、200、400μmol/L过氧化氢(H2O2)处理HBE细胞1 h,对其造成氧化损伤引起DNA双链断裂(double strand breaks,DSBs);CCK-8比色法检测H2O2对HBE细胞活性的影响,流式细胞术检测细胞凋亡情况,荧光显微镜检测HBE细胞核内γH2AX和53BP1蛋白的聚集情况,western blot检测γH2AX、53BP1、BRCA1蛋白的表达水平。结果与对照组比较,25μmol/L H2O2处理组细胞活性(1.07±0.01)升高,50、100、200、400μmol/L H2O2处理组细胞活性(分别为0.97±0.01,0.96±0.01,0.95±0.01和0.94±0.01)降低,差异具有统计学意义(F=50.35,P<0.01)。细胞凋亡检测结果显示,与对照组[(4.65±0.32)%]比较,50、100、200、400μmol/L H2O2处理组细胞凋亡率[分别为(7.54±0.57)%、(7.84±0.68)%、(8.40±0.50)%和(14.03±1.03)%]升高(F=35.879,P<0.01)。与对照组比较,经25、50、100、200、400μmol/L H2O2处理后γH2AX的平均荧光强度升高(F=223.97,P<0.01),而经50、100、200、400μmol/L H2O2处理后53BP1的平均荧光强度降低(F=117.78,P<0.01);western blot结果显示,随着H2O2浓度升高,γH2AX蛋白表达水平升高,BRCA1和53BP1的表达水平下降,差异均具有统计学意义(F分别为96.20,11.55,21.92,P均<0.01)。结论在H2O2导致HBE细胞的氧化损伤中,γH2AX可作为DNA氧化损伤标志物,但53BP1的表达下降提示HBE细胞可能通过其他途径进行DNA氧化损伤的修复。

DNA损伤标志物γ-H2AX及其在毒性测试应用中的研究进展

当DNA受到攻击尤其是发生DNA双链断裂(DSB)后,组蛋白H2AX的139位丝氨酸迅速磷酸化,生成磷酸化H2AX即γ-H2AX。γ-H2AX在DSB位点大量聚集并形成焦点,参与DNA的损伤修复,且γ-H2AX焦点数与DSB数量成正比。目前研究表明,γ-H2AX是表征DNA损伤的特异性生物标志物,可作为基因毒性的特异性效应指标。旨在检测γ-H2AX的试验(简称γ-H2AX试验)已被应用于众多与DNA损伤相关的基础研究和医学诊断中。本文介绍γ-H2AX的生成及生物学意义,论述基于免疫化学技术及质谱技术的γ-H2AX试验在体外基因毒性评价中的应用、γ-H2AX试验与其他基因毒性试验的性能对比及γ-H2AX与其他毒性终点标志物的互补性,并对γ-H2AX试验在基因毒性风险评估中的应用前景予以展望。

幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A蛋白不同片段对胃癌细胞γH2AX表达的影响

目的探讨幽门螺杆菌(H.pylori)细胞毒素相关基因A(CagA)蛋白不同片段对胃癌细胞磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)表达的影响。方法取前期分离的H.pylori东亚株GZ7及其CagA敲除株H.pylori GZ7ΔCagA感染的癌细胞株AGS,采用免疫荧光方法检测DNA双链断裂标志物γH2AX的表达;构建不同序列的CagA表达载体(载体a、b、c、d、e),转化大肠杆菌,提取质粒后测序鉴定,将鉴定后的载体转染AGS,采用免疫荧光方法检测γH2AX的表达,并通过流式细胞术检测细胞周期。结果成功鉴定了含不同片段的CagA载体;H.pylori GZ7感染的胃癌细胞AGS核内γH2AX的表达高于H.pylori GZ7ΔCagA感染的细胞(P<0.05);与NC组比较,不同序列CagA载体转染后胃癌细胞AGS中γH2AX表达均有增加(P<0.05或P<0.01),且载体b、c及d表达增加较明显(P<0.01);载体a和c转染后的胃癌细胞AGS的G0/G1期细胞比例升高(P<0.05),载体b、c、d及e转染后胃癌细胞AGS的G2/M期比例明显升高(P<0.01)。结论CagA是H.pylori感染诱导胃癌细胞DNA双链断裂的重要因素,CagA中的EPYIA基序是这种DNA损伤的重要结构。

