定量磷酸化蛋白质组解析17β-雌二醇致死效应的细胞调控过程

17β-雌二醇(E2)是人体内一种重要的内分泌激素,在生理浓度下(0.2~1.0 nmol/L)对生殖系统、乳腺等靶器官的生长发育起着重要的调节作用。但很多研究表明,高剂量(μmol/L~mmol/L)的E2能够诱导肿瘤组织消退和细胞凋亡,其具体调控机制尚不明确。本工作聚焦于高剂量(μmol/L)的E2致死效应,首先分析了μmol/L水平的E2对HeLa细胞表型的影响,发现在1~10μmol/L下E2以浓度依赖的形式抑制HeLa细胞增殖,并诱导HeLa细胞发生死亡,其中,用5μmol/L E2处理2天后可使约74%的HeLa细胞增殖受到抑制,并引起约50%的HeLa细胞死亡。在此基础上,为了探究高剂量E2诱导细胞死亡的内在调控过程,将基于固相萃取(SPE)的固定化钛离子亲和色谱技术(Ti 4+-IMAC)与基于数据非依赖采集模式(DIA)的蛋白质组定量技术结合,用于筛选HeLa细胞内参与高剂量(μmol/L)E2致死效应调控过程的磷酸化位点。最终,在5μmol/L E2和二甲基亚砜(DMSO)处理的HeLa细胞中共鉴定到超过10000个磷酸化位点;t检验分析发现,在E2处理后,有924个磷酸化位点(对应599个蛋白质)的丰度发生了显著变化(显著性水平(p)<0.01,|log 2(倍数变化)|≥1),推测其可能参与调控E2致死效应过程。此外,有453个磷酸化位点(对应325个蛋白质)仅单独发生在E2或DMSO处理后的HeLa细胞样品中,表明这些磷酸化位点在E2处理后发生了磷酸化或去磷酸化,也可能参与E2致死效应的调控过程。分别对以上两种方式筛选的E2调控的磷酸化蛋白质进行富集分析,发现这些磷酸化蛋白质主要参与细胞分裂、核糖体/核质转运、信使核糖核酸(mRNA)加工/剪接及转录等过程,表明高剂量的E2可能通过调控核糖体及mRNA加工等过程影响蛋白质转录,进而诱导细胞发生死亡。此外,我们发现表皮生长因子受体(EGFR)和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)家族蛋白(包括MAPK1、MAPK4和MAPK14)上多个磷酸化位点的修饰水平在高剂量E2处理后发生了明显变化,表明EGFR和MAPK信号通路可能在雌激素诱导的细胞死亡中起着重要调控作用。本实验得到的磷酸化蛋白质组定量结果有助于进一步了解高剂量E2的内在调控过程,为后续解析高剂量E2的作用机制及疾病的治疗提供了参考。

柱花草响应炭疽菌侵染的差异磷酸化蛋白质组学分析

磷酸化是重要的蛋白翻译后修饰,在调节植物免疫方面起重要作用,但目前对柱花草与炭疽菌互作的磷酸化知之甚少。本文以太空诱变柱花草抗病株系‘2001-84’和感病株系‘2001-71’为试验材料,通过非标记定量磷酸化蛋白质组学,分析了两种株系接种炭疽菌前后的差异磷酸化蛋白。结果表明:在‘2001-84’和‘2001-71’中分别有138个和106个蛋白的磷酸化丰度特异性响应炭疽菌侵染。蛋白功能与代谢通路富集分析发现两者具有明显的差异:‘2001-84’特异性磷酸化蛋白主要定位在质膜附近,参与胞内信号传导,并显著富集在MAPK级联信号通路、植物激素信号传导、病原菌互作途径等代谢通路;‘2001-71’则更多的定位于细胞器膜上,参与细胞器的分解,代谢通路只在剪接体途径显著富集。通过对‘2001-84’特异性磷酸化蛋白进一步分析,发掘了跟抗病相关的蛋白。本文研究可为后续解析柱花草抗炭疽病的分子机制和培育柱花草抗病品种提供参考。

磷酸化蛋白质组学分析和定量技术的研究进展

蛋白质的磷酸化是一种可逆性的蛋白质翻译后修饰,在生物体内起着极为重要的作用.近年来蛋白质翻译后修饰日益成为蛋白质组研究的热点之一.定量磷酸化蛋白质组学方法和技术的快速发展为研究蛋白质磷酸化时空动态变化,更好地了解生物学功能调节网络奠定了坚实的基础.作为蛋白质组学研究的一个重要组成部分,定量磷酸化蛋白质组学因其磷酸化蛋白质所具有的独特特征,在技术和方法研究方面将面临更为严峻的挑战.综述了磷酸化蛋白质组学定量的一些分析技术和方法的发展现状、优缺点以及未来的发展趋势.

