硅锆复合氧化物的制备、表征及其在磷酸化肽段富集中的应用

采用溶胶-凝胶法制备了氧化硅-氧化锆复合氧化物(SiO2-ZrO2),并对其物理与化学性质进行了详细地表征。以α-酪蛋白的酶解产物为探针,比较了氧化硅-氧化锆复合氧化物与氧化锆对磷酸化肽段的富集能力。结果表明:在pH<2时富集,SiO2-ZrO2对磷酸化肽的选择性要优于ZrO2;使用SiO2-ZrO2材料时,多磷酸化肽段的回收率更高。结合MALDI-TOFMS检测技术,SiO2-ZrO2成功地应用于脱脂牛奶酶解产物中磷酸化肽的分离和富集。

介孔氧化铁材料快速、高效富集分离磷酸化肽段和蛋白的新方法研究

以0.1μmol/Lβ-casein磷酸化蛋白酶解液为对象,利用在酸性条件下对PO43-能够特异性吸附的氧化铁材料为新载体,对介孔氧化铁材料富集分离磷酸化肽段的孵育液酸含量、孵育液有机溶剂含量和洗脱液选择的条件进行了优化,结果表明:室温条件下,在含有0.1%乙酸和30%乙腈的孵育液中孵育5min后,经1mol/LNH3.H2O溶液的洗脱,介孔氧化铁可有效地将磷酸化肽段从蛋白酶解液中富集分离。本方法也可以选择性地提取α-casein磷酸化蛋白,实现了简单、快速、高效的磷酸化肽段和蛋白的富集分离。同时,通过MALDI-TOF串级质谱分析,成功地完成了在优化条件下分离出的磷酸化肽段磷酸位点的鉴定。

磷酸化肽段分离富集方法研究进展

目前磷酸化肽段鉴定主要依赖于质谱技术,但磷酸化肽段的低丰度性以及来自非磷酸化肽段的干扰等因素,影响质谱的分析与鉴定。因此质谱分析前磷酸化肽段的富集,是深入研究磷酸化蛋白质组学的先决条件。该文介绍了磷酸化蛋白质组学中传统的以及新建立的一些磷酸化肽段分离富集方法的原理及优缺点,这些方法包括固相金属离子亲和色谱法(IMAC)、金属氧化亲和色谱法(MOAC)、强阳/阴离子交换色谱法(SCX/SAX)、亲水相互作用色谱法(HILIC)、静电排斥亲水相互作用色谱法(ERLIC)、化学衍生法、MALDI靶盘富集法以及多种富集方法相结合。

妊娠合并宫颈癌中唾液内源性磷酸化肽段的诊断价值

目的研究唾液内源性磷酸化肽段在妊娠合并宫颈癌中的诊断价值,筛选出可能的诊断标志物。方法选择2016年至2018年在武警福建省总队医院、上海第一妇婴和福建省人民医院接受妊娠合并宫颈癌检查的36例患者,按临床分期分为Ⅰ期组12例、Ⅱ期组13例、Ⅲ期组11例,同期在武警福建总队医院妇产科生产的健康孕妇38例作为健康孕妇组。使用唾液采集管分别采集每位健康孕妇和患者的唾液。使用磷酸化肽段富集试剂盒处理唾液样品,得到含内源性磷酸化肽段的洗脱液。使用质谱仪分析洗脱液样品中内源性磷酸化肽段的种类及丰度。结果在全部74例受试者的唾液样品中,共鉴定到25条内源性磷酸化肽段。其中,健康孕妇唾液中鉴定到22条(88%,22/25),Ⅰ期妊娠合并宫颈癌患者唾液中鉴定到20条(80%,20/25),Ⅱ期患者唾液中鉴定到21条(84%,21/25),Ⅲ期患者唾液中鉴定到19条(76%,19/25)。15条(60%,15/25)唾液磷酸化肽段的丰度在健康孕妇和妊娠合并宫颈癌患者之间差异有统计学意义(P<0.05)。共有11条唾液内源性磷酸肽段(44%,11/25)是潜在的妊娠合并宫颈癌诊断标志物,其质荷比(m/z)分别为1076.4、1230.3、1270.3、1461.4、1589.4、1784.6、2004.7、2119.7、2323.7、2541.8、2722.8。其中,质荷比为2119.7的唾液内源性磷酸化肽段对Ⅰ期妊娠合并宫颈癌患者的诊断准确率最高,可达66%。结论根据特定唾液内源性磷酸化肽段的丰度可以在一定程度上区分健康和Ⅰ~Ⅲ期妊娠合并宫颈癌患者,唾液内源性磷酸化肽段具有早期诊断妊娠合并宫颈癌的价值。

磷酸化蛋白质组学研究中磷酸化肽段富集与分离方法研究进展

对磷酸化蛋白质组(phosphoproteome)进行系统深入的研究依赖于高重复性和特异性的磷酸化肽段富集与分离方法。目前发展了多种不同原理的磷酸化肽段富集方法,它们往往具有不同的选择性和特异性,因此,根据不同的研究目的选择最适合的富集方法显得尤为重要。本文综述了基于亲和色谱法(affinity chromatography)、免疫沉淀法(immunoprecipitation)、化学衍生法(chemical derivatization)、色谱法(chromatography)和其他新发展方法的磷酸化肽段富集方法,详细介绍了各自的优缺点及相关的优化与改进策略。此外,还简单介绍了磷酸化肽段富集与预分方法的不同组合的研究进展。

