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等电聚焦分离与^18O稳定同位素标记联用的磷酸化蛋白质组学定量方法研究 被引量:5
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作者 隋少卉 王京兰 +5 位作者 贾伟 卢庄 刘金风 宋丽娜 蔡耘 钱小红 《分析化学》 SCIE EI CAS CSCD 北大核心 2008年第8期1017-1023,共7页
磷酸化蛋白质组学定量分析,要对磷酸化修饰富集技术和定量技术进行研究。基于此,本研究采用18O稳定同位素标记技术对胰蛋白酶酶解肽段混合物进行标记,并对其标记时间和标记后胰蛋白酶的变性条件进行优化。结果表明:在pH=4~5的KH2PO4缓... 磷酸化蛋白质组学定量分析,要对磷酸化修饰富集技术和定量技术进行研究。基于此,本研究采用18O稳定同位素标记技术对胰蛋白酶酶解肽段混合物进行标记,并对其标记时间和标记后胰蛋白酶的变性条件进行优化。结果表明:在pH=4~5的KH2PO4缓冲体系中,37℃,标记反应持续19~24h,除了C-端肽之外,几乎所有的肽段都可达到100%标记;采用TCEP可以有效地抑制16O-18O回标现象。建立了与18O标记技术兼容性良好的IPG-IEF技术对磷酸化肽段进行选择性富集,富集后共从HepG2细胞中鉴定到491个磷酸化位点、362个磷酸化肽段和356个磷酸化蛋白,表明IPG-IEF在大规模磷酸化肽段分离富集中是有效的;最后与高准确度高灵敏度高分辨率的LTQ-FTICR质谱仪联用,建立了基于18O-IPG-IEF-LTQ-FTICR的磷酸化蛋白质组定量技术。实验结果表明,该技术可以实现磷酸化肽段的有效定性和定量。本研究为磷酸化蛋白质组学定量研究提供了实用技术。 展开更多
关键词 18O标记技术 等电聚焦 傅里叶交换离子回旋质谱(LTQ-FTICR-MS) 磷酸化蛋白质组定性与定量
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磷酸化蛋白质组学分析和定量技术的研究进展 被引量:11
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作者 隋少卉 王京兰 +1 位作者 蔡耘 钱小红 《生物化学与生物物理进展》 SCIE CAS CSCD 北大核心 2007年第3期240-245,共6页
蛋白质的磷酸化是一种可逆性的蛋白质翻译后修饰,在生物体内起着极为重要的作用.近年来蛋白质翻译后修饰日益成为蛋白质组研究的热点之一.定量磷酸化蛋白质组学方法和技术的快速发展为研究蛋白质磷酸化时空动态变化,更好地了解生物学功... 蛋白质的磷酸化是一种可逆性的蛋白质翻译后修饰,在生物体内起着极为重要的作用.近年来蛋白质翻译后修饰日益成为蛋白质组研究的热点之一.定量磷酸化蛋白质组学方法和技术的快速发展为研究蛋白质磷酸化时空动态变化,更好地了解生物学功能调节网络奠定了坚实的基础.作为蛋白质组学研究的一个重要组成部分,定量磷酸化蛋白质组学因其磷酸化蛋白质所具有的独特特征,在技术和方法研究方面将面临更为严峻的挑战.综述了磷酸化蛋白质组学定量的一些分析技术和方法的发展现状、优缺点以及未来的发展趋势. 展开更多
关键词 磷酸化蛋白质 方法 技术 定量
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不同转移潜能的肝癌细胞系定量磷酸化蛋白质组学研究 被引量:1
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作者 衣泰龙 田苗苗 +3 位作者 翟琳辉 徐忠伟 杨晓明 徐平 《安徽医科大学学报》 CAS 北大核心 2014年第11期1595-1599,共5页