质谱技术解析磷酸化蛋白质组

蛋白质磷酸化是生物体内存在的一种普遍的调节方式 ,在细胞信号传递中占有极重要的地位 .质谱已逐渐被人们认为是挑战这一领域的有利工具 .综述了目前利用质谱技术分析磷酸化蛋白质的方法 ,包括利用固定化的金属亲和层析柱、抗体和化学标签技术富集目的分子 ,肽片段质量图和前体离子扫描 ( precusorionscans)等技术检测磷酸化肽段 ,串联质谱对磷酸化肽段测序鉴定磷酸化位点 ,以及引入质量标签对蛋白质的磷酸化水平进行定量等 .虽然现在已经有很多可行的方法用于分析磷酸化蛋白质 。

等电聚焦分离与^18O稳定同位素标记联用的磷酸化蛋白质组学定量方法研究

磷酸化蛋白质组学定量分析,要对磷酸化修饰富集技术和定量技术进行研究。基于此,本研究采用18O稳定同位素标记技术对胰蛋白酶酶解肽段混合物进行标记,并对其标记时间和标记后胰蛋白酶的变性条件进行优化。结果表明:在pH=4～5的KH2PO4缓冲体系中,37℃,标记反应持续19～24h,除了C-端肽之外,几乎所有的肽段都可达到100%标记;采用TCEP可以有效地抑制16O-18O回标现象。建立了与18O标记技术兼容性良好的IPG-IEF技术对磷酸化肽段进行选择性富集,富集后共从HepG2细胞中鉴定到491个磷酸化位点、362个磷酸化肽段和356个磷酸化蛋白,表明IPG-IEF在大规模磷酸化肽段分离富集中是有效的;最后与高准确度高灵敏度高分辨率的LTQ-FTICR质谱仪联用,建立了基于18O-IPG-IEF-LTQ-FTICR的磷酸化蛋白质组定量技术。实验结果表明,该技术可以实现磷酸化肽段的有效定性和定量。本研究为磷酸化蛋白质组学定量研究提供了实用技术。

模拟高原低压低氧暴露小鼠记忆损伤与脑海马体磷酸化蛋白质组学分析

目的观察低压低氧致小鼠记忆损伤及脑海马体蛋白磷酸化修饰水平的变化,探寻低压低氧引起记忆损伤的关键磷酸化修饰蛋白和通路。方法40只7~8周龄雄性C57BL/6小鼠,体质量(20±2)g,按体质量顺序编号后采用随机数字表法分为常氧组和低压低氧组(n=20)。常氧组小鼠在常氧条件下喂养,低压低氧组小鼠在模拟海拔6000 m的低压舱中喂养7 d。低压低氧暴露结束后进行Morris水迷宫实验和脑海马体组织磷酸化蛋白质组学检测。结果Morris水迷宫实验结果显示,与常氧组相比,低压低氧组小鼠逃避潜伏期显著延长[(89.66±3.27)vs(38.61±4.83)s,P<0.01]、游泳距离显著增加[(959.21±99.61)vs(550.39±59.43)cm,P<0.01]。磷酸化蛋白质组学分析共检测到显著差异表达磷酸化肽段136个,其中上调92个,来自79个蛋白;下调44个,来自42个蛋白。GO富集分析结果显示:这些差异磷酸化修饰蛋白主要分布在突触后密集区、非对称性突触和基底细胞膜,主要参与细胞连接组装、突触构成、突触中囊泡介导的运输、树突发育、认知等生物学过程。KEGG通路富集分析显示:差异磷酸化修饰蛋白质主要富集在胰岛素分泌、胰液分泌、谷氨酸能突触、内吞和长时程抑制等信号通路。在蛋白质相互作用层面,构成以AGAP2、SYNGAP1、DRP2、DRP3和PSD93等蛋白为核心的蛋白互作网络。结论低压低氧可致小鼠记忆损伤脑海马体磷酸化修饰蛋白及通路发生改变,AGAP2、SYNGAP1、DRP2、DRP3和PSD93可能是关键蛋白。