介孔氧化钛对多磷酸化肽段的高灵敏度分析

蛋白质的磷酸化修饰广泛存在于细胞生命活动进程中,在细胞的分化、繁殖、代谢及信号转导等方面均发挥着重要作用.MALDI-TOF-MS技术因其高灵敏度等优点,已成为蛋白质研究的重要分析工具之一.由于磷酸化蛋白的天然丰度和离子化效率较低、检测信号被抑制等缺点,因此需要发展新的分析方法以提高其分析灵敏度和选择性.本文建立了基于介孔氧化钛的多磷酸化肽段高效分析方法,同时利用了TiO2对磷酸化肽的选择性吸附作用和介孔材料特殊空间结构所形成的对多磷酸肽的动力学及热力学吸附效应,结合MALDI-TOF-MS技术,成功地实现了对混合溶液中多磷酸化肽的选择性富集和高灵敏度分析鉴定,与其他方法相比,分析性能得到明显的提高,可实现对低量磷酸化肽段的识别与检测.

MALDI-TOF质谱法分析与鉴定羊乳中的磷酸肽

基于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术建立一种羊乳中磷酸化肽段的检测方法。以商品化二氧化钛(Ti O2)为富集材料用于羊乳中低丰度磷酸肽的富集,并优化了商品化Ti O2富集羊乳中磷酸肽的最佳吸附洗脱条件,得到的结果为,孵育缓冲液为乙腈∶水(50∶50,体积比)+1%三氟乙酸,洗脱液为氨水15%。接着探讨了脱脂对检测结果的影响,结果表明,通过MALDI-TOF MS分析实际乳磷酸肽时,需要对乳类样品进行脱脂才能更完整的鉴定磷酸肽,从羊乳中鉴定出八个磷酸化肽段通过Mascot数据库检索。本研究为乳类磷酸肽指纹图谱的建立提供了理论基础,指纹图谱的建立能够应用于掺假乳的快速鉴定。

基于强阳离子交换色谱与等电聚焦的磷酸化蛋白质组学分离策略比较

比较分析了强阳离子交换(SCX)与等电聚焦(IPG-IEF)技术在磷酸化蛋白质组学中的应用。采用3种标准磷酸化蛋白对SCX与IPG-IEF两种技术对磷酸化肽段富集的有效性进行考察。以HepG2细胞为复杂样本,考察SCX与IPG-IEF在实际样本中的应用情况。对SCX与IPG-IEF技术在18O标记的磷酸化蛋白质组定量研究中的应用情况进行考察。蛋白鉴定采用高准确度、高灵敏度、高分辨率的LTQ-FTICR-MS/MS质谱仪。实验表明:SCX和IPG-IEF在大规模磷酸化肽段分离过程中均有效;在复杂样本中,SCX技术的分离效果优于IPG-IEF;IPG-IEF的重复性好于SCX;在磷酸化蛋白质组定量分析结果表明,IPG-IEF技术的稳定性优于SCX。本研究为根据不同实验目的而选择适当的磷酸化蛋白质组预分离技术提供了有用信息。

MALDI-TOF质谱法分析与鉴定骆驼乳中的磷酸肽

建立一种基于基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)为基础的方法检测并鉴定骆驼乳中的磷酸化肽段。通过商品化的二氧化钛(Ti O_2)材料富集驼乳中低丰度的磷酸肽,并优化出Ti O_2富集材料与驼乳中磷酸肽相互作用最适宜的吸附洗脱条件,孵育缓冲液:乙腈/水(50∶50,v/v)+1%三氟乙酸,洗脱液为10%氨水。再将得到的磷酸肽溶液用MALDI-TOF MS方法检测,用Mascot数据库进行数据检索,能够从驼乳中鉴定出四个磷酸化肽段。本研究为不同哺乳动物乳中磷酸化肽段的检测提供了一些新的思路且能够应用于掺假乳的鉴别。

质谱技术分析磷酸化蛋白的研究进展

蛋白质的可逆磷酸化是最重要的翻译后修饰之一,几乎参与生命活动的所有过程。虽然对于磷酸化蛋白的全面解析还存在巨大挑战,质谱已逐渐被人们认为是挑战这一领域的有利工具。质谱技术分析磷酸化蛋白质的方法包括利用抗体免疫沉淀、磷酸化蛋白胶染色、固定化的金属亲和层析柱、化学标签、强阳离子交换等技术富集磷酸化蛋白或肽段,串联质谱、电子俘获分析等技术检测磷酸化肽段并鉴定磷酸化位点,以及同位素标签对蛋白质磷酸化水平进行定量等。

酪氨酸磷酸化蛋白质组学技术研究进展及其在生物医学研究中的应用

在酪氨酸磷酸化蛋白质组学的研究过程中,酪氨酸磷酸化位点的富集是最重要的一步。目前常用的富集方法是抗体亲和富集或SH2 superbinder富集。此外,通过质谱与生物信息学等技术,可实现大规模酪氨酸磷酸化位点的鉴定。对酪氨酸磷酸化蛋白质组学进行深度覆盖研究,揭示癌症发生发展过程中失调的激酶,将有助于深入理解癌症的发生发展过程;且由于75%的致癌基因是酪氨酸激酶基因,酪氨酸激酶抑制剂作为抗癌药物受到了越来越多的关注。应用酪氨酸磷酸化蛋白质组学技术,可以鉴定与癌症等重大疾病相关的酪氨酸激酶,从而帮助找到酪氨酸激酶抑制剂。总之,酪氨酸磷酸化蛋白质组学技术可以在酪氨酸激酶鉴定、酪氨酸激酶抑制剂研究及酪氨酸磷酸化信号通路研究等生物医学领域中得到很好的应用。