人巨细胞病毒磷蛋白65及糖蛋白B在大肠杆菌中的高效表达、免疫原性研究及初步应用

实验成功的构建了含有pp65与gB主要抗原决定簇基因的表达质粒pET-pp65、pET-gB;表达产物通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、免疫印迹、间接酶联免疫等一系列鉴定试验进行了分析。表达蛋白经初步纯化后免疫BALB/c小鼠,经0、2、4周免疫三次,免疫后2、4、6周眼眶采血收集抗血清,进行中和试验和ELISA检测。动物试验表明两种表达蛋白具有免疫原性,并可在小鼠体内诱导产生特异性抗体,其中用重组gB蛋白免疫小鼠后得到的抗血清在体外试验中能抑制天然病毒感染细胞。同时将这两种表达蛋白作为诊断用抗原,对临床94份血清进行检测,证实pp65具有较好的特异性,为今后研制HCMV诊断试剂提供了科学依据。

人巨细胞病毒蛋白pp65在胶质瘤中的表达及意义

目的探讨人巨细胞病毒(HCMV)蛋白pp65在胶质瘤中的表达水平及其意义。方法采用免疫组化方法检测HCMV蛋白pp65在175例人脑胶质瘤组织及10例正常人脑组织中的表达,分析其表达水平与胶质瘤临床病理学特征的关系。结果 pp65蛋白在胶质瘤组织中的表达水平明显高于正常人脑组织(Z=-4.338,P=0.000);pp65蛋白在高恶性度胶质瘤中的免疫染色强度明显强于低恶性度胶质瘤(Z=-0.960,P=0.037),而pp65蛋白免疫染色强度与胶质瘤的病理级别无明显的相关性(r=0.096,P=0.208),以及pp65蛋白免疫染色强度与胶质瘤患者的性别(r=0.138,P=0.069)、年龄(r=0.016,P=0.837)和肿瘤部位(r=-0.147,P=0.052)也均无明显相关性。结论HCMV感染及其蛋白pp65表达可能与人脑胶质瘤的发生存在一定关系,但其确切的致瘤机制尚需进一步研究。

柴胡皂苷体内外抗鸡柔嫩艾美耳球虫的研究

为了探究柴胡皂苷对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)体内外感染的影响,本实验采用CCK-8法检测2倍倍比稀释(0.384 g/L~0.0645 g/L)的柴胡皂苷对MDBK细胞活力的影响,结果显示,浓度为0.0645 g/L的柴胡皂苷对MDBK细胞的活力影响最小,并且可以促进细胞的生长,因此以该浓度的柴胡皂苷进行后续试验。本研究设置阴性对照组(NC)、E.tenella感染组(PC)、磺胺嘧啶钠对照组(WM)以及柴胡皂苷治疗组(CA)。除NC组外,每组细胞加入1.6×10^(6)个E.tenella子孢子,4 h后WM组加入0.5 g/L磺胺嘧啶钠,CA组加入0.0645 g/L柴胡皂苷,继续培养至不同时间,分别提取4组细胞蛋白,通过western blot检测感染E.tenella的MDBK细胞中p65蛋白的磷酸化水平;采用荧光定量PCR(qPCR)检测4组细胞中炎症因子的转录水平。Western blot结果显示,培养至24 h时,4组细胞中p65蛋白磷酸化水平均无显著差异;感染48 h与72 h时,与WM和PC组相比,CA组细胞中p65蛋白磷酸化水平极显著降低(P<0.001),但与NC组之间无显著差异(培养48 h)和极显著高于NC组(P<0.001,培养72 h)。qPCR结果显示,培养24 h和48 h,各组细胞中各细胞因子的相对转录水平虽有不同,但在培养72 h时,与PC组和WM组相比,CA组MDBK细胞中促炎因子IL-1β、IL-8、TNF-αmRNA的转录水平极显著降低(P<0.001);24 h时,CA组细胞中抑炎因子IL-10 mRNA的转录水平极显著低于WM组(P<0.0001),但在48 h和72 h时,IL-10 mRNA的转录水平逐渐升高,并极显著高于其他3组(P<0.0001)。将13日龄白羽肉鸡设为上述4个组。除NC组外,每组雏鸡均口服感染2×10^(4)个E.tenella孢子化卵囊。感染后2 d,CA组雏鸡口服0.0645 g/L柴胡皂苷,1 mL/只,WM组雏鸡口服0.5 g/L磺胺嘧啶,1 mL/只,共服用7 d。感染后4 d~8 d,采用血球计数板计算每组鸡粪便卵囊排出率。感染后8 d将各组鸡称重后剖杀,观察盲肠的剖检病变,并通过计算各组肉鸡的相对增重率、存活率、卵囊值以及盲肠病变值计算每组雏鸡的抗球虫指数(ACI);分别于感染后4 d、6 d和8 d分别剖杀10只鸡,取盲肠组织制备病理切片,观察各组鸡盲肠组织的病变。结果显示,CA组鸡粪便卵囊排出率为22.00%,极显著低于PC组(P<0.0001),极显著高于WM组(P<0.0001);ACI为173.13,极显著高于PC组和WM组(P<0.0001),达到中效抗球虫水平;剖检病变观察可见PC组雏鸡的盲肠肠壁变薄,长度变短,高度肿胀,而CA组鸡盲肠肠壁逐渐恢复正常形态,与WM组雏鸡盲肠改善结果接近;组织病变可见,与PC组和WM组相比,CA组盲肠无炎性细胞浸润且肠绒毛肠壁形态完整,未观察到E.tenella裂殖子。以上结果首次证实柴胡皂苷在体内外均可有效抑制E.tenella对细胞的感染,并且能够改善与修复E.tenella对雏鸡盲肠的损伤,本研究为天然中药成分用于治疗E.tenella的感染提供参考依据。