磷酸化蛋白质组学中的分离富集方法研究进展

蛋白质的磷酸化是一种可逆性的翻译后修饰,在细胞的增值、分化、信号转导以及转录与翻译调控、蛋白质复合体的形成、蛋白质降解等方面发挥着极为重要的作用。因此磷酸化蛋白的鉴定成为翻译后修饰研究的重要内容。但由于磷酸化蛋白的丰度较低,难以用质谱直接检测。为了解决这个问题,改善质谱对磷酸肽的信号响应,需要对磷酸化蛋白质或磷酸肽进行富集。本文系统地介绍了磷酸化蛋白组学研究中应用较为广泛和最新建立的各种分离富集方法的原理、特点、应用研究进展,包括抗体富集法、激酶特异富集法、亲和富集法、化学修饰法、多种色谱分离富集方法以及MALDI靶盘富集法。

寄生虫蛋白质磷酸化修饰及磷酸化蛋白质组学研究进展

蛋白质的磷酸化修饰是生命体内一种重要的且普遍存在的蛋白质翻译后修饰方式之一,蛋白质的磷酸化和去磷酸化是一种动态的生物调节过程,在生命过程中起着重要的作用。论文介绍了蛋白质磷酸化修饰的研究进展及其在寄生虫领域中的应用,并对其研究前景进行了展望。

草莓响应炭疽菌侵染的差异磷酸化蛋白质组学分析

以不同炭疽病抗性的草莓品种‘红颊’和‘甜查理’的茎组织为试验材料,采用非标记定量磷酸化蛋白质组学技术分析其在炭疽菌侵染胁迫后磷酸化蛋白组的变化。结果表明,‘红颊’和‘甜查理’中分别有154个和173个磷酸化蛋白在病菌侵染后发生了1.5倍以上的差异表达。功能注释归类分析发现,大部分差异磷酸化蛋白参与了大分子复合体形成及结构定位、刺激应答和信号转导等生物学过程。生物信息学分析进一步表明,相对于易感品种‘红颊’,高抗品种‘甜查理’差异磷酸化蛋白特异性表现出S*Y和T*F 2种保守结构域类型,且植物激素信号传导途径和碳固定途径都发生了更高程度的磷酸化。本研究结果揭示出,这些信号通路在防御病菌入侵过程中发挥了重要作用,为后续深入揭示草莓-炭疽病菌互作分子机制及草莓抗病新品种选育奠定了宝贵的理论研究基础。

植物磷酸化蛋白质组学的研究进展

蛋白质的磷酸化是一种最重要的蛋白质翻译后修饰方式之一。蛋白质的磷酸化和去磷酸化在生命过程中起着关键的调节作用。当前,磷酸化蛋白质组学的主要研究内容包括鉴定磷酸化蛋白、定位磷酸化位点、定量磷酸化水平,进而揭示磷酸化和去磷酸化在生命过程中所起的生物学功能。在介绍植物磷酸化蛋白组学的研究方法及目前进展的基础上,展望了植物磷酸化蛋白组学的研究前景。

同位素标记结合免疫印迹-化学发光法鉴定小鼠神经元磷酸化蛋白质组

创建一套简单、实用、灵敏、高效的分析鉴定磷酸化蛋白质组的优化方案。采用同位素标记、双向电泳、放射自显影等技术建立小鼠神经元磷酸化蛋白质组图谱,再用免疫印迹-持久性化学发光技术选择性地鉴定三种小鼠神经元磷酸化蛋白质——PI3Kr3、MEK1、PKCα。结果显示三种磷酸化蛋白质在双向电泳放射自显影图谱和双向电泳免疫印迹-化学发光图谱上的斑点基本匹配,提示本研究建立的以同位素标记和免疫印迹-化学发光法为核心的分析鉴定磷酸化蛋白质组的一整套优化方案灵敏度高、特异性强。