目的研究具有不同侵袭转移能力的肝癌细胞系的磷酸化蛋白质组的动态变化。方法首先用含有重稳定同位素标记的精氨酸和赖氨酸的培养基对MHCC97-L进行重稳定同位素标记氨基酸的细胞培养(SILAC);用含有轻稳定同位素标记的精氨酸和赖氨酸的... 目的研究具有不同侵袭转移能力的肝癌细胞系的磷酸化蛋白质组的动态变化。方法首先用含有重稳定同位素标记的精氨酸和赖氨酸的培养基对MHCC97-L进行重稳定同位素标记氨基酸的细胞培养(SILAC);用含有轻稳定同位素标记的精氨酸和赖氨酸的培养基对MHCC97-H进行SILAC标记。将完成标记的两种肝癌细胞系的蛋白质按照1∶1混合,并用trypsin进行溶液消化;对消化得到的肽段进行除盐,并通过固相金属离子亲和色谱(IMAC)的方法进行磷酸化肽段的富集。磷酸化肽段通过质谱进行检测,并通过MaxQuant进行鉴定和定量。最后通过Z检验进行统计学分析,并对差异调控的磷酸化肽对应的蛋白质进行基因本体(GO)分析和STRING网络分析。结果最终鉴定了918个磷酸化肽段,其中806个磷酸化肽段的磷酸化位点可以定位和定量。通过Z检验,共得到了91个磷酸化修饰水平发生变化的肽段,对应25个磷酸化蛋白质。通过对这25个蛋白质进行GO分析发现,细胞骨架重塑过程中的蛋白质在MHCC97-L和MHCC97-H中磷酸化修饰形式严重失调。通过STRING分析发现,NES和PRKCA处于网络的重要节点位置。结论细胞骨架重塑这一生物学过程与肝癌侵袭转移能力密切相关;参与细胞骨架重塑的NES蛋白和参与MAPK信号通路和黏合斑信号通路的PRKCA蛋白磷酸化修饰水平的变化是影响低转移潜能MHCC97-L细胞向高转移潜能细胞MHCC97-H变化的重要调控机制。 展开更多
关键词 定量磷酸化蛋白质 SILAC 固相金属离子亲和色谱 肝细胞癌 侵袭转移
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磷酸化蛋白质组学研究技术进展 被引量:1
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作者 李丽梅 王文礼 《内蒙古医学杂志》 2006年第8期735-738,共4页
翻译后蛋白质的修饰是目前蛋白质组学研究中的一个重要课题,蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式,蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的整个过程。近年来蛋白质组学技术的发展和应用为磷酸化蛋白质的定性、... 翻译后蛋白质的修饰是目前蛋白质组学研究中的一个重要课题,蛋白质磷酸化是最常见、最重要的一种蛋白质翻译后修饰方式,蛋白质磷酸化和去磷酸化几乎调节着生命活动的整个过程。近年来蛋白质组学技术的发展和应用为磷酸化蛋白质的定性、定量和功能研究提供了必要的技术,使大规模和系统性进行磷酸化蛋白质研究成为可能。本文综述了检测和鉴定磷酸化蛋白质的蛋白质组学方法。 展开更多
关键词 磷酸化蛋白质 鉴定 定量
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宰后贮藏期间氧化磷酸化调控滩羊肉色泽稳定性的机制
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作者 王金霞 魏志宝 +4 位作者 陈雪妍 李荣 张倩 胡丽筠 罗瑞明 《食品科学》 EI CAS CSCD 北大核心 2024年第9期153-162,共10页
为阐明滩羊肉贮藏期间氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)调控色泽稳定性的机制,以6月龄滩羊背最长肌为研究对象,测定其4℃贮藏0、4、8 d时内源抗氧化物酶体系活性与活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量;采用基于同... 为阐明滩羊肉贮藏期间氧化磷酸化(oxidative phosphorylation,OXPHOS)调控色泽稳定性的机制,以6月龄滩羊背最长肌为研究对象,测定其4℃贮藏0、4、8 d时内源抗氧化物酶体系活性与活性氧(reactive oxygen species,ROS)的含量;采用基于同位素标记相对和绝对定量(isobaric tags for relative andabsolutequantitation,iTRAQ)技术的蛋白质组学研究不同贮藏时间滩羊肉中蛋白质表达情况。