γ射线诱导人淋巴细胞损伤及磷酸化组蛋白H2AX和ATM表达

目的探讨人外周血经不同剂量”℃0 γ射线照射后淋巴细胞损伤情况，以及与磷酸化的H2AX、ATM表达的关系。方法永生化淋巴细胞及人新鲜外周血淋巴细胞经0-8Gy ^60Co γ射线照射后0.5h，分别采用Westernblot和流式细胞术检测磷酸化ATM和1-H2AX的表达情况，并通过CB微核法检测受照射后人外周血淋巴细胞微核验证细胞损伤程度。结果流式细胞检测发现人外周血淋巴细胞照射后0.5h，,γ-H2AX表达的剂量效应关系呈线性平方模式，其拟合曲线为：Y=3.96＋11.29D-0.45D。，而相同方法检测磷酸化ATM蛋白的表达未见明显变化。Westernblot检测结果表明，照射后0．5h，各受照射组磷酸化ATM表达在0．1～8Gy范围内具有呈剂量依赖性增高的趋势。人外周血淋巴细胞微核结果显示，γ射线照射后DNA损伤情况明显加重，随吸收剂量的增加，微核细胞率明显增多。结论”Co γ射线可诱导DNA双链断裂，随着吸收剂量的增加，微核率明显增加，磷酸化的H2AX、ATM表达水平亦明显增高，本研究为辐射损伤及辐射事故生物剂量估算领域的研究提供了理论依据。

重离子所致DNA双链断裂损伤修复的γH2AX焦点响应

DNA双链断裂(DSB)是电离辐射所致基因组DNA的主要和最严重的损伤类型,磷酸化组蛋白γH2AX能比较特异地在DSB处形成焦点,是DSB的分子标志物之一。比较了重离子~7Li、^(12)C与γ射线辐照小鼠MEF细胞诱发γH2AX焦点的规律特征。结果显示,诱发形成的平均每个细胞的γH2AX焦点数目与照后时间相关,表达峰值出现在照后2 h,但不同类型辐射高表达的持续时间不同。在相同剂量下,致焦点形成率与辐射的LET值相关,LET值越高,形成率越大。γ射线诱发的γH2AX焦点尺寸随照后时间无明显变化,高LET重离子诱发的γH2AX焦点尺寸随时间变化先增加后减小;与低LET的γ射线相比,高LET辐射诱发的焦点平均尺寸明显变大,LET越高焦点尺寸越大且保持时间越长。

DNA修复蛋白磷酸化组蛋白H2AX在胃癌中的表达及其意义

DNA双链断裂（DSBs）是真核生物后果最严重的DNA损伤之一。如果DSBs不能及时而准确地修复，可能导致基因突变、基因组不稳定、

^(56)Fe^(17+)重离子束对人淋巴细胞磷酸化组蛋白H2AX表达影响研究

目的探讨^(56)Fe^(17+)重离子束对人淋巴细胞磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)表达的影响。方法取非洲淋巴细胞瘤病毒转化正常人B淋巴细胞(Peng-EBV细胞),分别予照射剂量为0.0(对照组)、0.1、0.3、0.5、0.7、1.0、2.0Gy的^(56)Fe^(17+)重离子照射,照射剂量率为0.23~0.55 Gy/min,分别于照射后0、2、4、8、48及72 h采用流式细胞术检测细胞γH2AX的表达量。结果γH2AX表达水平在56Fe12+重离子照射剂量与照射后处理时间之间存在交互效应(P<0.01)。照射后2~72 h,γH2AX的表达水平在照射剂量为0.3~2.0 Gy时均高于同时间点对照组(P<0.05)。在0.3~2.0 Gy范围内,γH2AX的表达水平在照射后8~72 h均低于同组照射后2和4 h时间点的表达水平(P<0.05)。当照射剂量为0.5、1.0或2.0 Gy时,γH2AX的表达水平照射后72 h内呈随着照射后时间的延长而下降的趋势(P<0.05)。在照射后2~4 h,当照射剂量为0.0~1.0 Gy时,γH2AX表达水平随照射剂量增加而增加(P<0.01)。结论在照射剂量为0.0~1.0时,^(56)Fe^(17+)重离子诱导的Peng-EBV细胞γH2AX表达水平于照射后2~4 h内存在剂量-响应关系。