构建小鼠肝细胞磷酸化蛋白质组分析鉴定的方法模型

背景：磷酸化蛋白质组的分析鉴定是目前蛋白质组学技术研究的主要目标之一，然而以质谱为核心的鉴定技术尚不完善。目的：建立一种简便易行、适于在一般实验室普及的分析鉴定磷酸化蛋白质组的方法并应用于小鼠肝细胞磷酸化蛋白质组的模型。设计、时间及地点：观察对比实验，于2003-07／2004-06在泸州医学院生物化学教研室及医学分子生物学实验室完成。材料：封闭群乳昆明小鼠100只，年龄1-3d，体质量3-6g，雌雄各半；^32P-NaH2PO4由中国北京原子能研究所提供。方法：将长势相当的体外培养的乳小鼠肝细胞随机分成两组。一组作同位素^32P标记后液氮终止反应，裂解细胞，收集蛋白并定量，双向电泳分离蛋白，干胶及放射自显影，建立小鼠肝细胞磷酸化蛋白质组的放射自显影图谱，初步确定6种靶标磷酸化蛋白EPs15等；另一组直接裂解细胞，收集蛋白并定量，双向电泳分离蛋白后半干式电转移至PVDF膜，根据靶标蛋白EPs15等的理论等电点和分子量剪下6张小膜。主要观察指标：采用持久性化学发光检测技术确证初步鉴定的6种靶标蛋白EPs15等。结果：①小鼠肝细胞磷酸化蛋白质组的放射自显影图谱显示约100个蛋白质斑点，经PDQuest 2D软件结合蛋白质数据库初步鉴定出已知的6种磷酸化蛋白EPs15等。②6种靶标蛋白的免疫印迹-化学发光图谱上均只出现了1个特异蛋白质斑点，与放射自显影图谱上的斑点基本匹配。结论：实验建立的同位素标记结合免疫印迹-化学发光的方法分析鉴定磷酸化蛋白质组简单、实用、灵敏、高效。

人肾组织磷酸化蛋白质组二维凝胶电泳的建立与优化

目的:利用二维凝胶电泳法分离人肾组织磷酸化蛋白质组。方法:利用金属磷酸盐亲和层析树脂富集人肾组织磷酸化蛋白。样品浓缩除盐后,进行一维等电聚焦分离和二维SDS电泳分离提取人肾组织磷酸化蛋白。结果:成功提取了人肾组织磷酸化蛋白,并得到了磷酸化蛋白的双向凝胶电泳图谱。结论:磷酸化蛋白富集技术与二维凝胶电泳技术的结合是研究磷酸化蛋白质组的有效方法,为进一步研究人肾组织磷酸化蛋白奠定基础。

磷酸化蛋白质组学技术及其在肿瘤研究中的应用

磷酸化蛋白质组是指机体细胞在特定时间和空间上表达的所有磷酸化蛋白质;磷酸化蛋白质组学是在整体水平上研究磷酸化蛋白质在细胞中的组成成分、表达水平、修饰状态及相互作用规律的学科。近年来,磷酸化蛋白质学技术已广泛应用于肿瘤研究,为阐明肿瘤的发生机制,提高肿瘤的诊治水平提供了重要信息。

鼻咽癌组织与正常鼻咽上皮组织的差异磷酸化蛋白质组分析

目的:比较鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)组织与正常鼻咽上皮组织磷酸化蛋白质组差异,筛选差异磷酸化蛋白质,为揭示NPC的发病机制提供依据。方法:采用双向凝胶电泳技术(2-DE)分离NPC组织与正常鼻咽上皮组织的总蛋白质,蛋白质转膜后与抗酪氨酸磷酸化抗体进行Western印迹分析,图像分析识别差异磷酸化蛋白质点,电喷雾-四极杆-串联质谱(ESI-Q-TOF MS/MS)鉴定差异的酪氨酸磷酸化蛋白质,采用NetPhos软件预测蛋白质的酪氨酸磷酸化位点,并采用生物信息学方法对差异磷酸化蛋白质的功能和亚细胞定位进行分析。采用Western印迹检测差异蛋白质(phosphatidylethanolamine-binding protein 1)在正常鼻咽黏膜组织和鼻咽癌组织的总蛋白质中的磷酸化水平。结果:建立了NPC组织与正常鼻咽上皮组织的酪氨酸磷酸化蛋白质表达谱,识别了25个差异酪氨酸磷酸化蛋白质,共鉴定了13个差异酪氨酸磷酸化蛋白质,其中7个蛋白质的酪氨酸磷酸化水平在NPC组织中增强,而6个蛋白质的酪氨酸磷酸化水平降低。NetPhos软件预测和生物信息学分析结果显示,13个差异蛋白质均存在酪氨酸磷酸化位点,其功能涉及物质代谢、细胞结构、细胞防御以及信号转导。与正常鼻咽黏膜组织相比较,差异蛋白phosphatidylethanolamine-binding protein 1在鼻咽癌组织中磷酸化表达水平下调。结论:鉴定了13个可能与NPC发病相关的酪氨酸磷酸化蛋白质,为揭示NPC发病机制提供了科学论依据。