结果表明:贮藏0~8 d,内源抗氧化物酶系活性整体呈下降趋势(P<0.05);ROS含量随贮藏时间的延长显著上升(P<0.05);采用iTRAQ技术分析鉴定出8个差异蛋白质为影响滩羊肉色泽稳定性的核心蛋白质,分别为ATP合酶亚基α(ATP synthase F1 subunit alpha,ATP5A1)、ATP合酶亚基O(ATP synthase peripheral stalk subunit OSCP,ATP5O)、ATP合酶亚基D(ATP synthase peripheral stalk subunit D,ATP5H)、细胞色素c氧化酶亚基(cytochrome c oxidase subunit,COX)2、COX5A、琥珀酸脱氢酶复合铁硫亚基B(succinate dehydrogenase complex iron sulfur subunit B,SDHB)、ADP/ATP转位酶(ADP/ATP translocase 1,SLC25A4)和细胞色素c(cytochrome c,CYCS),这些蛋白质主要通过能量代谢过程和氧化还原过程影响滩羊肉色泽稳定性。以上结果表明宰后贮藏期间滩羊肉中抗氧化体系的失效导致ROS含量不断积累,造成肌细胞线粒体完整性受到破坏,促使OXPHOS通路上ATP5A1、ATP5O、ATP5H、COX2、COX5A、SDHB、SLC25A4和CYCS等复合物亚基表达紊乱,引起线粒体复合物结构和功能发生改变,使OXPHOS进程受到阻碍,最终影响滩羊肉色泽稳定性。 展开更多
关键词 滩羊 宰后贮藏 色泽稳定性 氧化磷酸化 蛋白质
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草莓果实不同发育时期的蛋白磷酸化水平 被引量:13
6
作者 吕晓苏 李宇轩 +4 位作者 苗英 陈良珂 沈元月 秦岭 邢宇 《中国农业科学》 CAS CSCD 北大核心 2016年第10期1946-1959,共14页
【目的】通过分析草莓果实生长发育过程中蛋白磷酸化水平的变化以期揭示蛋白磷酸化在果实生长发育成熟衰老过程中的作用。【方法】以iTraq(isobaric tags for relative and absolute quantification)定量蛋白质组学结合LC-MS/MS(liquid ... 【目的】通过分析草莓果实生长发育过程中蛋白磷酸化水平的变化以期揭示蛋白磷酸化在果实生长发育成熟衰老过程中的作用。【方法】以iTraq(isobaric tags for relative and absolute quantification)定量蛋白质组学结合LC-MS/MS(liquid chromatography-mass spectrometry)的方法对草莓果实的5个不同发育时期(小绿果时期、大绿果时期、白果时期、果实成熟期、果实成熟后期)的蛋白磷酸化水平进行综合分析,并对这些鉴定到的磷酸化蛋白进行生物过程分类、亚细胞定位分类和分子功能分类。通过综合分析多个数据库的比对结果,对所鉴定的磷酸化蛋白进行功能的预测。【结果】不同发育时期的磷酸化蛋白有所差异,并且在大绿果时期到果实成熟期磷酸化差异蛋白总数比其他时期显著增加,其中,多数的磷酸化蛋白参与生长发育调控。生物过程分类结果显示,这些磷酸化蛋白多数集中在植物信号转导途径和糖代谢途径中,其中,参与信号转导途径的有17个,参与糖代谢生物过程的有8个。属于MAPK级联途径的有MAPKKK家族的101308592、MAPK家族的470122684和596127083。596127083的磷酸化水平在各个发育时期较为稳定,101308592随发育时期磷酸化水平逐渐升高,而470122684的磷酸化水平从软果期开始急剧下降。亚细胞定位分类结果显示,多数磷酸化蛋白定位在细胞核和细胞质中。分子功能分类结果显示,多数磷酸化蛋白具有转录调节和磷酸化去磷酸化的分子功能,鉴定出与生长发育调节相关的磷酸化蛋白有24个。