γH2AX、53BP1及RAD51焦点用于分析DNA双链断裂损伤

γH2AX、53BP1及RAD51焦点(foci)是DNA双链断裂(DSBs)损伤修复的评价指标。其中,γH2AX分析应用最为广泛,但最新有研究发现其并不完全与DSBs损伤一致。系统分析了DNA损伤时γH2AX、53BP1及RAD51 foci的动力性变化及其在DSBs损伤评估中的合理应用。结果表明,在电离辐射处理时,γH2AX和53BP1 foci具有高度一致性,均可反映DSBs损伤及修复的动力性变化,而RAD51 foci仅出现在部分损伤细胞中,与其主要参与同源重组修复一致。在喜树碱(CPT)处理时,γH2AX呈现两种染色类型(亮而离散的foci和泛核磷酸化),53BP1 foci仅出现在亮而离散的γH2AX foci阳性细胞且与其高度一致。结果提示,单独γH2AX染色阳性并不能准确代表DSBs损伤,而应结合53BP1等染色来综合分析DSBs损伤程度;RAD51 foci分析仅能反映部分细胞的DSBs损伤修复(主要是同源重组)情况。

毛蕊花糖苷对中波紫外线所致小鼠皮肤损伤的保护作用研究

目的 研究毛蕊花糖苷对中波紫外线(UVB)照射所致小鼠皮肤损伤的保护作用。方法 将Balb/c小鼠随机分为正常对照组、UVB模型组、基质+UVB组、1%毛蕊花糖苷+UVB组、5%毛蕊花糖苷+UVB组、5%维生素E+UVB组,每组10只。除正常对照组外,其余4组小鼠采用UVB照射建立皮肤损伤模型,单次照射强度为0.326 mW·cm^(-2),每次照射10 min,隔日照射1次,共照射10次,累积照射剂量为1 956 mJ·cm^(-2)。基质组和各给药组小鼠分别于每次照射前30 min将不含药物的空白基质、1%毛蕊花糖苷乳膏、5%毛蕊花糖苷乳膏、5%的维生素E乳膏涂于小鼠背部脱毛处。末次照射24 h后,处死小鼠,取背部皮肤进行相关指标的检测:皮肤称质量及皮肤厚度测量检测皮肤水肿;苏木精-伊红(HE)染色观察小鼠皮肤组织形态学特征;免疫组织化学法检测小鼠皮肤组织磷酸化的H2AX组蛋白(Phosphorylated histone H2AX,γH2AX)的表达;酶联免疫吸附法测定皮肤组织中环丁烷嘧啶二聚体(cyclobutyl pyrimidine dimers,CPDs)、6-4光产物(6-4photoproducts, 6-4PPs)和8-羟基-2-脱氧鸟嘌呤核苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine, 8-OHdG)的水平。结果 与正常对照组比较,UVB模型组小鼠皮肤出现水肿、粗糙、红肿、溃烂、表皮增厚等;γH2AX表达量明显升高(P<0.01);CPDs、6-4PPs、8-OHdG的含量均明显增加(P<0.01)。与UVB模型组比较,毛蕊花糖苷给药组小鼠皮肤组织的水肿、粗糙、红肿、溃烂、表皮增厚等症状明显改善;组织中γH2AX的表达明显降低(P<0.01);CPDs、6-4PPs、8-OHdG的含量明显减少(P<0.01)。结论 毛蕊花糖苷能改善UVB照射引起的小鼠皮肤损伤,且这种作用的发挥可能与其降低CPDs、6-4PPs和8-OHdG等因子的表达,改善DNA损伤有关。

DNA损伤修复相关因子在宫颈癌组织中的表达研究

目的探究DNA损伤修复相关因子[毛细血管扩张性共济失调突变因子(pATM)、磷酸化组蛋白H2AX(γH2AX)]在宫颈癌组织中的表达及其诊断意义。方法选取2018年2月至2019年8月于我院就诊的50例宫颈癌患者设置为试验组,另选择同期我院体检健康者50例作为对照组。两组研究对象均进行免疫组化染色,检验pATM、γH2AX的表达情况;通过磷酸化抗体检测手段检测两组研究对象的pATM、γH2AX水平。结果试验组的pATM、γH2AX mRNA的相对表达量明显高于对照组(P<0.05)。试验组pATM、γH2AX的阳性表达率明显高于对照组(P<0.05)。pATM、γH2AX高表达与宫颈癌的临床分期相关(P<0.05),与年龄、病理分化程度、化疗周期无关(P>0.05)。结论DNA损伤修复相关因子pATM、γH2AX在宫颈癌中高表达有利于疾病的的早期诊断和临床分期诊断,具有一定的临床价值。