4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯对人胃癌SGC-7901细胞的磷酸化蛋白质组学研究

目的研究观察新型维甲酸衍生物4-氨基-2-三氟甲基苯基维甲酸酯(ATPR)作用于胃癌SGC-7901细胞后蛋白质的磷酸化情况来了解ATPR诱导分化作用的可能机制和作用靶点。方法 ATPR作用于胃癌SGC7901细胞48 h后,收集并提取总蛋白,通过胰蛋白酶酶解,Ti O2磁珠法富集磷酸肽,高分辨率液质联用仪器检测磷酸肽,使用Proteome Discoverer1.2软件寻找差异的蛋白质和磷酸化位点,利用生物信息学网站和DAVID、KEGG、IPA软件,分析这些磷酸化蛋白质的功能及亚细胞定位等信息。结果最终鉴定出109个蛋白质,其中45个磷酸化蛋白质,共有121个磷酸化位点,差异蛋白中有15个仅出现在ATPR组,20个仅出现在正常组。DAVID分析结果显示差异磷酸化的蛋白质参与调控细胞进程、生物进程、基因表达、细胞的代谢过程等;KEGG分析结果显示差异磷酸化蛋白质主要有参与ERBB信号通路、RNA的转运、内质网蛋白加工过程、p53信号通路等。IPA软件分析一些差异蛋白质之间的关联蛋白是泛素连接酶(UBC)。结论 ATPR对胃癌细胞SGC-7901细胞诱导分化的机制可能是通过作用于多种蛋白质或基因,如肝癌衍生生长因子(HDGF)、钙蛋白酶抑制蛋白(CAST)、ATP结合盒G亚族蛋白4(ABCG4)和腺苷酸环化酶关联蛋白1(CAP1)而发挥作用,并通过影响这些蛋白质的磷酸化从而实现ATPR对胃癌细胞的诱导分化作用。

磷酸化蛋白质组学方法在信号网络解析中的应用

信号转导是细胞对各种外界刺激的应答反应,蛋白磷酸化或去磷酸化是信号从胞外流向胞内并导致细胞效应过程中的关键机制。磷酸化蛋白质组学(phosphoproteomics)是采用蛋白质组学的分析方法,研究细胞中所有磷酸化蛋白质及其修饰过程,从整体上观察细胞中被修饰的磷酸化蛋白质的状态及其变化,进而分析特定磷酸化修饰对生命过程的调控作用及其分子机制。

小鼠肝细胞线粒体磷酸化蛋白质组的初步研究

目的提取小鼠肝细胞线粒体磷酸化蛋白并利用双向凝胶电泳技术对其进行分离。方法提取小鼠肝细胞线粒体蛋白并利用金属磷酸盐亲和层析树脂富集磷酸化蛋白后,进行一维等电聚焦分离和二维聚丙烯酰胺凝胶电泳分离,质谱鉴定感兴趣的蛋白点。结果成功提取了小鼠肝细胞线粒体磷酸化蛋白,并通过双向凝胶电泳分离技术成功建立了小鼠肝细胞线粒体磷酸化蛋白质组图谱。结论磷酸化蛋白纯化技术与二维凝胶电泳分离技术的结合是研究亚细胞器磷酸化蛋白质组的有效方法,为进一步全面鉴定和研究线粒体磷酸化蛋白的功能打下了基础。

磷酸化蛋白质组学研究现状

蛋白质磷酸化是生命活动最重要的一项翻译后修饰,与信号转导、细胞周期、生长发育以及癌变机制等许多生物学问题有着密切的关系。蛋白质磷酸化和去磷酸化作为原核和真核细胞表达调控的关键环节,了解其对功能的影响可以深入理解生命系统在分子水平的调控状况。目前磷酸化蛋白质组研究仍是功能基因组面临的重大课题,本文对此作一综述。

磷酸化蛋白质组学研究技术进展

翻译后蛋白质的修饰是目前蛋白质组学研究中的一个重要课题,蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式,蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的整个过程。近年来蛋白质组学技术的发展和应用为磷酸化蛋白质的定性、定量和功能研究提供了必要的技术,使大规模和系统性进行磷酸化蛋白质研究成为可能。本文综述了检测和鉴定磷酸化蛋白质的蛋白质组学方法。