其中,具有转录调控功能的有4个,参与细胞分裂的有6个,还有一部分磷酸化蛋白与调控生长发育的激素的响应有关,除此之外,还鉴定到3个与果实的成熟软化相关的磷酸化蛋白。另外,一部分蛋白有多种磷酸化修饰方式,其中,SNF1相关蛋白激酶β亚基有3种磷酸化修饰,且其磷酸化水平各不相同。【结论】同种蛋白可能同时存在不止一种磷酸化修饰方式。不同的磷酸化修饰方式的作用不尽相同。不同的时期占主导地位的修饰方式也不尽相同。磷酸化蛋白不仅参与转录调节和细胞分裂分化,还参与果实发育过程中对植物激素的响应和糖的代谢积累,甚至参与果实成熟软化的调节。另外,101308592和470122684可能参与果实生长发育的调控。总之,蛋白磷酸化修饰在草莓果实生长发育过程中起重要的调控作用。 展开更多
关键词 草莓 果实发育 iTraq标记定量蛋白质 蛋白磷酸化 发育调控
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磷酸化蛋白质组学的新进展及其在肝脏生理和病理机制中的应用 被引量:6
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作者 衣泰龙 田苗苗 +1 位作者 杨晓明 徐平 《生物工程学报》 CAS CSCD 北大核心 2014年第7期1004-1017,共14页
蛋白质磷酸化是最常见的蛋白质翻译后修饰形式。由于蛋白质的磷酸化形式可以被磷酸酶和磷酸激酶进行可逆的调控,所以在众多的生命活动过程中蛋白质的磷酸化修饰起着重要的调控作用,因此对生物体内蛋白质磷酸化修饰的系统研究对于揭示生... 蛋白质磷酸化是最常见的蛋白质翻译后修饰形式。由于蛋白质的磷酸化形式可以被磷酸酶和磷酸激酶进行可逆的调控,所以在众多的生命活动过程中蛋白质的磷酸化修饰起着重要的调控作用,因此对生物体内蛋白质磷酸化修饰的系统研究对于揭示生命科学的奥秘显得十分重要。近年来,随着质谱技术和生物信息学软件以及磷酸化肽段富集方法的发展,利用质谱对生物体内蛋白质磷酸化修饰研究的技术逐渐成熟。肝脏作为人体最重要的代谢和免疫器官,深入研究肝脏细胞内蛋白质磷酸化修饰形式对于理解其功能具有重要指导意义。目前,迅速发展的磷酸化蛋白质组学技术已经被广泛应用到肝脏功能的生物学研究中。这些研究加深了人们对肝脏的生理及病理状态的分子生物学机制的了解。本文综述了当前磷酸化蛋白质组学的研究进展和磷酸化蛋白质组学在肝脏中的研究。 展开更多
关键词 蛋白质磷酸化 肝脏磷酸化蛋白质 磷酸化肽富集 定量蛋白质 生物信息学
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定量蛋白质组学分析PknG在分枝杆菌中的功能 被引量:3
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作者 陈宇凌 江晓勇 +3 位作者 杨帆 王清涛 米凯霞 邓海腾 《中国科学:生命科学》 CSCD 北大核心 2014年第10期1051-1060,共10页
丝氨酸苏氨酸蛋白激酶G(PknG)是分枝杆菌中一个类似于真核生物蛋白激酶C的蛋白质,对结核分枝杆菌的生长和新陈代谢等生理过程,以及结核分枝杆菌的耐药和在宿主细胞中的存活都起着重要的调节作用.本文在耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegm... 丝氨酸苏氨酸蛋白激酶G(PknG)是分枝杆菌中一个类似于真核生物蛋白激酶C的蛋白质,对结核分枝杆菌的生长和新陈代谢等生理过程,以及结核分枝杆菌的耐药和在宿主细胞中的存活都起着重要的调节作用.本文在耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)mc2155中构建了过表达结核分枝杆菌PknG的重组菌株PknG-mc2155,并发现PknG-mc2155的生长速度慢于mc2155.应用化学修饰结合LC-LC-MS/MS的定量蛋白质组学方法,在mc2155和PknG-mc2155中鉴定到了176种有差异表达的蛋白,其中152种蛋白在PknG-mc2155中表达下调,24种蛋白表达上调.这些差异表达的蛋白参与了多个细胞过程,包括代谢、蛋白翻译等.