吴茱萸汤对化疗性异食癖恶心呕吐模型大鼠干预效果与作用机制的初步研究

目的研究不同剂量吴茱萸汤对顺铂诱导的大鼠化疗相关呕吐及肠道黏膜炎症的药效并初步探讨其作用机制。方法灌胃复方(吴茱萸汤)使用飞行时间高分辨质谱法对其活性成分进行定性。48只SD大鼠随机分为对照组、模型组、不同剂量吴茱萸汤组(5、10、20 mL/kg)以及阳性对照组(托烷司琼),每组8只。观察造模后1、3、5、7 d大鼠异嗜高岭土情况;液质联用方法定量检测各组大鼠血清中5-羟色胺(5-HT)的浓度;HE染色和免疫荧光观察大鼠结肠组织变化以及磷酸化组蛋白H2AX(γ-H2AX)、白细胞共同抗原(CD45)的表达。结果吴茱萸碱、吴茱萸次碱为吴茱萸汤的主要成分。治疗后,与模型组比较,吴茱萸汤高、中剂量组大鼠异嗜高岭土的量明显减少、血清5-HT浓度显著降低(P<0.01);病理形态学观察可见,吴茱萸汤高、中剂量组对大鼠结肠黏膜具有保护作用,并降低了γ-H2AX及CD45的表达(P<0.01)。结论吴茱萸汤能治疗顺铂诱导的大鼠化疗后呕吐,并能减轻其肠道炎症反应,其作用机制可能与降低血清中5-HT的浓度,抑制肠道γ-H2AX及CD45的表达有关。

一种体外多终点遗传毒性检测方法

目的建立一种操作简单、快速和准确的体外多终点遗传毒性检测方法。方法将组蛋白γ-H2AX、P53蛋白、磷酸化组蛋白H3(p-H3)以及活化多腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP)4个生物标志物整合到γ-H2AX灶点试验中。DNA断裂剂依托泊苷(未加S9条件下,0.2,0.4,0.8和1.6 mg·L^(-1))、环磷酰胺(S9条件下,3.75,7.5,15和30 mg·L^(-1))和非整倍体诱导剂秋水仙素(未加S9条件下,0.0063,0.0125,0.025和0.05 mg·L^(-1))处理TK6细胞24 h,收获细胞、固定,洗涤后加入抗体标记,流式细胞仪检测γ-H2AX、P53蛋白和p-H3荧光强度。选择4种不同作用机制的DNA断裂剂(有S9条件下,丝裂霉素C 0.05,0.1和0.2 mg·L^(-1),甲磺酸甲酯3,6和12 mg·L^(-1),苯并芘0.5,1和2 mg·L^(-1),顺铂2.5,5和10 mg·L^(-1);无S9条件下,分别加丝裂霉素C 0.025,0.05,0.1 mg·L^(-1),甲磺酸甲酯1.5,3和6 mg·L^(-1),苯并芘25,50和100 mg·L^(-1),顺铂1.25,2.5和5 mg·L^(-1))、2种非整倍体诱导剂(S9条件下,长春新碱0.005,0.01和0.02 mg·L^(-1),紫杉醇0.02,0.04和0.08 mg·L^(-1);未加S9条件下,长春新碱0.01,0.02和0.04 mg·L^(-1),紫杉醇0.005,0.01和0.02 mg·L^(-1))和3种不具有遗传毒性的化合物(有/无S9条件下,氯化钠125,250和500 mg·L^(-1),氨苄青霉素G 125,250和500 mg·L^(-1),盐酸普萘洛尔15,30和60 mg·L^(-1)),对该方法进行验证。结果在方法建立阶段,与溶剂对照组相比,无S9依托泊苷组和有S9的环磷酰胺组γ-H2AX和P53蛋白荧光强度增加,且依托泊苷组1.6 mg·L^(-1)和环磷酰胺30 mg·L^(-1)组组荧光强度为溶剂对照组的2倍以上,p-H3阳性细胞比例无显著升高;秋水仙素组γ-H2AX和P53蛋白荧光强度无明显变化,p-H3细胞比例为溶剂对照组2倍以上。在方法验证阶段使用多种不同作用机制的化合物验证得到的灵敏度(6/6)和特异性(3/3)均较高。结论建立了体外多终点遗传毒性检测方法,该方法具有应用于药物早期遗传毒性筛选和遗传毒性评价的潜力。