人巨细胞病毒感染在颅咽管瘤中的表达及意义

目的检测人巨细胞病毒(HCMV)感染在颅咽管瘤组织中的表达,探讨HCMV感染与颅咽管瘤发生的病因学关系。方法采用免疫组化方法检测HCMV立刻早期蛋白1-72(IE1-72)和磷酸化糖蛋白65(pp65)抗原在89例颅咽管瘤组织及10例正常脑组织中的表达情况。结果在颅咽管瘤组织中HCMV IE1-72和pp65抗原表达阳性率分别为77.5%和84.3%,而在正常脑组织中两抗原均为阴性,IE1-72和pp65抗原表达阳性率在颅咽管瘤组织和正常脑组织间均有显著性差异(P=0.000,P=0.000)。IE1-72抗原在牙釉质型和鳞状乳头型颅咽管瘤组织中阳性率分别为83.6%和67.6%,pp65抗原分别为89.1%和76.5%;两抗原在牙釉质型颅咽管瘤组织中的阳性率均略高于鳞状乳头型,但均无统计学差异(P=0.135,P=0.197)。结论 HCMV IE1-72和pp65抗原在颅咽管瘤组织中均有高表达,而在正常脑组织中无表达,HCMV感染及其抗原表达可能与颅咽管瘤的发生有一定关系,其致病机制尚需进一步研究。

抗纤灵方对5/6肾切除小鼠p38MAPK/NF-κBp65介导的炎症因子的影响

目的观察抗纤灵方对慢性肾衰模型小鼠酪氨酸磷酸化蛋白激酶/核转录因子p65(p38MAPK/NF-κBp65)介导的炎症因子的影响。方法 56只C57BL/6J雄性小鼠,随机选取10只作为假手术组,余46只采用5/6肾切除制备慢性肾衰模型,2周后将造模成功的33只小鼠按照肌酐水平分层分为模型组、雷帕霉素组及抗纤灵方组,每组11只。雷帕霉素、抗纤灵方组每日分别给予雷帕霉素(0.13 mg/100 g)及抗纤灵方组(2 g/100 g)各0.5 m L灌胃治疗,模型组及假手术组灌胃等量蒸馏水,连续用药8周后处死小鼠,采用免疫组化法观察中性粒细胞表达水平;应用免疫印迹法(Western blot)及real-time PCR法检测肾脏组织p38MAPK、NF-κBp65蛋白及TNF-α、IL-6 mRNA表达水平。结果与假手术组比较,模型组中性粒细胞阳性细胞数增多,p38MAPK、NF-κBp65蛋白及TNF-α、IL-6 mRNA表达水平增高(P<0.05,P<0.01);与模型组比较,雷帕霉素及抗纤灵方组中性粒细胞阳性细胞数减少,p38MAPK、NF-κBp65蛋白及TNF-α、IL-6 mRNA表达水平降低(P<0.05,P<0.01)。雷帕霉素除在降低p38MAPK蛋白表达方面优于抗纤灵方组(P<0.05)外,余指标比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论抗纤灵方参与p38MAPK/NF-κBp65介导的炎症因子的调控,对肾纤维化所致的肾衰有一定的改善作用。

清肾颗粒对慢性肾功能衰竭湿热证患者NF-κB信号通路的干预作用

目的观察清肾颗粒对慢性肾功能衰竭(chronic renal failure,CRF)湿热证患者核转录因子(NF-κB)信号转导通路中NF-κB p65、磷酸化NF-κB抑制蛋白(p-IκBα)表达的影响,探讨清肾颗粒治疗CRF患者的作用机制。方法 68例CRF湿热证患者,按随机数字表法分为对照组和治疗组,每组34例,实际完成63例,治疗组32例,对照组31例,并设正常组20名。治疗组与对照组均给予西医基础治疗及中药保留灌肠,治疗组加服清肾颗粒,每日3次,每次1袋,疗程均为8周。观察患者临床疗效、治疗前后血肌酐(SCr)、肾小球滤过率估算值(e GFR)以及外周血中NF-κB p65、p-IκBα的水平变化及其与正常组比较。结果治疗组临床疗效和中医证候疗效总有效率为84.38%(27/32)和81.25%(26/32),优于对照组的54.84%(17/31)和51.61%(16/31),差异有统计学意义(P<0.01)。与本组治疗前比较,治疗后治疗组SCr水平明显下降(P<0.01),e GFR水平明显升高(P<0.01),且优于对照组同期(P<0.05)。与正常组比较,治疗组和对照组治疗前NF-κB p65、p-IκBα水平升高(P<0.01);与本组治疗前比较,治疗后治疗组NF-κB p65、p-IκBα水平均明显降低(P<0.01),且均优于对照组同期(P<0.01)。结论清肾颗粒能改善CRF湿热证患者的临床症状,降低SCr、升高e GFR水平,具有保护肾功能的作用,其作用机制可能与降低外周血中NF-κB p65、p-IκBα水平有关。