基于这些结果,我们推测PknG-mc2155生长速度慢的原因是因为代谢相关酶如GlpK,ALD和DesA1等蛋白表达的下调;而Ag85A,Ag85C,SecA2等蛋白的上调则增强细菌的感染性;另外KatG蛋白的下调提示PknG的过表达增强了菌株的抗药性.代谢组学分析发现谷氨酸和谷氨酰胺在PknG-mc2155中的水平低于在mc2155中水平,证实了PknG影响谷氨酰胺的稳态平衡.利用蛋白质磷酸化分析,我们发现PknG的苏氨酸残基T-320上有一个自磷酸化修饰,而且在PknG-mc2155菌株中,也鉴定到gltA和glmM上的磷酸化修饰,显示gltA和glmM是PknG的底物.本研究为理解PknG的功能和作用机制提供了新的依据和解释,为深入研究PknG在结核分枝杆菌中的功能奠定了基础,我们的结果也表明蛋白质组学技术是系统研究细菌蛋白质功能的重要工具. 展开更多
关键词 丝氨酸苏氨酸蛋白激酶G 分枝杆菌 蛋白磷酸化修饰 定量蛋白质
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植物标记和非标记定量蛋白质组学技术 被引量:2
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作者 高丰衣 张文娜 +2 位作者 许会敏 梁馨琳 陈艳梅 《科学通报》 EI CAS CSCD 北大核心 2021年第31期3952-3964,共13页
蛋白质是细胞中重要的有机大分子,是生命活动的主要执行者.植物在受到外界信号干扰时其主要反应是通过调节细胞内蛋白质的合成和降解来恢复稳态.因而,蛋白质的定量分析有助于人们更深入地揭示植物细胞中蛋白质的动态变化及其分子功能.... 蛋白质是细胞中重要的有机大分子,是生命活动的主要执行者.植物在受到外界信号干扰时其主要反应是通过调节细胞内蛋白质的合成和降解来恢复稳态.因而,蛋白质的定量分析有助于人们更深入地揭示植物细胞中蛋白质的动态变化及其分子功能.随着高分辨质谱技术的发展,使用质谱方法对蛋白质进行高通量定量和定性分析的蛋白质组学技术已经成为研究蛋白质功能的重要分析手段,同时也是植物生物学研究领域的热点之一.结合本课题组取得的研究成果,本文总结和概述了植物蛋白质组学定量方法的最新进展,包括非标记定量和稳定同位素标记分析方法,比较不同方法在蛋白定量的精确度、蛋白组覆盖率和稳定性等方面的优缺点,分析其在植物生物学研究中的应用范围,并对这方面的研究热点进行展望. 展开更多
关键词 蛋白质 蛋白磷酸化 非标记 定性同位素标记 细胞膜
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深度覆盖的蛋白质组分析新方法及关键技术研究
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作者 张丽华 叶明亮 +1 位作者 梁振 张玉奎 《中国基础科学》 2019年第6期49-53,共5页
蛋白质作为生命活动的执行者,其种类和含量的变化在调控生命过程中发挥着至关重要的作用。如何实现深度覆盖的蛋白质组定性定量分析已成为当前蛋白质科学及其相关领域亟需解决的关键问题之一。中国科学院大连化学物理研究所蛋白质组分... 蛋白质作为生命活动的执行者,其种类和含量的变化在调控生命过程中发挥着至关重要的作用。如何实现深度覆盖的蛋白质组定性定量分析已成为当前蛋白质科学及其相关领域亟需解决的关键问题之一。中国科学院大连化学物理研究所蛋白质组分析新方法研究团队,在科技部重大研究计划、重点研发计划等项目的支持下,针对目前规模化蛋白质分析中存在的精准度和覆盖度有待提高的关键科学问题,以色谱-质谱为核心,发展了高效样品制备新方法、高通量分析新技术和精准定量新方法,取得了一系列创新性成果,显著提高了蛋白质组分析的精准度、覆盖率和分析通量,为我国蛋白质科学研究的深入发展,为推动生物医药、国家安全和人口健康等领域的不断进步提供了重要的技术支撑。 展开更多
关键词 蛋白质 定性定量 色谱-质谱联用 深度覆盖分析
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