绿茶多酚表没食子儿茶素没食子酸酯对高脂高糖饮食诱导肥胖小鼠伤口愈合的影响

目的评估绿茶多酚表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)全身性给药对高脂高糖饮食(HFFD)诱导的肥胖小鼠伤口愈合障碍的干预效果。方法7~8周龄雄性C57BL/6J小鼠经60 kcal%高脂饲料和20%果糖水持续饲养10周后成为肥胖小鼠,周龄及相关条件具有可比性的正常饮食组小鼠为对照。在小鼠尾部进行全层切除伤口造模后,每天腹腔注射EGCG进行干预,连续给药21天。在第0、3、7、14、21天时测量小鼠体重,并对伤口部位进行拍照记录。干预完成后,采用苏木素-伊红(HE)染色法观察小鼠伤口新生皮肤组织形态学;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测小鼠皮肤组织中DNA双链断裂(DSB)特异性生物标志物磷酸化组蛋白H2AX(γ-H2AX)的表达水平。结果与正常饮食组小鼠比较,HFFD肥胖小鼠体重增重>30%(P<0.01),皮肤组织中γ-H2AX表达上调(P<0.05),14天时,模型组伤口面积为正常饮食组的1.97倍;21天时,模型组伤口面积为正常饮食组的4.49倍,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。正常饮食小鼠伤口部位新生皮肤可以重新形成完整的表皮细胞层,肥胖小鼠则表皮细胞过度增殖,基底层细胞和颗粒层细胞分布不典型,角质层变薄。腹腔注射EGCG可使肥胖小鼠皮肤组织中γ-H2AX表达下调(P<0.05)。与模型组小鼠比较,肥胖小鼠经EGCG5.0、10.0mg/kg干预后,21天时,中剂量组伤口面积为模型组的0.32倍;高剂量组伤口面积为模型组的0.13倍,差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01);伤口新生皮肤表皮细胞层结构与正常饮食小鼠相似。结论EGCG可降低高脂高糖饮食诱导的肥胖小鼠体内DNA损伤,促进伤口愈合及皮肤组织结构重塑,但机制还有待深入研究。

头孢噻肟钠对斑马鱼SOD活性、MDA含量及DNA损伤的影响

研究了不同浓度头孢噻肟钠溶液暴露15 d对斑马鱼肌肉组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)和磷酸化组蛋白H2AX(γ-H2AX)含量的影响.结果表明,低浓度组(1、5 mg·L-1)暴露时,斑马鱼肌肉组织SOD活性呈现不规则变化;随着暴露浓度增加(25 mg·L-1),SOD活性在实验初期(3 d)被抑制,后期逐渐被诱导,并在12 d达到峰值;高浓度(125 mg·L-1)头孢噻肟钠显著抑制了鱼体内SOD活性,6 d时活性达到最小值.进一步测定了斑马鱼肌肉组织中MDA含量的变化,发现其与SOD活性呈负相关性,且在1 mg·L-1和125 mg·L-1暴露时尤为明显.在所选暴露浓度,斑马鱼肌肉中γ-H2AX含量均呈现先升高后降低的变化趋势.1、5、25 mg·L-1浓度组在6 d时达到峰值,125 mg·L-1浓度组在9 d时达到峰值.随着暴露时间的增加,γ-H2AX含量均降至空白水平,表明鱼体对产生的DNA损伤有自我修复功能.本研究表明,斑马鱼对头孢噻肟钠的氧化胁迫反应可能是导致其DNA损伤的重要机制之一.

工作场所化学物质DNA损伤的早期检测

化学物质的遗传毒性对人体的远期影响难以估量,因此,对DNA损伤进行及时检测,对损伤防治具有重要意义。本文拟对目前常用的DNA损伤检测方法进行简介及评价。